酶-堿結(jié)合法提純豆渣纖維及其特性表征

李佩燚， 侯青青， 李新平， 劉 旭， 陳麗紅

(1.陜西科技大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院 陜西省造紙技術(shù)及特種紙品開發(fā)重點實驗室 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點實驗室 中國輕工重點實驗室， 陜西 西安 710021； 2.輕化工程國家級實驗教學(xué)示范中心(陜西科技大學(xué))，陜西 西安 700021; 3.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院, 陜西 西安 710021)

酶-堿結(jié)合法提純豆渣纖維及其特性表征

李佩燚1,2， 侯青青1,2， 李新平1,2， 劉 旭1,2， 陳麗紅3

(1.陜西科技大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院 陜西省造紙技術(shù)及特種紙品開發(fā)重點實驗室 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點實驗室 中國輕工重點實驗室， 陜西 西安 710021； 2.輕化工程國家級實驗教學(xué)示范中心(陜西科技大學(xué))，陜西 西安 700021; 3.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院, 陜西 西安 710021)

以豆渣為原料，探討了酶-堿結(jié)合法提純豆渣纖維的工藝條件.結(jié)果表明，堿處理和蛋白酶處理的最佳工藝條件分別為：堿處理時間60 min、溫度65 ℃、pH11,蛋白酶的添加量0.3%(w/w)、酶解時間1 h、酶解溫度55 ℃、pH6，此時產(chǎn)品的得率為80.47%.對處理后豆渣的紅外光譜和掃描電鏡分析表明，酶-堿結(jié)合法可以有效去除附著在纖維表面的蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)，使纖維表面變得光滑.堿處理后豆渣纖維的平均長度、寬度減少，蛋白酶處理后纖維長度和寬度基本沒有變化，酶-堿結(jié)合處理后纖維的平均聚合度和分子量都有一定下降.

豆渣； 蛋白酶； 堿處理； 纖維特性

Abstract:The soybean dreg fibers were prepared by the methods of alkaline solution extracting and enzymatic hydrolysis from byproduct of soymilk.The treatment conditions of alkali treatment and protease hydrolysis were discussed by orthogonal test.The results showed that the optimum technology condition of alkali treatment was that pH value was 11,soaking time was 60 min and soaking temperature was 65 ℃.The condition of protease hydrolysis was that the ratio of enzyme to substrate was 0.3%,pH value was 6,hydrolysis time was 1 h,the temperature was 55 ℃.Under the above conditions,the yield of product was 80.47%.The FTIR spectrum and SEM were indicated that the protein and lipid attached to the fiber surface,they could be effectively removed by alkaline solution extracting and protease hydrolysis and they made the fiber surface smooth.After alkali treatment the average length and width of soybean fiber decreased.However,the fiber length and width could not be changed obviously after protease hydrolysis.The average polymerization degree and molecular weight of soybean fibers decreased after alkali and protease hydrolysis.

Keywords:soybean dregs； protease； alkali treatment； fiber characteristic

0 引言

豆渣是生產(chǎn)豆腐或豆奶過程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)品，它是大豆加工行業(yè)中最大的副產(chǎn)物(約占全豆干重15%～20%)，我國每年約產(chǎn)2000萬噸的濕豆渣[1].由于濕豆渣的水分含量較高，通常為78%～85%，運輸困難，容易腐蝕變質(zhì)，因此必須及時加工或者干燥后運輸、保存[2].豆渣作為一種重要的農(nóng)業(yè)廢棄物資源，由于其熱能低并且口感粗糙，長期以來并沒有得到人們的廣泛關(guān)注，其中只有極少部分的豆渣作為食用消費，而大部分的豆渣作為飼料、肥料或者丟棄.這樣不僅使得豆渣沒有得到充分的開發(fā)利用、經(jīng)濟效益低，而且浪費資源，造成了環(huán)境污染[3].

