動物源大腸桿菌抗藥性檢測及多抗高抗菌株ERIC圖譜分析

劉玲紅，胡明，商延,3，駱延波，李璐璐， 張印，齊靜 ，張慶，常維山， 劉玉慶

(1. 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室, 山東 濟南 250100；2. 山東農業大學動物科技學院，山東 泰安 271018；3. 山東大學生命科學學院，山東 濟南 250100)

動物源大腸桿菌抗藥性檢測及多抗高抗菌株ERIC圖譜分析

劉玲紅1,2，胡明1，商延1,3，駱延波1，李璐璐1， 張印1，齊靜1，張慶1，常維山1,2， 劉玉慶1

(1. 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室, 山東 濟南 250100；2. 山東農業大學動物科技學院，山東 泰安 271018；3. 山東大學生命科學學院，山東 濟南 250100)

為檢測山東2016年動物源大腸桿菌的抗藥情況，并分析多抗高抗菌株間基因重復一致序列PCR(ERIC-PCR)基因圖譜，探討多抗高抗大腸桿菌ERIC-PCR基因分型與抗藥性之間的關系，從患病動物中分離并鑒定豬源和禽源大腸桿菌110株，用瓊脂稀釋法測定其對10種抗生素的抗藥情況，并從中挑選20株多抗高抗大腸桿菌進行ERIC-PCR，根據DNA指紋圖譜進行聚類遺傳分析。結果表明，豬源大腸桿菌對多類抗生素具有抗藥性，對氟苯尼考、多西環素和氨芐西林的抗藥率達100%，對頭孢噻肟抗藥率較低，為57.14%；禽源大腸桿菌也具有高度抗藥性，對氟苯尼考抗藥率達95.51%，對環丙沙星抗藥率最低，為61.80%。ERIC分析顯示，多抗高抗菌株譜型分散，為多克隆來源，其基因分型B型與抗藥特性之間呈一定相關性。表明，動物源大腸桿菌抗藥程度高，且呈現高度多重抗藥性，對不同種類抗生素及同類抗生素不同藥物之間均存在嚴重的抗藥性。多抗高抗大腸桿菌無明顯種屬特性，其傳播和蔓延對畜牧業發展和公共衛生安全都形成潛在的巨大風險。

大腸桿菌；抗藥性；ERIC-PCR；基因型

AbstractThe drug resistance ofE.colifrom animals were detected in Shandong Province in 2016, the gene mapping of Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR (ERIC-PCR) of multidrug resistant strains were analyzed, and then the relationship between ERIC-PCR genotyping and drug resistance of high-resistantE.coliwith multidrug resistance was discussed. Total 110E.colistrains were isolated and identified from diseased swine and avian, and their resistance to 10 kinds of antimicrobials were determined by the agar dilution method. Twenty high-resistant strains with multidrug resistance were selected to carry on the ERIC-PCR, followed by cluster genetic analysis according to the DNA fingerprint. The swine-originE.colistrains possessed serious resistance against several kinds of antimicrobial agents, for example, all strains were tolerant to florfenicol, doxycycline and ampicillin (100%), while a relative lower resistant rate to cefotaxime sodium (57.14%). The same situation was in the avian-originE.colistrains, which had a resistant rate of 95.51% against florfenicol while the lowest rate of 61.80% appeared on ciprofloxacin. Analysis of ERIC showed dispersive fingerprint patterns of high-resistant and multidrug-resistant strains which represented a multiple clone resources, and there were certain correlation between the B genotype and the drug-resistant characteristics. It indicated that animal sourceE.colistrains had high level of drug-resistance and were multidrug-resistant, that was, there were severe antibiotic resistance against not only different kinds of antibiotics but also different drugs of the same kind. The multidrug-resistant and high level-resistantE.colistrains had no apparent species preference, while its spreading and pervading posed a potential threat to the development of animal husbandry and the public health security.

KeywordsEscherichiacoli; Drug resistance; ERIC-PCR; Genotype

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)通常被稱為大腸桿菌，多為人與動物的正常菌群，但在不良條件下為條件致病菌，某些種致病性強，能夠引起嚴重的腹瀉和敗血癥等[1]。近年來，隨著養殖業集約化發展，養殖動物處于高營養、高密度的飼養環境中，自身免疫力低下，各種應激反應和疫苗保護不完全，極易發生感染。大腸桿菌作為常在菌群容易成為條件致病菌，引發大腸桿菌感染，對養殖業造成危害。從發病情況來看，大腸桿菌發病率居動物細菌性疾病全球首位，成為現代養殖業中最常見和最難防治的重要疾病之一，給整個畜牧業造成了巨大的經濟損失[2]。

