酶法降解米糠中植酸的工藝研究

胡彬，柴程，戰虎

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

酶法降解米糠中植酸的工藝研究

胡彬，柴程，戰虎

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

通過酶法降解米糠中植酸，植酸酶能將植酸及其二價鹽類菲丁水解生成肌醇。以酶用量、酶解時間、pH值、酶解溫度為影響因素，以代謝產物肌醇含量為判定依據進行單因素試驗及正交試驗以得出較優組合。通過試驗得出四因素對植酸酶酶解植酸所得的肌醇含量的影響大小順序為：酶用量＞pH值＞反應時間＞反應溫度，植酸最佳酶解條件為酶用量60 U/g，反應時間20 min，pH值4.0，反應溫度55℃。驗證試驗測得肌醇含量為66.21 mg。酶解法反應條件溫和、耗能低，為工業化生產提供了一種新的思路。

米糠；植酸；肌醇；酶解

Abstract：Degradation of phytic acid in rice bran by enzymatic method，phytase can form phytic acid and its divalent salt phenanthroline to produce inositol.The effects of enzyme dosage，enzymolysis time，pH value and enzymolysis temperature were studied，single factor test and orthogonal test were used to determine the optimal combination of the inositol content of the metabolites.The results showed that the effect of four factors on the phytase content of phytase was enzyme dosage＞pH＞ reaction time＞ reaction temperature，the phytase optimum conditions for the amount of enzyme 60 U/g，reaction time 20 min，pH value of 4.0，reaction temperature 55℃.Verifying test the inositol content was 66.21 mg.Enzymatic hydrolysis has mild reaction conditions，low energy consumption，for the industrial production provides a new idea.

Key words：rice bran；phytic acid；inositol；enzymolysis

米糠是一種具有很高經濟價值的油料資源。米糠中除米糠油、米糠蛋白外，還富含多種營養物質和功能成分。米糠中植酸及其二價鹽類菲丁物質的含量可達11%左右[1]。以植酸及其二價鹽類菲丁為主要底物，利用微生物產生的植酸酶和磷酸酯酶來生產肌醇[2]，是未來米糠中植酸類物質應用趨勢。這是在一系列復雜的調控中非常精巧地將植酸或菲丁在酶的作用下轉化為肌醇。由于酶的反應條件比較溫和，此法制取肌醇可在常溫常壓下進行，且不會造成污染。肌醇生產企業的規模和數量，都有不斷增長的趨勢，這便對肌醇的生產工藝提出了新的更高的要求。目前研究熱點是微生物酶解法和化學合成法[3]，化學合成法在國內已實現工業化生產，但酶解法在國內仍處于研究階段，具有廣闊應用前景，是今后肌醇生產發展方向[4]。本試驗所采用酶解法反應條件溫和、耗能低，為工業化生產提供了一種新的思路。

1 材料與設備

1.1 材料

米糠：市售；植酸酶（活力3萬U/g）：天津一方科技有限公司；硫代硫酸鈉溶液 [標準物質編號：GBW（E）081235；批號：160613]、重鉻酸鉀標準溶液[標準物質編號：GBW（E）080497；批號：160601]：上海市計量測試技術研究院；其它化學試劑均為分析純：天津一方科技有限公司。

1.2 設備

XMTD-204數顯式電熱恒溫水浴鍋：天津歐諾儀器儀表有限公司；DHG-電熱恒溫鼓風干燥箱：鞏義市予華儀器有限責任公司；PHS-3C數字PH計：天津市盛邦科學儀器技術公司；T-500型電子天平：常熟雙杰測試儀器廠；720分光光度計：上海亞榮生化儀器廠；DF-101S恒溫磁力攪拌器：鞏義市英峪予華儀器廠。

2 方法

2.1 米糠植酸溶液的制備

準確稱取100 g米糠于燒杯中，以米糠∶水（質量比）=1∶8的比例加水，用鹽酸調pH值為3.0，在28℃下攪拌浸泡6 h后進行離心分離（2 000 r/min，15 min），抽濾，將離心后殘渣用清水洗滌再次抽濾，兩次濾液合并得到植酸提取液，經717型陰離子交換樹脂除雜得到植酸鈉洗提液，定容至500 mL，為米糠植酸溶液。經測得，該溶液中植酸含量為0.008 6 g/mL。

2.2 酶解試驗

取植酸稀溶液于50 mL燒杯中，加入0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液，調節反應底物植酸的pH值，然后加入植酸酶溶液，水浴加熱，水解一定時間后測量水解液中肌醇含量。以肌醇含量為指標探究加酶量、時間、pH、溫度等因素對植酸酶酶解的影響。

