電洗脫法和透析在紫菜腐霉PacBio全基因組測序DNA樣品純化中的應用*

鄒丹丹, 唐祥海， 莫照蘭, 茅云翔**

(1. 中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2. 中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003；3. 農業部漁業資源可持續發展重點實驗室，中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東 青島 266071)

電洗脫法和透析在紫菜腐霉PacBio全基因組測序DNA樣品純化中的應用*

鄒丹丹1,2, 唐祥海1,2， 莫照蘭3, 茅云翔1,2**

(1. 中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2. 中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003；3. 農業部漁業資源可持續發展重點實驗室，中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東 青島 266071)

紫菜腐霉(Pythiumporphyrae)是一種專性侵染紫菜并引起紫菜赤腐病的病原菌。為了深入了解紫菜腐霉的遺傳信息，本文計劃對其開展全基因組測序，而制備高質量的DNA樣品是關鍵性工作。海洋生物生境和代謝的特殊性，細胞中富含的一些次級代謝物質往往影響著DNA樣品的質量。紫菜腐霉的基因組DNA樣品中具有嚴重的RNA污染，即使通過延長RNase A降解時間和增加降解次數也不能完全消除其中的RNA，無法獲得滿足于PacBio文庫構建和測序的DNA樣品。本研究首先通過瓊脂糖凝膠電泳 (Agarosegel electrophoresis, AGE)來區分DNA和RNA, 然后將DNA條帶所在的膠塊切下并放入透析袋中繼續電泳，使DNA從膠條中遷移到透析袋內的緩沖液中，從而獲得DNA的TAE溶液。然后通過透析的方法去除DNA的TAE溶液中的乙酸鈉，最終獲得DNA的TE溶液。經AGE檢測發現DNA條帶清晰、無RNA污染；經脈沖場凝膠電泳 (Pulsed field gel electrophoresis, PFGE)檢測發現DNA完整性較好，可用于PacBio文庫的構建和測序。

紫菜腐霉；基因組DNA；RNA污染；透析

紫菜是一種重要的經濟海藻。隨著紫菜栽培技術的發展，栽培面積的不斷擴大，紫菜病害頻發，其中紫菜赤腐病(the red rot disease)是最嚴重影響紫菜產量和品質的病害之一[1]。而且是目前紫菜病害中唯一的一個病原明確且由單一物種引起的病害[2]，引起紫菜赤腐病的病原菌是紫菜腐霉(P.porphyrae)，它隸屬于卵菌綱 (Oomycota)、霜霉目(Peronosporates)、腐霉科(Pythiaeeae)、腐霉屬(Pythium)[3]。由于人們對紫菜腐霉遺傳背景了解較少，赤腐病發病誘因不明，缺乏快速檢測病情的手段，也沒有高效的抑病、治病手段和方法。傳統的紫菜病害控制方法僅在感病初期具有一定的控制效果[4]，因此通過全基因組測序的方法來深入了解紫菜腐霉的遺傳信息，從而為開發赤腐病的防治策略打下基礎。

全基因測序在經過第一代和第二代測序的強勢發展后，第三代測序技術開始登上測序舞臺并受到廣大研究者的青睞。目前的三代測序平臺主要有Pacific Biosciences(PacBio)公司的單分子實時(Single-molecule realtime，SMRT)測序技術、Oxford Nanopore公司的單分子納米孔測序技術(The single-molecule nanopore DNA sequencing)以及Helicos公司的真正單分子測序技術(True single-molecule sequencing，tSMSTM)，他們的共同特征就是基于單分子水平的邊合成邊測序。目前只有PacBio公司的實時單分子測序技術已經商業化，其原理為當正在合成的堿基與某個dNTP一致時，聚合酶緊緊捕獲具有特異熒光標記的dNTP，這時激發光從ZMW(零模波導孔)的底部射出，被捕獲的dNTP就會發射熒光，儀器根據所拍到熒光的波長與峰值判斷該堿基類型[5]。SMRT測序技術最主要的優勢為其超長讀長，升級后的SMRT測序技術平均讀長可達到10～20 kb，最長讀長可超過40kb。這種超長的讀長對后續的拼接、基因定位以及重復序列的測通起著重要作用。SMRT測序技術另外的一個優勢是GC偏好性很小，傳統建庫過程中一般都有大量的PCR過程，這導致GC含量高的區域被測到的次數較少，而SMRT技術在建庫過程中沒有PCR的過程，結合其超長讀長的特征，可完成高GC基因組的測序，這一優勢對一些高GC物種的基因組測序具有非常重要的意義。此外，SMRT測序技術可用于直接檢測表觀遺傳位點，在測序過程中，測序聚合物在遇到甲基化的堿基后，合成速度明顯放慢，同時光譜特征也會發生改變，由此可以判斷該DNA位點甲基化的類型[6]。