目前獸醫臨床上，使用抗生素仍是防治大腸桿菌病的首要方法。國內外大量研究表明，大腸桿菌極易產生抗藥性，抗藥率逐漸上升，抗藥譜迅速增寬，抗藥性的形成和傳播速度也越來越快[3]。同時，抗菌藥物的不規范使用，不僅加劇了在畜禽體內的殘留，甚至加速了抗藥菌株或抗藥性基因元件在不同物種間的傳播，給我國畜牧業的健康快速發展和公共衛生安全帶來了隱患和潛在威脅[4]。另外，國家關于抗生素的管理正處在摸索與探究中，比如：對于同類不同抗菌藥物，目前區分了不同的使用對象和范圍，此措施能否有效阻斷抗藥性的產生和蔓延還有待于進一步研究。

腸桿菌基因間重復共有序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus, ERIC)PCR 以其操作簡便、易實現、重復性高、分辨力強等優點,逐漸引起了人們的關注[5]。本研究于2016年從病死動物樣品中收集豬源和禽源大腸桿菌，檢測其對常用抗生素種類的抗藥性，同時關注其對獸用和醫用使用范圍有所區分的同類別不同藥物之間交叉抗藥性，并采用ERIC-PCR方法，探討多抗高抗大腸桿菌ERIC-PCR圖譜與其種屬特異性和傳播之間、大腸桿菌抗藥情況及ERIC-PCR基因分型間的關系，對了解大腸桿菌抗藥水平、藥物間交叉抗藥性及開展抗藥菌株抗藥機制的分子生物學研究有一定意義。

1 材料與方法

1.1試驗材料

大腸桿菌ATCC 25922藥敏標準株，由山東省農業科學院畜牧獸醫研究所公共衛生實驗室保存。

培養基：大腸桿菌顯色培養基ECC，購自上海欣中生物有限公司；MHA瓊脂和MHB肉湯培養基，購自北京陸橋技術有限責任公司。

試劑：PCR buffer、dNTP 和TaqDNA聚合酶，均購于天根生化科技(北京)有限公司；DL5000 DNA Marker， 購于寶生物工程(大連)有限公司。

抗生素：氨基糖苷類：慶大霉素(CN)；四環素類：多西環素(DOX)；氯霉素類：氟苯尼考(FFC)；β-內酰胺類：氨芐西林(AMP)、頭孢曲松(CRO)、頭孢噻呋(CEF)和頭孢噻肟(CEQ)；氟喹諾酮類：恩諾沙星(EN)、環丙沙星(CIP)和左氧氟沙星(LVX)。以上試劑購自北京普博欣生物科技有限責任公司。

1.2方法

1.2.1 大腸桿菌分離鑒定 將2016年于山東不同地區養殖場采集的患病雞、豬內臟和糞便拭子樣品劃線于大腸桿菌顯色培養基上，37℃培養后挑取單個藍色可疑菌落，接種于非選擇性MHA瓊脂培養基培養后，用MALDI-TOF-MS飛行時間質譜儀(法國生物梅里埃 VETIK MS)進行鑒定，將鑒定為陽性的大腸桿菌保存于30%甘油肉湯中，置于-20℃保存備用。

1.2.2 大腸桿菌藥物敏感試驗 參照美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標準，用瓊脂稀釋法對分離菌株進行10種藥物的藥敏試驗[6]，測定各菌株的抗藥率，統計分析豬源、禽源大腸桿菌抗藥性及各菌株的多重抗藥性、交叉抗藥性。

1.2.3 ERIC檢測 根據參考文獻[7]設計引物(F: 5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，R：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′)，由上海生物工程有限責任公司合成。

根據藥敏試驗結果，挑取多抗高抗菌株，禽源和豬源各10株，提取DNA，進行ERIC-PCR 擴增。PCR反應條件: 95℃預變性 7 min；90℃變性 30 s，52℃退火 1 min，65℃延伸 8 min，30個循環；65℃延伸 16 min，4℃ 保存。根據電泳圖記錄ERIC指紋圖譜并分析DNA多態性。有條帶的記為“1”, 沒有條帶的記為“0”,將ERIC-PCR擴增的DNA多態性形成數據矩陣進行聚類遺傳分析。以相似度>0.75為同一基因型，<0.75為不同基因型[8]。