由于豆制品的生產(chǎn)工藝不同，所以產(chǎn)生的副產(chǎn)物豆渣的組成成分也有所差異.通常豆渣主要含有蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維、礦物質(zhì)、維生素、異黃酮和其他碳水化合物等物質(zhì)[4].豆渣中有效成分的提取包括不溶性膳食纖維、可溶性膳食纖維、分離蛋白等.其中豆渣膳食纖維的制備方法包括了纖維素酶法[5]、高溫蒸煮結(jié)合纖維素酶法[6]、超聲波結(jié)合木瓜蛋白酶法[7]、植物復(fù)合酶法[8]，并可利用豆渣纖維研制成本低、性能好、綠色環(huán)保的可食性包裝紙[9].由于豆渣中含有一定量的蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)，而蛋白質(zhì)會影響產(chǎn)品的純度，不飽和脂肪酸容易發(fā)生化學(xué)變化產(chǎn)生特殊的豆腥味，因此在制備豆渣纖維時，盡可能的將兩者去除[10].豆渣的豆腥味可以通過加熱的方法加以去除.豆渣蛋白由于溶解性較低，加入蛋白酶可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，改善其品質(zhì).Chan等[11]通過加入胰蛋白酶水解豆渣分離蛋白，使其溶解度增加大于兩倍，也改善了其水合能力和乳化能力.大豆纖維的結(jié)構(gòu)上存在親水基團，并且側(cè)鏈上存在較多的羧基和羥基等負電荷集團，使它具有較強的親水性和陽離子交換能力.纖維素、半纖維素的分子較大，與果膠等結(jié)合形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有較強的吸附能力，使它在酸性乳制品、可食用膜等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值[12-14].

本文通過對豆渣主要成分進行分析，采用蛋白酶-堿結(jié)合的方法對豆渣進行處理，研究了蛋白酶-堿結(jié)合處理豆渣的最佳工藝參數(shù)，對處理后的豆渣的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行了分析與表征，研究蛋白酶-堿結(jié)合處理對豆渣纖維表面形態(tài)、纖維長度、寬度的影響，從而為豆渣這一價格便宜、來源廣泛的纖維原料的進一步開發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù).

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

(1)主要試劑：豆渣,取自東北某豆奶廠，干燥，過40目篩；蛋白酶,酶活為10萬U/g，購自綠微康生物工程有限公司；氫氧化鈉，為分析純.

(2)主要儀器：FD-1A-50型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；HZ5H型水浴振蕩器，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；PB-10型Ph計，南京榮華科學(xué)器材有限公司；S-4800型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；VECTOR-22型，傅里葉紅外光譜儀；MorFi Compact纖維形態(tài)分析儀，法國Techpap公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 豆渣基本成分的測定

(1)水分含量測定：GB 5009.3-2010，干燥法；

(2)粗脂肪含量的測定：GB/T 14772-2008，索氏抽提法；

(3)蛋白質(zhì)含量測定：NYT 2007-2011，杜馬斯燃燒法；

(4)灰分含量測定：GB 5009.4-2010，灼燒法；

(5)綜纖維素含量的測定：GB/T 2677.10-1995，亞氯酸鈉法；

(6)α-纖維素含量的測定：GB/T 744.10-1989，NaOH法.

1.2.2 提取工藝流程

干豆渣→堿預(yù)處理→蛋白酶脫蛋白質(zhì)沸水浴滅活→ 冷凍干燥→提純的豆渣纖維

1.2.3 脫脂：利用無水乙醚或石油醚(沸程30 ℃～60 ℃)抽提6 h，除掉脂肪.

1.2.4 酶-堿結(jié)合的方法

稱取3.0 g的豆渣原料于錐形瓶中，按照料液比為1∶20(g/mL)加入定量的蒸餾水，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH到12，然后置于恒溫水浴中，在一定的溫度下反應(yīng)一段時間.反應(yīng)結(jié)束后取出并冷卻，用乙酸調(diào)節(jié)pH，再加入一定量的蛋白酶，然后放置到恒溫水浴振蕩器中，在一定溫度下反應(yīng)一段時間.反應(yīng)結(jié)束后立即用沸水浴滅活10 min，用布氏漏斗抽濾，蒸餾水反復(fù)洗滌，最后將收集到的纖維轉(zhuǎn)移到已干燥至恒重的培養(yǎng)皿中，冷凍干燥12 h，得到豆渣纖維.

1.3 分析檢測

1.3.1 表面形貌分析

取少量干燥后的樣品，用導(dǎo)電膠將其固定在載物臺上，經(jīng)過表面噴金，用S-4800型掃描電子顯微鏡觀察，加速電壓為5 kV.