基于PacBio技術在全基因測序中的優勢，國內外學者紛紛開始采用此項技術開展研究，但傳統方法制備的DNA樣品往往達不到PacBio技術對樣品的要求，因此獲得高質量基因組 DNA樣品是開展后續測序的關鍵。針對不同物種細胞特性的差異和各種物種DNA中富含多糖、多酚等問題，人們通過對傳統的CTAB法和SDS法進行改良，取得了很多成功方法[7-11]。紫菜腐霉基因組DNA中不僅富含多糖和蛋白質，還具有嚴重的RNA污染，蛋白質污染問題可通過增加酚/氯仿抽提次數來解決，而RNase A卻不能完全降解其中的RNA，即使延長降解時間和增加降解次數依然無法完全降解其中的RNA污染。這種現象在其他物種中未見報道，因此沒有現成的純化方法可以借鑒。電洗脫法最初是運用到T7噬菌體DNA酶切核苷酸片段的回收上[12]。本研究針對紫菜腐霉基因組DNA中存在的嚴重的RNA污染且通過RNase A 反復降解也無法獲得無RNA污染的高質量的DNA樣品的問題，在電洗脫法和透析原理的基礎上進行改進，設計出適合于紫菜腐霉基因組DNA樣品純化的方案。對純化后的DNA樣品進行質量檢測分析，并進行PacBio文庫構建和檢測。本研究希望為其在他物種在DNA樣品制備過程中遇到類似問題提供參考。

1 材料和方法

1.1實驗菌株

紫菜腐霉(P.porphyrae)于2013年5月購自日本生物資源庫(Biological Resource Center)，紫菜腐霉菌株(NBRC33253)培養在玉米半海水培養基上(CMM)[13-14]。

1.2紫菜腐霉菌絲的擴大培養和基因組DNA的制備

摳取培養在玉米半海水固體培養基上的菌餅，將其接種到谷氨酸鈉半海水液體培養基中[15]，23.5 ℃，100 r/min搖床上震蕩培養5～7 d后收集菌絲，并用過濾的無菌海水沖洗3～5遍，用吸水紙吸干水分，并利用改良的CTAB法對其進行基因組DNA提取[16]。

1.3紫菜腐霉基因組DNA的純化

透析袋使用前要經過脫鹽和脫硫處理[17]，然后浸泡在TAE緩沖液中4℃條件下儲存備用。在瓊脂糖電泳分離基因組DNA和RNA之前，將1xTAE在4 ℃冰箱里預冷，瓊脂糖膠的濃度為0.8%，電泳過程的電壓降為2.5 V/cm，電泳2～3 h(電泳過程中可以在電泳槽的周圍放置冰袋為電泳液降溫，也可以在較低溫的環境下電泳)，電泳結束后，在紫外燈下迅速將基因組DNA條帶切下。接下來進行電泳回收基因組DNA，具體步驟如下：

(1)用滅菌的蒸餾水對脫鹽、脫硫處理過的透析袋內外壁進行徹底清洗；

(2)先用透析夾將透析袋的一端夾緊，將上一步切下的含有紫菜腐霉基因組DNA片段的膠塊裝入透析袋，并灌入1x TAE電泳液，徹底排出其中的空氣后將另一端用透析夾夾緊；

(3)將裝配好的透析袋放入電泳槽中，保證電泳液沒過整個透析袋，電壓降為6 V/cm電泳1 h(注意透析袋的放置方向，保證膠塊中的DNA條帶走向與上一步電泳方向一致，同時注意電泳液的溫度盡量低溫)；

(4)電泳結束后將正負極對調電泳1 min，取出透析袋放入1L的TE緩沖液中透析，使袋中的乙酸透析出來，每2 h換一次新鮮的TE緩沖液，重復3～5次；

(5)將透析袋取出，打開一端的夾子將袋中的DNA溶液全部吸出，并用少量的TE緩沖液沖洗袋內壁并和前面的DNA溶液混合到一塊；

(6)精確估量DNA溶液的體積，加入1/10倍體積(3 mol/L，pH=5.2)醋酸鈉溶液，混勻后加入2.5倍體積的預冷的無水乙醇，-20 ℃下沉淀過夜，4 ℃，13 000g離心10 min;