2 結果與分析

2.1大腸桿菌分離鑒定

采集樣品經過分離鑒定，最終確定共獲得大腸桿菌110株，其中豬源大腸桿菌21株，禽源大腸桿菌89株。

2.2大腸桿菌抗藥性檢測

對分離的大腸桿菌進行藥物敏感試驗，結果如圖1，可見，所有菌株抗藥率均較高，其中豬源大腸桿菌對多西環素、氨芐西林和氟苯尼考抗藥率達100%，對環丙沙星、恩諾沙星抗藥率為90%以上，對頭孢噻肟抗藥性相對較低，也在57.14%。禽源大腸桿菌對氟苯尼考和氨芐西林抗藥率高達90%以上，對環丙沙星抗藥率較低，為61.80%。表明，山東不同動物源大腸桿菌抗藥性非常嚴重。

圖1 豬源和禽源大腸桿菌分離株的抗藥率

2.3大腸桿菌的多重抗藥性

統計分析110株大腸桿菌藥敏試驗結果，多重抗藥性如圖2所示，可見，未發現完全不抗藥的菌株，僅有1株菌抗1種抗菌藥，其余菌株均表現出對2種及多種抗菌藥物的抗藥性，其中同時抗10種抗菌藥的多達41株(37.27%)，抗6～9種抗菌藥的有62株(56.36%)，抗1～5種抗菌藥的僅占6.36%。

圖2大腸桿菌分離株的多重抗藥性

2.4大腸桿菌對同類抗生素交叉抗藥性

本研究中，選擇了同屬于第三代頭孢的3種抗生素，即頭孢噻呋、頭孢噻肟和頭孢曲松。其中，前者為動物專用抗生素，后兩種為醫用抗生素。

根據交叉抗藥率計算公式[9]：A藥對B藥的交叉抗藥率(%)=同時抗A、B藥菌株數/抗B 藥總菌株數×100 ,計算出兩種頭孢菌素之間交叉抗藥性,結果如表1，顯示頭孢類抗生素間存在非常顯著的交叉抗藥性，每兩種抗生素的交叉抗藥程度多在95%以上，醫用抗生素和動物用抗生素在本試驗分離的大腸桿菌抗藥率方面并無區別。110株大腸桿菌中，對1種及以上頭孢藥物具有抗藥性的菌株共有81株，其中同時對3種頭孢藥物均抗藥的菌株有70株，對3種藥物的重合抗藥率為86.40%。

表1 對兩種頭孢類藥物同時產生抗藥性的菌株調查結果

注：表中數據括號外為菌株數，括號內為交叉抗藥率。下同。

同樣，研究中選擇三種喹諾酮類藥物，即恩諾沙星、環丙沙星和左氧氟沙星。前者是動物專用，后兩者為醫用。根據交叉抗藥率公式, 計算出喹諾酮類兩兩之間交叉抗藥率，結果如表2，顯示喹諾酮類抗生素不同藥物同樣存在交叉抗藥性。每兩種抗菌藥的交叉抗藥性多高于80%以上。110株大腸桿菌中，對1種及以上喹諾酮藥物具有抗藥性的菌株共有95株，其中同時對3種頭孢藥物抗藥的菌株有65株，3種藥物重合抗藥率為68.40%。

表2 對兩種喹諾酮類藥物同時產生抗藥性的菌株調查結果

2.5 ERIC指紋圖譜分析

根據藥敏試驗結果綜合評價，挑取禽源和豬源多重高抗菌株各10株，進行多次ERIC-PCR，獲得穩定指紋圖譜。ERIC-PCR指紋圖譜條帶數約有1～8條，條帶大小主要在200 ～3 000 bp之間，以400 bp和1 800 bp左右為主帶；豬源和禽源指紋圖譜主帶無明顯同源性。禽源4和5泳道指紋圖譜幾乎完全一致，表明4和5菌株可能屬同一菌株；豬源指紋圖譜未發現明顯規律；禽源和豬源DNA指紋圖譜共表現出19種ERIC譜型，如圖3所示。

注：M代表DL5000 DNA Marker。

圖3禽源和豬源多抗高抗大腸桿菌的ERIC-PCR電泳圖譜

2.6 DNA多態性聚類分析

由聚類分析樹狀圖(圖4)可知，20株抗藥菌株有8種ERIC-PCR基因型，并且與禽源或豬源沒有相關性。其中有55%抗藥菌株表現同一ERIC-PCR基因型，即B型，該部分菌株中63.64%菌株表現同樣的抗藥譜，即對10種抗生素全部抗藥。所選擇菌株中共有10株細菌對10種抗菌藥均為抗藥，其中7株都為B型ERIC-PCR基因型。

