核桃殼中酚酸的提取及含量測定

劉麗金，周萍

（大理大學藥學與化學學院，云南大理671000）

核桃殼中酚酸的提取及含量測定

劉麗金，周萍*

（大理大學藥學與化學學院，云南大理671000）

采用單因素試驗和正交設計對回流提取核桃殼中酚酸的工藝進行優化，以酚酸提取率為參考指標，考察乙醇濃度、提取溫度、提取時間、料液比對酚酸提取率的影響并采用普魯士蘭法測定不同產地核桃殼樣品中酚酸含量。結果表明，核桃殼中酚酸的最佳提取工藝條件為：30%乙醇，提取溫度80℃，提取時間60min，料液比為1∶21（g/mL）；不同產地核桃殼樣品中酚酸含量存在差異，核桃殼樣品中酚酸平均含量為0.679%。

核桃殼；酚酸；提?。缓繙y定

Abstract：To optimize the extraction process of phenolic acids from Walnut shell，ethanol concentration，extracting temperature，extracting time，solid-liquid ratio were determinated by the single-factor experiment and orthogonal design，using the extracte rate of phenolic acids as index.Results showed that he optimum conditions were ethanol concentration 30%，extraction temperature 80℃，extraction time 60 min，solid-liquid ratio 1∶21（g/mL）.The contents of phenolic acids in Walnut shell.from different sources were different.And the average content of phenolic acids was 0.679%.

Key words：Walnut shell；phenolic acid；extraction；content determination

核桃（JugLans regia L.）又名胡桃，素有“長壽之果”、“健腦之果”、“美容之果”的美稱[1]。核桃殼是核桃取仁后的外殼，民間可用于治療口腔潰瘍[2]、胃潰瘍[3]?，F代研究發現核桃殼中含有酚酸類[4]、黃酮類[5]、苷類等多種活性物質，具有抗氧化[6-7]、抗菌[8]、降脂、抗腫瘤[9-10]等藥理活性。目前關于核桃殼研究的報道，主要涉及核桃殼中的化學成分研究[11-13]、糖類的含量測定[14-15]、黃酮提取[16-17]、棕色素研究[18-19]和活性炭制備[20]等方面，有關核桃殼中酚酸類物質的研究報道較少。酚酸類物質具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、減肥、護肝、提高免疫力、改善情緒、抗炎、抗病毒和保護心血管等多種生物活性[21]，具有較高的研究價值。本試驗采用加熱回流提取的方法，優化核桃殼中酚酸的提取工藝，測定并比較不同產地核桃殼中酚酸含量，以期為核桃廢棄資源的合理開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

核桃殼：采自云南省大理州，核桃取仁后自然風干，經鑒定為胡桃科核桃屬植物核桃（JugLans regia L．）的殼，粉碎過60目篩，根據來源不同依次編號為1#～16#。

沒食子酸對照品（批號MUST-13040103，純度＞98%）：成都曼思特生物科技有限公司；無水乙醇、濃鹽酸、十二烷基硫酸鈉、三氯化鐵、鐵氰化鉀等均為分析純。

TU-1901雙光束紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；UV-5500紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；FA2004N電子天平：上海精密科學儀器有限公司；DZKW-4雙孔電子恒溫水浴鍋：上?？莆鰧嶒瀮x器廠；SB-25-12DT超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

沒食子酸對照品溶液：精密稱取干燥至恒重的沒食子酸對照品適量，加蒸餾水溶解制成濃度為2.56 mg/mL的沒食子酸對照品儲備液。取1 mL沒食子酸對照品儲備液至100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，即得濃度為0.025 6 mg/mL的沒食子酸對照品溶液。

樣品溶液：精密稱取樣品約0.5 g，按料液比為1∶21（g/mL）加入 30%乙醇，80℃回流提取 60 min，過濾，濾液轉移至100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即得。

1.2.2 最大吸收波長的選擇

精密移取酚酸樣品溶液1.0 mL和沒食子酸對照品溶液1.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加無水乙醇5.0 mL；0.3%十二烷基硫酸鈉溶液2.0 mL，0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）4]溶液 1.0 mL，暗處放置 20 min 后用0.1 mol/L的鹽酸溶液定容至刻度。以相應顯色劑為空白，于500 nm～900 nm波長范圍內掃描，結果顯示，沒食子酸對照品溶液和酚酸樣品溶液均在729 nm波長處有最大吸收，所以選擇729 nm為測定波長。