2.3 肌醇含量的測定方法[5]

肌醇為環已六醇，在強酸性溶液中，用重鉻酸鉀氧化生成二氧化碳和水，其反應如下：

使用過量的重鉻酸鉀標準液氧化濾液中的肌醇，過量的重鉻酸鉀氧化碘化鉀。使碘離子游離生成游離碘，然后用硫代硫酸鈉標準溶液滴定。其反應如下：

酶解完成后，立即取出并放入煮沸的沸水中，使酶失活。冷卻至室溫后，抽濾，除去不溶物，收集濾液。并記錄濾液體積。取濾液8 mL濾液于250 mL的碘量瓶中，加入2 mL標定的重鉻酸鉀標準溶液，5 mL 20%的稀硫酸溶液，于80℃水浴加熱3 h，冷卻至室溫后加入4 mL10%碘化鉀溶液，水封后置于暗處反應15 min，然后加入約20 mL蒸餾水，用0.1 mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定至近終點時，即溶液顯黃綠色，加入0.5%淀粉溶液10滴，繼續滴定至藍色消失，記錄消耗的硫代硫酸鈉溶液的體積。按下式計算肌醇含量。

式中：m為肌醇含量，mg；c1為K2Cr2O7溶液濃度，mol/mL；v1為 K2Cr2O7溶液體積，mL；c2為 Na2S2O3溶液濃度，mol/mL；v2為 Na2S2O3溶液體積，mL。

2.4 單因素試驗

2.4.1 酶用量對肌醇含量的影響

取20 mL植酸稀溶液（植酸含量為0.008 6 g/mL）于50 mL燒杯中，加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，調節pH 值到 5.5，分別加入活性 0、30、60、90、120、150 U/g的植酸酶，在55℃水浴加熱10 min，立即取出并經100℃沸水加熱使酶失活，通過抽濾，除去不溶物，測定濾液中肌醇含量。

2.4.2 時間對肌醇含量的影響

取20mL植酸稀溶液（植酸含量為0.008 6 g/mL）于50 mL燒杯中，加入0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液，調節pH值到5.5，加入30 U/g的植酸酶，55℃水浴加熱分別加熱 5、10、15、20、25、30 min，立即取出并經 100 ℃沸水加熱使酶失活，通過抽濾，除去不溶物，測定濾液中肌醇含量。

2.4.3 pH值對肌醇含量的影響

取20 mL植酸稀溶液（植酸含量為0.008 6 g/mL）于50 mL燒杯中，加入0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液，調節 pH 值到 2、2.5、3、3.5、4.0、4.5、5.5、6、6.5，加入 30 U/g的植酸酶，55℃水浴加熱分別加熱25 min，立即取出并經100℃沸水加熱使酶失活，通過抽濾，除去不溶物，測定濾液中肌醇含量。

2.4.4 溫度對肌醇含量的影響

取20 mL植酸稀溶液（植酸含量為0.008 6 g/mL）于50 mL燒杯中，加入0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液，調節pH值到5.5，加入30 U/g的植酸酶，分別在35、45、55、65、75℃下水浴加熱25 min，立即取出并經100℃沸水加熱使酶失活，通過抽濾，除去不溶物，測定濾液中肌醇含量。

2.5 正交試驗設計

在單因素研究的水平上，設計了以酶用量、時間、pH值、溫度為自變量，以所得的肌醇含量作為四因素三水平的正交試驗。正交因素水平如表1。

表1 正交因素水平表Table 1 Factor and levels of orthogonal experiment

3 結果與分析

3.1 單因素試驗

3.1.1 酶用量對肌醇含量的影響

酶用量對肌醇含量的影響見圖1。

圖1 酶用量對肌醇含量的影響Fig.1 Effect of the amount of enzyme on inositol

由圖1可以看出，當酶用量小于60 U/g時，肌醇含量隨著酶用量的增加而增加。但是當酶用量大于60 U/g之后，肌醇含量增加不明顯。可能是因為酶用量達到60 U/g時反應已經達到平衡，繼續增加酶用量，并不能促進酶解反應的進行。而且酶用量的增加，會促使產品成本的增加。因此，選擇酶用量為60 U/g最宜。

3.1.2 時間對肌醇含量的影響

時間對肌醇含量的影響見圖2。

圖2 時間對肌醇含量的影響Fig.2 Effect of time on inositol

由圖2可以看出，當酶解時間小于25 min時，肌醇含量隨著酶解時間的增加而增加，但是當酶解時間大于25 min時，肌醇含量趨于平衡，不但沒有增加，反而有減小的趨勢。可能降解25 min后，反應已達到平衡，增加酶解時間并不能促進反應的進行。增加酶解時間必然會增加產品的成本，本試驗采取的酶解時間為25 min。但是由于時間拐點并不明顯，因此在今后的試驗中應繼續延長時間，再測定肌醇含量。