圖4 多抗高抗菌株聚類分析樹狀圖

3 討論與結論

近年來,大腸桿菌的抗藥株不斷增多,出現了大量多重抗藥菌。國內外研究結果表明，抗藥性大腸桿菌在全球范圍內廣泛存在[10，11]。雷連成[12]、隋慧[13]及賀丹丹[14]等均報道動物源大腸桿菌的抗藥性以多重抗藥為主。本研究結果發現，110株大腸桿菌中僅1株單一抗藥菌株，其余均為多重抗藥菌株。本研究中多重抗藥株高度集中,可能由于獸醫臨床大量使用抗菌藥治療細菌性感染，或者在飼料中添加抗生素來促進生長和預防疾病，導致大腸桿菌長期在藥物選擇壓力下產生越來越顯著的抗藥性[15]。同時，大量抗藥菌的出現可能是菌體攜帶介導抗藥性的質粒導致抗藥基因在菌體間傳播。另據研究報道，多重抗藥菌的出現，可能是菌體細胞膜通透性的改變和菌體主動外排系統表達量增加作用的結果[16，17]。

本研究表明，分離的大腸桿菌不僅對多種抗生素產生抗藥性，還對同類抗生素不同藥物存在嚴重的交叉抗藥性，如頭孢類和喹諾酮類藥物，菌株對醫用抗菌藥的抗藥性也很高。雖然此現象可能與養殖場存在用藥不規范的情況有關，但作用機理和治療效果相似的同類抗菌藥不可能同時大量和重復使用，因此，高度交叉抗藥性的現象應該引起人們的高度重視。一種藥物產生抗藥性，同類產品的其它藥物可能因此而產生交叉抗藥性，所以單純將動物專用抗菌藥和醫用抗菌藥分開，而不考慮交叉抗藥性的問題，不可能阻止抗藥菌株的傳播和蔓延。本研究結果同類抗生素間存在交叉抗藥性與李筱涵等[18]報道喹諾酮類藥物間存在交叉抗藥性的結果一致。喹諾酮類抗菌藥體外誘導抗藥性試驗證明，這類藥物之間存在交叉抗藥性是由于有相同的母體結構，同理，頭孢類抗菌藥間存在抗藥性是因為含有相同的環狀結構[19]。交叉抗藥性的檢測可以反映獸醫臨床抗藥的實際情況，給獸醫臨床指導用藥奠定基礎，同時交叉抗藥性給公共衛生領域帶來了挑戰和潛在的威脅。

病原菌給養殖業帶來高風險，尤其是多抗高抗菌株給實際生產帶來巨大危害，本文探討了多抗高抗菌株表型與其DNA指紋圖譜間的關系，分析抗藥菌株同源性、抗藥表型與ERIC-PCR基因型的關系，探索抗藥菌株產生抗藥性機制的相似點。研究發現所測菌株譜型非常分散，并且禽源和豬源大腸桿菌之間并無明顯的種屬特異性，這預示菌株易在不同物種間傳播，增加了包括人在內的不同物種共患的可能性。結果還顯示菌株抗藥性與特定ERIC-PCR基因型之間存在一定程度的關聯，具體為對10種藥物全部抗藥的多抗高抗菌與B型ERIC-PCR基因型存在最大的重合和覆蓋度，表明此基因型的大腸桿菌易形成多重抗藥性，或者是此基因型大腸桿菌具有較強的傳播和蔓延能力，對養殖業和世界公共衛生安全造成了潛在的極大的威脅因素。

統計分析動物源大腸桿菌抗藥性和抗藥菌株間ERIC基因型間的關系，有助于從大腸桿菌表型和分子水平多方面檢測大腸桿菌抗藥性,本文將DNA指紋圖譜與抗藥性和同源性聯系起來，為深入抗藥菌株產生抗藥性的分子機制研究奠定基礎，利用ERIC-PCR技術研究其DNA 指紋圖譜與抗藥表型的關系還需更多數據的支持,有待進一步深入研究。

[1] Orth D, Grif K, Zimmerhackl L B, et al. Prevention and treatment of enterohemorrhagicEscherichiacoliinfections in humans [J]. Expert Rev. Anti. Infect. Ther. ，2008，6:101-108.

[2] 安微,張秀英,李蕊,等. 致病性大腸桿菌毒力因子和耐藥性研究進展[J]. 畜牧與獸醫,2013,45(8):106-110.

[3] Titilawo Y, Sibanda T, Obi L, et al. Multiple antibiotic resistance indexing ofEscherichiacolito identify high-risk sources of faecal contamination of water[J]. Environ. Sci.Pollut. Res. Int.， 2015，22: 10969-10980.