(7)棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次;

(8)室溫下干燥后(一般干燥5～15 min)，溶于適量的TE緩沖液中即為紫菜腐霉基因組DNA的TE溶液，-20℃條件下儲存備用。

1.4紫菜腐霉DNA質量和濃度檢測

分別用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop對DNA樣品的完整性和純度進行初步檢測，同時利用脈沖場瓊脂糖電泳對DNA的完整性進一步檢測；最后利用Qubit2.0精準定量DNA的濃度和總量是否符合PacBio建庫要求。

進一步對DNA進行片段化(鑒于本試驗中DNA樣品經過反復的電泳和沉淀，DNA斷裂比較嚴重，故省略超聲波打斷DNA分子這一步)。利用核酸外切酶VII(ExoVII)對DNA片段兩端的單鏈部分進行降解以形成平末端，利用Beyotime平末端修復試劑盒對DNA片段進行損傷修復，最后利用AMPure PB beads對目的片段進行富集(DNA片段的目標長度設置為10 kb)[18]。取1 μL 富集的DNA目的片段，利用安捷倫2100進行片段長度檢測。后續的添加接頭由PacBio測序平臺完成。

2 結果與分析

2.1紫菜腐霉基因組DNA質量檢測

CTAB法提取的基因組DNA經檢測OD260/280 值在2.236～2.459之間，OD260/230 值在1.663～1.876之間(見表1)，瓊脂糖凝膠電泳檢測發現點樣孔處有亮帶，基因組條帶前段有彌散(見圖1A)。DNA經一次RNase A消化和蛋白質抽提后經瓊脂糖凝膠電泳檢測點樣孔處亮帶消失，但是DNA條帶前面依然有彌散但亮度降低，DNA條帶的亮度也降低(見圖1B)。DNA經3次RNase A消化和蛋白質抽提后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測發現基因組DNA條帶前面依然有彌散但片段長度降低，DNA條帶的亮度進一步降低(見圖1C)。經測定OD260/280 在2.092～2.168之間，OD260/230 值在2.000～2.015之間(見表1)。

表1 紫菜腐霉基因組DNA的吸光度值

較純DNA的OD260/280比值在1.8～2.0之間，大于2時說明有RNA污染，當大于2.2時有RNA已經水解成單核苷，230 nm處是其他碳水化合物如酚類、多糖的吸收峰，純凈的DNA的OD260/230比值應大于2，當DNA的OD260/230比值小于2時表明樣品被多糖和鹽類污染[19]。從DNA樣品的OD260/280 值在2.236～2.459之間，以及圖1-A中能明顯辨識出RNA的28s和18s條帶，我們推測基因組DNA樣品中有RNA污染。而OD260/230比值在1.663～1.876 之間，基因組DNA中可能存在多糖污染。經過RNase A 的一次消化后DNA樣品中的部分RNA被降解，當用RNase A對DNA反復的消化后，從OD260/280的比值在2.092～2.168之間，推測RNA污染問題基本解決，但是從OD260/230的比值在200.0～2.015之間推測DNA樣品并不存在嚴重的多糖污染，而圖1C分析認為有可能是RNA污染，也有可能是多糖污染，還可能是二者共同存在。

(M: λDNA(50ng/μL);A: DNA初步檢測；B: 經RNase A 消化后的DNA電泳檢測；C: 經3次RNase A 消化后的DNA電泳檢測。A:preliminary test of DNA;B:Quality test of DNA which was digested by RNase A by agarose gel electrophoresis;C:Quality test of DNA which was digested three times by RNase by agarose gel electrophoresis.)