1.3.2 纖維形態(tài)分析

設(shè)定MorFi Compact纖維形態(tài)分析儀測量的纖維數(shù)為5 000根，濃度為30 mg/L.取一定量的樣品，用1 000 mL的純凈水稀釋，并用標準漿料疏解器使其充分解離，最后用MorFi Compact纖維形態(tài)分析儀測定其平均長度、寬度、卷曲率等纖維形態(tài)參數(shù).

1.3.3 紅外光譜

先將樣品與KBr進行干燥處理，然后取一定量的樣品(1～2 mg)與干燥后的KBr充分研磨使其混合均勻(樣品與KBr的質(zhì)量比為1∶100)，再將混合后的粉末置于干凈的模具中，用油壓機壓成透明薄片，最后放入紅外光譜儀中進行測量.

1.3.4 聚合度

先用銅乙二胺溶液將纖維溶解成纖維素的溶液，然后通過測定纖維素溶液的黏度來計算纖維素的聚合度(DP)：

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 豆渣的組成

豆渣主要成分如表1所示.由表1可知，豆渣中綜纖維素、α-纖維素的含量較高為提純豆渣纖維提供了一定的基礎(chǔ).除此之外，蛋白質(zhì)和脂肪的含量也較高，由于蛋白質(zhì)會直接影響產(chǎn)品的純度，不飽和脂肪酸發(fā)生化學(xué)變化會產(chǎn)生豆腥味[10]，因此在制備豆渣纖維素時要盡可能的將它們?nèi)コ齕15].

表1 豆渣的主要成分

注：各個組分的含量相對于絕干豆渣計算.

2.2 豆渣纖維制備工藝的研究

2.2.1 堿處理工藝的確定

以反應(yīng)pH值(A)、反應(yīng)溫度(B)、反應(yīng)時間(C)等為影響得率的主要因素.采用三因素三水平的正交試驗來優(yōu)化堿處理工藝，其設(shè)計方案及結(jié)果如表2、3所示.

表2 堿處理正交試驗因素水平表

表3 堿處理正交試驗結(jié)果表

根據(jù)表3中的試驗序號的工藝條件進行試驗,并分別測定了產(chǎn)品的得率，每次試驗平行做3次，取其平均值.正交試驗的結(jié)果的極差分析如表4所示.由表4可知，各個因素對產(chǎn)品得率的影響次序為B>A>C，即堿處理時反應(yīng)溫度的影響最為顯著，其次是反應(yīng)的pH值，最后是反應(yīng)時間.由此可以得出堿處理的最佳工藝參數(shù)為A1B2C2，即反應(yīng)pH、溫度、時間分別為11、65 ℃、60 min，此時產(chǎn)品的得率為88.99%.

表4 堿處理工藝試驗結(jié)果極差分析

在正交試驗的基礎(chǔ)上，通過單因素試驗進一步了解反應(yīng)pH值對產(chǎn)品得率的影響，其結(jié)果如圖1所示.

圖1 溶液的pH對得率的影響

由圖1可以看出，當(dāng)pH<11時，隨著pH值的增加，產(chǎn)品的得率也增加；當(dāng)pH>11時，隨著pH值增加，產(chǎn)品得率減小，因此最佳的pH值為11.這是因為當(dāng)pH<11時，堿液除了作用于底物中纖維素外，也作用于底物中的蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì).因為pH在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的溶解度隨pH的增加而增加，由于OH-所帶的負電荷與蛋白質(zhì)所帶的負電荷相互排斥，使得蛋白質(zhì)的溶解作用和擴散作用增強[16].當(dāng)pH>11時，蛋白質(zhì)的溶解度降低，纖維素的降解增加，使得產(chǎn)品的得率減少.這是因為當(dāng)pH超過一定范圍時，蛋白質(zhì)的溶解度隨pH的增加而減小，由于此時脫氨、脫羧和肽鍵斷裂等副反應(yīng)會發(fā)生[17]，并且由于OH-占主導(dǎo)作用，使-COO-增加了分子間靜電斥力，離散的雙電子層加厚，溶液界面膜增厚，易于形成膠束，進而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解和擴散作用降低[18].