1.2.3 最佳顯色條件的確定

1.2.3.1 無水乙醇用量的考察

精密移取沒食子酸對照品溶液0.5 mL于25 mL容量瓶中，平行7份，分別加入無水乙醇1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL后，依次加入0.3%十二烷基硫酸鈉溶液 2.0 mL，0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）4]溶液1.0 mL，暗處放置20 min后用0.1 mol/L的鹽酸溶液定容至刻度，以相應顯色劑為空白，于729 nm波長處測吸光度。

1.2.3.2 0.3%十二烷基硫酸鈉溶液用量的考察

精密移取沒食子酸對照品溶液0.5 mL于25 mL容量瓶中，平行6份，加入無水乙醇5.0 mL后，分別加入 0.3%十二烷基硫酸鈉溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）4]溶液 1.0 mL，暗處放置20 min后用0.1 mol/L的鹽酸溶液定容至刻度，以相應顯色劑為空白，于729 nm波長處測吸光度。

1.2.3.3 0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）4]混合溶液用量的考察

精密移取沒食子酸對照品溶液0.5 mL于25 mL容量瓶中，平行6份，加入無水乙醇5.0 mL，0.3%十二烷基硫酸鈉溶液1.5 mL后，分別加入0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）4]混合溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，暗處放置20 min后用0.1 mol/L的鹽酸溶液定容至刻度，以相應顯色劑為空白，于729 nm波長處測吸光度。

1.2.3.4 暗處放置時間考察

精密移取沒食子酸對照品溶液0.5 mL于25 mL容量瓶中，平行7份，加入無水乙醇5.0 mL，0.3%十二烷基硫酸鈉溶液 1.5 mL，0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）4]混合溶液 2.0 mL，分別在暗處放置 0、10、20、30、40、50、60 min，用0.1 mol/L的鹽酸溶液定容至刻度，以相應顯色劑為空白，于729 nm波長處測吸光度。

1.2.4 酚酸提取單因素試驗

1.2.4.1 乙醇濃度對酚酸提取率的影響

精密稱取1#樣品6份，每份約0.5 g，分別加入20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液30.0 mL，70℃加熱回流40 min，過濾，濾液用蒸餾水定容至100 mL，每份精密移取0.3 mL按“1.2.3”確定的最佳顯色條件顯色，于729 nm波長處測吸光度，計算酚酸提取率。

1.2.4.2 提取溫度對酚酸提取率的影響

精密稱取1#樣品6份，每份約0.5 g，加入40%乙醇 30.0 mL，分別于 40、50、60、70、80、90 ℃加熱回流40 min，過濾，濾液用蒸餾水定容至100 mL，每份精密移取0.3 mL按“1.2.3”確定的最佳顯色條件顯色，于729 nm波長測定吸光度，計算酚酸提取率。

1.2.4.3 提取時間對酚酸提取率的影響

精密稱取1#樣品6份，每份約0.5 g，加入40%乙醇 30.0 mL，分別于 80 ℃加熱回流 30、40、50、60、70 min后過濾，濾液用蒸餾水定容至100 mL，每份精密移取0.3 mL按“1.2.3”確定的最佳顯色條件顯色，于729 nm波長測定吸光度，計算酚酸提取率。

1.2.4.4 料液比對酚酸提取率的影響

精密稱取1#樣品8份，每份約0.5 g，分別按照料液比為 1∶3、1∶6、1∶9、1∶12、1∶15、1∶18、1∶21、1∶24（g/mL）加入 40%乙醇，80℃加熱回流 50 min后過濾，濾液用蒸餾水定容至100 mL，每份精密移取0.3 mL按“1.2.3”確定的最佳顯色條件顯色，于729 nm波長測定吸光度，計算酚酸提取率。

1.2.5 酚酸提取正交試驗

結合單因素試驗結果，以乙醇濃度、提取時間、提取溫度、料液比為影響因素，分別選3個水平進行正交試驗，以酚酸提取率為指標，確定酚酸提取的最佳工藝條件。

1.2.6 方法學考察

1.2.6.1 標準曲線的繪制

精密移取沒食子酸對照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置25 mL容量瓶中，按“1.2.3”確定的最佳顯色條件顯色，于729 nm波長下測吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標，質量濃度（C）為橫坐標，進行線性回歸分析。

1.2.6.2 儀器精密度試驗

精密移取沒食子酸對照品溶液0.5 mL，按“1.2.3”確定的最佳顯色條件顯色，于729 nm波長處測定吸光度，連續測6次，計算RSD值。

1.2.6.3 重復性試驗

精密稱取1#樣品6份，每份約0.5 g，按“1.2.1”項下方法制備樣品溶液，按“1.2.3”確定的最佳顯色條件顯色，在729 nm波長下測定吸光度，計算樣品中酚酸含量，計算RSD值。