圖1 瓊脂糖電泳檢測紫菜腐霉絲狀體基因組DNA 質量
Fig.1 Quality tests of genome DNA by agarose gel electrophoresis

2.2電洗脫和透析法純化基因組DNA的質量檢測

采用電洗脫和透析法純化紫菜腐霉基因組DNA后，通過脈沖場電泳對DNA的完整性進行檢測，DNA片段多集中在10～20 kb之間(見圖2A)。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，透析后的DNA經電泳檢測點樣孔出沒有亮帶殘留，DNA條帶清晰完整(見圖2B)。用Nanodrop對DNA進行質量和濃度檢測，檢測結果為ODA260/280為1.867～1.968，ODA260/230為2.000～2.015，濃度為110ng/μL (見表2)。用Qubit2.0進行精準定量，其濃度為80.15 ng/μL。Nanodrop測定DNA濃度和Qubit2.0測定的DNA濃度比為1.37。進一步對DNA進行損傷修復并對片段進行富集，取1uL DNA修復片段利用安捷倫2100進行核酸質量檢測，檢測結果如圖3所示，在9.6 kb處出現峰圖，基本符合預期長度10kb。

表2 紫菜腐霉基因組DNA透析后的吸光度值Table 2 Absorbance values of the P.porphyraegenome DNA afterbeing dialyze

(M1：Hind Ⅲ消化的λDNA;M2: λDNA(50 ng/μL); A : 透析后的DNA脈沖場電泳檢測；B：透析后的DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測。M1:λDNA after digesting by Hind Ⅲ;A:Quality test DNA after dialysis by PFGF;B:Quality test DNA after dialysis by AGE.)

圖2 紫菜腐霉基因組DNA透析純化后的脈沖場和瓊脂糖電泳檢測
Fig.2 Quality tests of genome DNA after being dialyze by AGE and PFGE

圖3 Agilent 2100 檢測DNA 片段質量

3 討論

獲得高質量基因組DNA樣品是進行紫菜腐霉全基因組測序的關鍵。由于其細胞結構特點和基因表達活躍，導致基因組DNA中有豐富的RNA,利用RNase A去除RNA污染是首選措施，但實驗結果發現RNase A并不能徹底降解基因組中的RNA(見圖1A)，通過延長RNA酶工作的時間和工作次數不僅不能完全降解其中的RNA，而且導致DNA總量損失嚴重(見圖1B、C)。分析認為可能是細胞表達的某些特殊的多糖等次級代謝物與RNA片段結合并將其包裹，從而阻礙了RNase A與RNA的接觸，最終導致無法徹底去除DNA中的RNA，使得后續的測序工作無法進行(在實驗過程中嘗試著完成了PacBio文庫的構建，但后續的測序工作無法進行，浪費了大量的時間和財力)。

反復的進行RNA消化，殘留的RNA可能以RNA-RNA雙鏈的形式存在，于是嘗試利用RNase H對其進行消化但依然無法解決問題，因此認為紫菜腐霉DNA 中的RNA并沒有形成RNA-RNA雙鏈(結果沒有在文章中展示)。

透析(dialysis)是利用小分子可以經過半透膜自由擴散到水或緩沖液的原理，將小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術，常用于蛋白質的脫鹽純化過程[20]。本實驗首先利用基因組DNA和RNA分子大小的差異性，通過瓊脂糖凝膠電泳有效分離DNA和RNA。其次，對獲得的DNA溶液中無機鹽離子通過透析的方法除去，從而獲得較純的DNA的TE溶液。在實驗過程中應注意保持低電壓下電泳，以減少電泳引起的溫度升高對DNA的完整性造成的破壞。蛋白質分子大小一般用質量單位道爾頓(Dalton，Dr)表示，道爾頓是與分子量近似的單位(1Dalton=1/6.02×1023g)，在蛋白質透析中常常通過目的蛋白質分子大小來選擇透析袋的孔徑。由于在透析之前已經通過電泳的方法將DNA和RNA分離，而透析袋的作用只是作為攔截DNA分子的過濾膜，而且基因組DNA分子量一般都很大，DNA分子直徑也遠遠大于需要透析出去的無機離子的直徑，只要保證透析袋的孔徑能夠攔截DNA分子即可，因此透析袋孔徑的選擇范圍比較寬泛[21]。

從實驗結果看到，純化后的DNA無論從瓊脂糖電泳檢測還是經脈沖場電泳檢測，DNA的質量較高且符合PacBio建庫要求(OD260/280、OD260/230在1.8～2.0之間且Nanodrop測定濃度與Qubit測定濃度比為1.37<3)(此標準為PacBio測序平臺根據經驗給出的建議和要求)。從回收率上，由于最開始的DNA中嚴重的RNA污染，我們無法準確測定最初的DNA的濃度，只是通過基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳條帶與Maker條帶的亮度比較的方法估讀了DNA的濃度。經過電洗脫和透析后對DNA濃度進行測定，通過計算回收率可達50%～60%。對于解決如此棘手的DNA問題，50%的回收率是可以接受的。本論文成文之際已經完成了用此方法制備的紫菜腐霉菌絲DNA樣品的PacBio建庫和測序工作，測序片段的長度平均達到8.7 kb,最長的讀長片段達到13kb(相關工作尚未發表)。這也證明了通過此方法純化的紫菜腐霉基因組DNA樣品可用于PacBio測序。

