脂質體熒光探針檢測磷脂酶C的活性

谷巧榮+艾俊杰+張倩云+董雅男+高強

摘要建立了一種以熒光標記脂質體為探針檢測磷脂酶 C （PLC） 活性的新方法。此熒光探針是由二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）和麗絲胺羅丹明B標記的熒光磷脂（Liss Rhod PE）通過自組裝形成有序的熒光標記脂質體，探針脂質體中Liss Rhod PE由于相互之間距離靠近產生自猝滅效應，因而作為探針的脂質體并不表現出熒光性質。當在此探針溶液中加入目標物PLC，PLC可以水解切割標記在磷脂酰基二位上的熒光團羅丹明，使其從脂質體釋放到溶液中，導致自猝滅效應的減弱，溶液熒光信號增強，以此實現對PLC活性的檢測。使用此探針檢測PLC活性，熒光強度的增加值與PLC濃度在5～300 U/L范圍內呈良好的線性關系，檢出限為2 U/L（S/N=3）。此外，此探針還可用于PLC抑制劑的篩選。

[KH*3/4D][HTH]關鍵詞熒光； 脂質體； 探針； 磷脂酶C； 抑制劑

1引 言

磷脂酶降解磷脂產生自由的脂肪酸、血溶性脂、膽堿和磷脂酸[1]。磷脂酶降解磷脂的過程包含了一系列生物作用，如新陳代謝、消化、炎癥反應、膜運輸、細胞間信號傳導[1，2]。磷脂酶是一個大家族，磷脂酶C（PLC）是其中的重要一員，它可以催化水解磷脂分子中的磷酸酯鍵，水解產物為二酰基甘油和磷酸膽堿[3]。這種水解過程與一些癌細胞中異常的膽堿代謝有關[4]。因而快速、靈敏的檢測體液中的PLC活性極為重要。

目前，常見的檢測PLC酶活性的方法有核磁共振法[5]、比濁法[6]、放射性測定法[7]、色譜法[8]等，上述方法各具特色且大都具有較高的靈敏度，但通常需要昂貴的儀器且操作繁瑣。因此，簡單、靈敏的檢測磷脂酶活性的方法越來越為人們所關注。近年來，熒光光譜法因其具有靈敏、快速和操作簡單的優點而被廣泛應用于酶活性檢測和酶抑制劑的篩選研究[9]。除了常規的分析方法，基于功能化的納米粒子的熒光法也已被應用于磷脂酶活性檢測。如Sun 等合成了具有熒光的功能化金納米簇，利用熒光光譜法測定了酸性磷酸酶[10]、乙酰膽堿酯酶[11]和焦磷酸酶[12]的活性。Liu等[13]將羅丹明標記磷脂組裝到石墨烯兩側，利用石墨烯猝滅羅丹明熒光制得了納米探針。在磷脂酶D存在時，磷脂酶D切割磷脂釋放羅丹明，體系熒光增強。據此實現了磷脂酶D活性的高靈敏檢測。Chen等[14]使用磷脂分子和金納米粒子制備了一種具備熒光性質的脂質體金納米粒子復合物， PLC可以切割磷脂分子破壞脂質體復合物，減小氧自由基對探針熒光的抑制，通過檢測熒光的增強實現了PLC活性的檢測。作為磷脂酶的天然底物，利用熒光標記的磷脂分子形成的脂質體探針正越來越多的被用于磷脂酶的檢測[15]以及藥物載體[16]。相對于游離的脂質體，磷脂酶對形成脂質體的磷脂通常具有更高的催化活性。本研究采用熒光分子羅丹明標記的磷脂通過混合自組裝制備了脂質體熒光探針，羅丹明因自猝滅效應并不表現出明顯的熒光。利用PLC水解構成脂質體的磷脂釋放熒光分子羅丹明，通過熒光增強實現了PLC活性的檢測。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

F7000熒光儀（日本日立公司）；Zetasizer NanoZS90激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

二棕櫚酰磷脂酰膽堿（1，2Dipalmitoylsnglycero3phosphocholine，DPPC）和麗絲胺羅丹明B標記的磷脂酰乙醇胺（1，2Dimyristoylsnglycero3phosphoethanolamineN（lissamine rhodamine B sulfonyl） （ammonium salt），Liss Rhod PE）均購自Avanti Polar Lipids公司；磷脂酶C（PLC，來源于產氣莢膜梭菌）、曲通X100和羥乙基哌嗪乙硫磺酸 （HEPES）（SigmaAldrich公司）；PLC酶抑制劑U73122（Selleck公司）； CaCl2（西安化學試劑廠）。所用試劑均為分析純，緩沖溶液和儲備溶液均使用超純水（Millipore MilliQultrapureQ，>18.2 MΩ cm）配制。

2.2實驗方法

2.2.1探針的制備將0.2 mg Liss Rhod PE （200 μL 1 mg/mL儲備液）、0.8 mg DPPC（32 μL 25 mg/mL儲備液）的氯仿溶液混合，在超聲條件下逐滴加入到3 mL水中，超聲至溶液均勻， 避光放置過夜，即得到熒光脂質體探針， 4℃保存。

2.2.2熒光檢測將50 μL PLC加入到100 μL 10.0 mmol/L HEPES（含2 mmol/L CaCl2，pH=7.4）緩沖液和50 μL探針的混合液中，室溫下檢測其熒光強度并記錄數據。熒光檢測條件：掃速240 nm/min，激發波長530 nm，激發和發射狹縫寬度5 nm，PMT=700 V，熒光測定使用1 mm×10 mm熒光比色皿。

2.2.3鈣離子的影響在原有10.0 mmol/L HEPES（含2 mmol/L CaCl2， pH=7.4）緩沖溶液中加入5 mmol/L EDTA，并在此緩沖液中按上述步驟測定加入100 U/L PLC對探針液進行水解后的熒光強度。

2.2.4抑制劑實驗將不同濃度的U73122與濃度為100 U/L PLC培養20 min后，將其混合液加入到探針液中進行熒光強度測定。

3結果與討論

3.1實驗原理圖

使用二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）和羅丹明B標記的熒光磷脂（Liss Rhod PE）制備熒光標記脂質體探針，用于PLC活性的檢測。檢測原理如圖1所示，當DPPC和Liss Rhod PE通過自組裝形成脂質體，熒光標記分子羅丹明之間的距離被拉近，出現熒光自猝滅現象。脂質體探針并不表現出熒光性質。當PLC存在時，PLC催化水解磷脂釋放出熒光分子羅丹明，使得強熒光物質羅丹明B[17]熒光得以恢復。基于羅丹明B熒光的增強實現PLC活性的檢測，這一探針也可用于PLC抑制劑的篩選。endprint