3.1.3 pH值對肌醇含量的影響

pH值對肌醇含量的影響見圖3。

由圖3可以看出，當pH值大于2.5時，肌醇含量隨pH值的升高而升高，但肌醇含量小于pH值為5.5時的肌醇含量。當pH值小于5.5時，肌醇含量隨著pH值得升高而逐漸升高，當pH值大于5.5時，肌醇含量隨著pH值得升高而減少。主要是因為pH值過低不能使植酸酶達到最大活性；pH值過高植酸酶則可能失活，二者都不能使植酸酶最大發揮活性，致使效果不佳。因此，本試驗采用的pH值為5.5。

圖3 pH值對肌醇含量的影響Fig.3 Effect of pH value on inositol

3.1.4 溫度對肌醇含量的影響

溫度對肌醇含量的影響見圖4。

圖4 溫度對肌醇含量的影響Fig.4 Effect of temperature on inositol

由圖4可以看出，當溫度小于55℃時，肌醇含量隨著溫度的升高而升高，但當溫度大于55℃時，肌醇含量隨著溫度的升高而減少。主要是因為當溫度較低時，植酸酶未能充分發揮其活性，酶解反應不完全，得到的肌醇含量少。當溫度較高時，植酸酶活性被抑制，致使酶解效果不佳。因此，本試驗采用的酶解溫度為55℃。

3.2 正交試驗結果及分析

本試驗采用L9（34）正交試驗設計，依據研究目的要求，選取酶用量、時間、pH值、溫度4個因素設計試驗及優化酶解工藝。試驗結果及分析如表2、表3所示。

表2 正交試驗結果分析Table 2 Analysis of orthogonal experiment results

續表2 正交試驗結果分析Continue table 2 Analysis of orthogonal experiment results

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

由正交試驗中極差R得知，四因素對本試驗影響大小順序為：酶用量＞pH值＞反應時間＞反應溫度。而由均值1、均值2、均值3值得出的最佳組合為A2B1C1D2。驗證試驗所得肌醇含量為66.21 mg，高于第6組試驗結果，故選取酶用量60 U/g，反應時間20 min，pH值4.0，反應溫度55℃，作為最佳媒介條件。由方差分析表可以看出，誤差為10.28，是由于植酸酶品種差異造成及人為操作不當造成的。

4 結論

根據本次試驗數據得出以下結論：對植酸酶酶解植酸所得的肌醇含量的影響大小順序為：酶用量＞pH值＞反應時間＞反應溫度。這4個條件對提高肌醇產量時的最佳組合即最佳條件為酶用量60 U/g，反應時間20 min，pH 4.0，反應溫度55℃，經過驗證試驗得出肌醇含量達66.21 mg。目前，肌醇的生產方法主要是通過化學方法完成的，這些方法的最大缺點是能耗較高、污染較大、剩余的廢渣不能綜合利用，這與化學工業的發展趨勢相背離。現代化學工業的發展趨勢是環境友好、綠色化學、可持續發展，要求生產體系在贏得經濟利益的同時，不對環境構成威脅；盡可能少地消耗不可再生的資源；還要降低或消除有有害物質的使用和生成的化學產品和制造工藝。

生物催化為實現綠色化學的目標提供了許多優勢：新型、高效率、周期短、選擇性提高、常溫、常壓。多數生物催化劑對人類和環境不構成危害，通過避免使用高溫、高壓、避免金屬和有機溶劑的大量消耗，將大大降低單位產品的廢物產生量。

肌醇重要性已受到人們普遍關注，它的制取方法也日益成熟和多樣化。但目前肌醇傳統制取方法還存在有制約肌醇生產不利因素；生物工程技術生產肌醇也有待進一步完善和成熟；肌醇在某些方面作用機理和應用安全性還存在爭議，尚待進一步研究。我國有豐富脫脂米糠、鼓皮等肌醇資源可供開發，且隨著研究不斷深入，人們對肌醇需求量將會越來越大，尤其是以肌醇為原料的保健食品、功能飲料和含有肌醇減壓降脂藥品，具有很大市場發展潛力[6-10]。

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Process of Enzymatic Degradation of Phytic Acid in Rice Bran

HU Bin，CHAI Cheng，ZHAN Hu
（Tianjin Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China）

2017-08-04

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.024

胡彬（1989—），男（漢），助理工程師，學士，研究方向：食品檢測與研發。