4 結語

本方法提供了一個通用、簡單易行，成本低，且安全地去除紫菜腐霉基因組DNA 提取過程中的RNA污染的方法，所純化的 DNA純度較高且滿足于PacBio文庫建庫要求，為后續的建庫、測序提供了高質量的DNA樣品，也為紫菜腐霉致病機理的研究奠定了重要的基礎，同時也為其他物種在DNA制備中遇到類似的問題提供了參考方法。

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Abstract：PythiumPorphyraeis a special pathogen to infect Nori, which caused red rot disease inPyropiayezoensisfrequently. It brings seriously reduce in Nori production and quality every year in China, Korea and Japan. So, more genetic information about the pathogen could help us exploit disease prevention and control measures. The most useful and quickly method to get the genetic information is carrying on its whole genome analysis. High quality DNA sample is the key work for carrying on the project. Particular habitation and metabolism and abundant secondary metabolites in cells of marine organism often affects the quality of the genome DNA. TheP.porphyraegenome DNAwas polluted by RNA seriously in our preliminary experiment.Usually, RNA was easily degradation by RNase A, but the RNA which residual inP.porphyraegenome DNA was not removed absolutely, even by extending RNase A degradation time and increasingRNase A degradation times, RNA pollution in the DNA simple cannot be completely degradation,the DNAlost and degradation seriously, butthe DNA simple qualitystill cannot reach up to the standard for constructing PacBio libraries.The librarywhich was constructed mandatory cannot sequence normally. In this study, DNA was obtained by EDTA methods, then the agarosegel electrophoresis (AGE) was used to separate genome DNA and RNA.The DNA bandswere cut under UV light quickly andwere transferredinto dialysis bag, further electrophoresisto insure the direction of the DNA band migrating as before.Stopping electrophoresis after the DNA band disappeared from the agarose gelby checking under UV light. This result showed that the DNA in agarose gel had enteringto the TAE solution of the dialysis bag absolutely. The dialysis which contained DNA and agarose gel, was put into 1 liter of TE buffer, the sodium acetate (CH3COONa) in the dialysis would moved from the dialysis bag to the TE buffer. At last, the pure TE solution of DNAwas got eventually. Enriching DNA by anhydrous ethanol and then detecting the DNA by AGE and pulsed field gel electrophoresis (PFGE). The results showed that the DNA band was clearly, no RNA pollution and the DNA was integrity. It can be used for PacBio libraries constructing and sequencing.

Key wordsPythiumporphyrae; genome DNA; RNA pollution; electroelution; dialysis

責任編輯 高 蓓

The Applications of Electroelution and Dialysis to Purify Genome DNA ofPythiumporphyrae

ZOU Dan-Dan1,2, TANG Xiang-hai1，2， MO Zhao-Lan3， MAO Yun-Xiang1,2

(1. The Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. College of Marine Life sciences Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 3. Yellow Sea Fisheries Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China)

Q556.2

A

1672-5174(2017)11-047-06

10.16441/j.cnki.hdxb.20160302

鄒丹丹, 唐祥海, 莫照蘭, 等.電洗脫法和透析在紫菜腐霉PacBio全基因組測序DNA樣品純化中的應用[J]. 中國海洋大學學報(自然科學版),2017, 47(11): 47-52.

ZOU Dan-Dan, TANG Xiang-Hai, MO Zhao-Lan, et al.The applications of electroelution and dialysis to purify genome DNA ofPythiumporphyrae[J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(11): 47-52.

國家自然科學基金項目(31372517)；國家高技術研究計劃項目(2012AA10A406)；山東省自主創新專項(2013CXC80202)資助 Supported by National Natural Science Foundation of China (31372517); National High Technology Research Projects (2012AA10A406);Independent Innovation Foundation of Shandong Province (2013CXC80202)

2016-09-01；

2016-11-22

鄒丹丹(1985-)，女，博士生。E-mail: zdcg2010@126.com

** 通訊作者：E-mail: yxmao@ouc.edu.cn