[4] 林居純，卓家珍，蔣紅霞，等．不同地區豬源和禽源大腸桿菌耐藥性監測[J]．華南農業大學學報，2009，30(1)：86-88．

[5] Hulton C S, Higgnsc F. ERIC sequences: a novel family of repetitive elements in the genomes ofEscherichiacoli,Salmonellatyphimuriumand other enterobacteria [J]. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, 1991,5:825-830 .

[6] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: 18th informational supplement [S]. CLSI Document M100-S18，2008.

[7] Versalovic J, Koeuth T, Lupski J R. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to finerpriting of bacterial genomes [J]. Nucleic Acids Research,1991, 19(24): 6823-6831.

[8] Sandvang D, Aarestrup F M , Jensen L B. Characterisation of integrons and antibiotic resistance genes in Danish multiresistantSalmonellaentericaTyphimutium DT104 [J]. FEMS Microbiology Letters, 1998, 160(1):37-41.

[9] 張健騑，李躍龍，陳鮮花，等. 禽致病性大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物交叉耐藥性研究[J]. 廣東農業科學, 2005(2):74-76.

[10] Chaieb K, Abbassi M S, Touati A, et al. Molecular characterization ofStaphylococcusepidermidisisolated from biomaterials in a dialysis service[J]. Annals of Microbiology, 2005, 55: 307-312

[11] Mathai E, Chandy S, Thomas K, et al. Antimicrobial resistance surveillance among commensalEscherichiacoliin rural and urban areas in Southern India[J].Trop. Med. Int. Health.,2008,13(1):41-45.

[12] 雷連成,鄭丹,韓文瑜,等 動物源性大腸桿菌藥物敏感性檢測及耐藥性分析(英文)[J]. 中國獸醫學報,2005，25(5):470-473.

[13] 隋慧,楊金生.動物源性多重耐藥大腸桿菌的分離與鑒定 [J]. 中國獸醫雜志,2013，49(6):48-50.

[14] 賀丹丹,黃良宗,陳孝杰,等. 不同動物源大腸桿菌的耐藥性調查[J]. 中國畜牧獸醫,2013，40(10):211-215.

[15] 張純萍,寧宜寶,宋立. 健康雞豬體內大腸桿菌對四環素的耐藥性及耐藥基因分布[J]. 中國農業科學,2010，43(12):2578-2583.

[16] 趙靜，楊漢春，查振林.規模化豬場大腸桿菌耐藥性監測[J]. 中國獸醫雜志，1998,24(11):12-13.

[17] 張小林，李家泰．主動外排系統在大腸桿菌中的分布與表達[J]. 中國臨床藥理學雜志，1999,15(3):171-174.

[18] 李筱涵,曲芬,鮑春梅,等. 氟喹諾酮類藥物對腸道致病菌的體外耐藥性及交叉耐藥[J]. 中國抗生素雜志,2009(4):251-253.

[19] Barry A L, Jones R N. Cross -resistance among cinoxacin, ciprofloxacin, DJ -6783, enoxacin, nalidixic acid, no-rfloxacin, and oxolinic acid afterinvitroselection of resistant populations [J]. Antimicrob. Agents Chemo. Ther., 1984, 25:775-777.

DetectionofDrugResistanceofEscherichiacoliIsolatedfromAnimalsandERICAnalysisofMultipleResistantStrains

Liu Linghong1,2, Hu Ming1, Shang Yan1,3, Luo Yanbo1, Li Lulu1, Zhang Yin1, Qi Jing1, Zhang Qing1, Chang Weishan1,2, Liu Yuqing1

(1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,ShandongAcademyofAgriculturalSciences/ShandongProvincialKeyLaboratoryofAnimalDiseaseControlandBreeding,Jinan250100,China; 2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShandongAgriculturalUniversity,Taian271018,China; 3.SchoolofLifeSciences,ShandongUniversity,Jinan250100,China)

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.09.001

2017-06-26

山東省農業科學院農業科技創新工程項目(CXGC2017A01)；山東省農業重大應用技術創新項目“山東省肉雞業公共衛生模式建立的示范”

劉玲紅(1991—)，女，山東煙臺人，碩士研究生，主要從事預防獸醫學研究。 E-mail：1074150258@qq.com

常維山(1960—)，男，山東泰安人，教授，主要從事預防獸醫學研究。 E-mail:wschang@sdau.edu.cn 劉玉慶(1969—)，男，山東煙臺人，研究員，主要從事獸醫公共衛生研究。E-mail: liuiuqing@163.com

S852.61+2+Q78

A

1001-4942(2017)09-0001-06