1.2.6.4 加樣回收率試驗

精密稱取已知酚酸含量（1.328%）的1#樣品9份，每份約0.5 g，分別按照對照品加入量與所取供試品中被測物質含量之比約為 0.5∶1、1∶1、1.5∶1加入適量沒食子酸對照品，按“1.2.1”項下方法制備樣品溶液，按“1.2.3”確定的最佳顯色條件顯色，于729 nm處測定吸光度，計算回收率。

1.2.7 不同核桃殼樣品中酚酸含量比較

精密稱取1#～16#核桃殼粉末各3份，每份約0.5g，按“1.2.1”項下方法制備樣品溶液，按“1.2.3”確定的最佳顯色條件顯色，于729 nm波長下測定吸光度，計算酚酸含量。

2 結果與分析

2.1 最佳顯色條件結果與分析

2.1.1 無水乙醇的用量的考察

無水乙醇用量考察結果見表1。

表1 無水乙醇用量考察結果Table 1 Investigation results of anhydrous alcohol dosage

由表1可知，無水乙醇加入量為5.0 mL時吸光度最大，確定無水乙醇的用量為5.0 mL。

2.1.2 0.3%十二烷基硫酸鈉溶液用量的考察

0.3%十二烷基硫酸鈉溶液用量結果見表2。

由表2可知，0.3%十二烷基硫酸鈉溶液加入量為1.5 mL時吸光度最大，確定0.3%十二烷基硫酸鈉溶液的用量為1.5 mL。

表2 0.3%十二烷基硫酸鈉溶液用量的考察結果Table 2 Investigation results of the dosage of 0.3%dodecyl sodium dodecyl sulfate

2.1.3 0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）4]混合溶液用量的考察

0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）4]混合溶液用量結果見表3。

表3 0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）4]混合溶液用量的考察結果Table 3 Investigation results of the dosage of 0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）4]mixed solution

由表3可知，混合溶液用量為2.0 mL時吸光度最大。確定0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）4]混合溶液用量為2.0 mL。

2.1.4 暗處放置時間考察

暗處放置時間考察結果見表4。

表4 暗處放置時間考察結果Table 4 Investigation results of the dark time

由表4可知，放置時間為50 min時吸光度最大，確定暗處放置時間為50 min。

綜上得最佳顯色條件為：無水乙醇5.0 mL，0.3%十二烷基硫酸鈉溶液1.5mL，0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）4]混合溶液2.0 mL，暗處放置時間50 min。

2.2 酚酸提取單因素試驗結果與分析

2.2.1 乙醇濃度對酚酸提取率的影響

乙醇濃度對酚酸提取率的影響見圖1。

圖1 乙醇濃度對酚酸提取率的影響Fig.1 Effection of ethanol concentration on the extraction of phenolic acids

結果表明，酚酸提取率隨著乙醇濃度的提高呈現先增后降的趨勢，乙醇濃度為40%時提取率最大。

2.2.2 提取溫度對酚酸提取率的影響

提取溫度對酚酸提取率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對酚酸提取率的影響Fig.2 Effection of extraction temperature on the extraction of phenolic acids

結果表明，溫度為80℃時酚酸的提取率最大。

2.2.3 提取時間對酚酸提取率的影響

提取時間對酚酸提取率的影響見圖3。

圖3 提取時間對酚酸提取率的影響Fig.3 Effection of extraction time on the extraction of phenolic acids

結果表明，酚酸提取率隨提取時間的增加呈現先增加后降低的趨勢，提取時間為50 min時，酚酸的提取率最大。

2.2.4 料液比對酚酸提取率的影響

料液比對酚酸提取率的影響見圖4。

結果表明，料液比為1∶18（g/mL）時，酚酸提取率最高。

圖4 料液比對酚酸提取率的影響Fig.4 Effection of solid-liquid ratio on the extraction of phenolic acids

2.3 酚酸提取正交試驗結果與分析

2.3.1 正交試驗因素及水平

在單因素試驗的基礎上，選擇提取溫度（A）、乙醇濃度（B）、提取時間（C）、料液比（D）為研究對象，采用四因素三水平正交試驗研究酚酸在不同條件下的提取率。正交試驗設計的因素和水平見表5。

表5 正交試驗因素水平Table 5 Orthogonal experiment factor levels

2.3.2 正交試驗結果與分析

對提取溫度（A）、乙醇濃度（B）、提取時間（C）、料液比（D）進行正交試驗，結果見表6。

表6 正交試驗結果及分析Table 6 Results and analysis of orthogonal test

結果表明所選4個因素對酚酸提取率大小影響順序為：提取溫度（A）＞乙醇濃度（B）＞料液比（D）＞提取時間（C）。核桃殼中酚酸的最佳提取工藝為A2B1C3D3；即提取溫度為80℃，乙醇濃度為30%，提取時間為60 min，料液比為 1∶21（g/mL）。本試驗采用加熱回流提取的方法，該法操作簡單，有良好的穩定性和重復性。

2.3.3 最佳工藝條件的驗證

按照上述優選工藝條件即提取溫度為80℃，乙醇濃度為30%，提取時間為60 min，料液比為1∶21（g/mL）對1#樣品分別進行3次驗證，結果顯示：在最佳提取條件下，酚酸提取率平均值為1.327%，RSD值為1.23%，酚酸提取率均高于正交試驗數據，說明正交試驗結果可靠，優選出的工藝可行，該方法的重現性好。

2.4 方法學考察結果與分析

2.4.1 標準曲線的繪制

以吸光度（Y）為縱坐標，質量濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=1.102X+0.002，相關系數r=0.999 3；沒食子酸溶液在0.204 8 μg/mL～1.024 μg/mL范圍內呈現良好的線性關系。

2.4.2 儀器精密度試驗

儀器精密度的RSD值為0.22%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗

測得核桃殼中酚酸平均含量為1.328%，RSD為2.8%，表明該方法的重復性良好。

2.4.4 加樣回收率試驗

加樣回收率試驗結果見表7。

表7 加樣回收率試驗結果Table 7 Test results of sample recovery

2.5 不同產地核桃殼樣品中酚酸含量

不同核桃殼樣品中酚酸含量見表8。

由表8中試驗結果可知，不同產地核桃殼樣品中酚酸含量不同，其中漾濞縣蒼山西鎮沙河村含量最高，下關鎮太邑彝族鄉江西橋最低；樣品中酚酸平均含量為0.679%。

表8 不同產地核桃殼樣品中酚酸含量Table 8 Content of phenolic acids in walnut shell samples from different habitats

3 結論與討論

本試驗采用加熱回流提取法提取核桃殼中酚酸，經單因素及正交試驗設計得出核桃殼中酚酸的最佳提取工藝為：提取溫度為80℃，乙醇濃度為30%，提取時間為 60 min，料液比為 1∶21（g/mL）。

不同來源的核桃殼樣品中酚酸平均含量為0.679%，其中漾濞縣沙河村的含量較高，為1.328%。不同產地核桃殼中酚酸含量不同，可能受核桃品種、海拔、氣候、土壤等因素的影響，具體原因有待進一步考察研究。

預試驗分別考察冷浸、超聲、回流不同提取方法對酚酸提取率的影響，結果顯示采用回流提取時酚酸提取率最大，故將提取方法確定為回流提取。此外，根據酚酸的溶解性和極性，可選擇不同溶劑進行提取，本試驗前期分別以水、50%乙醇和50%甲醇為溶劑考察了溶劑對酚酸提取的影響，結果顯示以50%乙醇為溶劑時酚酸提取率較大，故確定乙醇為提取溶劑，并考察不同乙醇濃度對酚酸提取率的影響。

酚酸含量測定常用的方法有Folin-酚法[22]和普魯士蘭法[23]。其中普魯士蘭法為較經典的顯色方法，該法采用十二烷基硫酸鈉-FeCl3-K3[Fe（CN）4]-HCl系統進行顯色，具有操作簡便、快速、經濟、重現性好等優點；且該法加入試劑后立即形成深淺不同的顏色，容易辨別[24]，故本試驗選用普魯士蘭法顯色。不同文獻報道普魯士蘭法顯色劑用量不同，故試驗前期先優化顯色條件，確定顯色劑用量；試驗確定最佳顯色條件為：無水乙醇5.0 mL，0.3%十二烷基硫酸鈉溶液1.5 mL，0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）4]混合溶液 2.0 mL，暗處放置時間50 min。測定核桃殼中酚酸的含量時，顯色劑配制后，放置時間和顯色時間對吸光度影響較大。故應嚴格控制反應條件，顯色試劑應現配現用，各樣品測定時平行操作。

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Extraction and Content Determination of Phenolic Acids from Walnut Shell

LIU Li-jin，ZHOU Ping*
（Department of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali 671000，Yunnan，China）

2017-02-20

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.011

劉麗金（1992—），女（漢），碩士研究生，研究方向：藥物分析。

*通信作者：周萍（1972—），女（漢），教授，碩士生導師