2.2.2 蛋白酶工藝的確定

為了得到更為純凈的豆渣纖維，經(jīng)過堿處理后的豆渣在利用蛋白酶進行進一步的處理，其中堿處理的條件采用上述的最佳工藝條件進行.通過預(yù)實驗得到影響酶處理的主要因素是溫度(A)、pH(B)、蛋白酶添加量(C)、反應(yīng)時間(D).設(shè)計四因素三水平的正交試驗來優(yōu)化酶處理工藝，其因素水平和實驗方案及結(jié)果如表5、6所示.

表5 蛋白酶處理正交試驗因素水平表

表6 蛋白酶處理正交試驗結(jié)果及極差分析表

根據(jù)表6中的實驗序號的工藝條件進行實驗， 并分別測定了產(chǎn)品的得率，每次實驗平行做3次，取其平均值.從正交試驗的結(jié)果可以看出，各個因素對產(chǎn)品得率的影響次序為B>C>D>A，即蛋白酶處理時pH的影響最為顯著，其次是蛋白酶的濃度和反應(yīng)時間，最后是反應(yīng)溫度.由此可以得出蛋白酶處理的最佳工藝參數(shù)為A3B1C2D1，即反應(yīng)溫度、pH、濃度、時間分別為55 ℃、6、0.3%、1 h，此時產(chǎn)品的得率80.47%.與原料相比，酶-堿結(jié)合處理后各組分的含量均有一定的變化，用最佳工藝條件處理之后，產(chǎn)物中綜纖維素、α-纖維素、蛋白質(zhì)的含量分別為83.42%、78.63%、3.56%.由此可以看出，酶-堿結(jié)合處理有效的去除了豆渣中的蛋白質(zhì)，使得纖維素的含量增加.

2.3 酶-堿結(jié)合處理對纖維表面形態(tài)的影響

由圖2(a)可以觀察到，未經(jīng)處理的豆渣表面有許多大小不一，形狀各異的物質(zhì)，并且纖維的表面粗糙，有褶皺，內(nèi)部由纖維素類物質(zhì)形成支撐主體.由圖2(b)可以看出，經(jīng)過堿預(yù)處理后纖維表面的褶皺減少，表面變得疏松，表面雜質(zhì)類物質(zhì)減少.由圖2(c)可以看出，當(dāng)再進一步用蛋白酶處理后，纖維表面變得光滑，已經(jīng)沒有顆粒物質(zhì)附著在纖維表面.由此可以得出，酶-堿結(jié)合法可以有效的去除豆渣中的雜質(zhì)，得到純度較高的豆渣纖維素.

2.4 酶-堿結(jié)合處理對纖維形態(tài)參數(shù)的影響

(a)原料

(b)堿處理

(c)蛋白酶處理圖2 經(jīng)不同工藝處理后纖維的掃描電鏡圖(堿 處理和蛋白酶處理的條件均為最佳工藝)

由圖3可以看出，豆渣纖維的長度在0.3 mm左右，其中原料的纖維長度為0.332 mm，堿處理之后，纖維長度變?yōu)?.309 mm，減少了6.93%，降低的比較明顯，而經(jīng)過蛋白酶處理后纖維的長度為0.300 mm，與堿處理之后的纖維長度相比較基本沒有變化.造成這種結(jié)果的原因是在堿性條件下，纖維素會發(fā)生降解反應(yīng)，部分糖苷鍵斷裂，使纖維長度降低；而蛋白酶具有專一性，所以蛋白酶處理時，只有蛋白質(zhì)發(fā)生降解反應(yīng)，并沒有破壞纖維素的分子鏈，所以纖維長度基本沒有變化.

圖3 不同工藝處理后纖維長度變化(堿 處理和蛋白酶處理的條件均為最佳工藝)

由圖4可以看出，纖維的寬度大概在50μm左右，原料纖維的寬度為51.2μm，堿處理之后下降為48.5μm，下降了5.27%.這是因為堿處理過程中，粘附在纖維表面的脂肪、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)被去除，纖維寬度變小，同時，在堿性條件下，纖維的外層發(fā)生溶解或者剝落，使得纖維寬度降低.蛋白酶處理后纖維寬度也基本沒有變化，這也是由于蛋白酶的專一性造成的.由以上分析可知，豆渣纖維本身的長度、寬度都比較小，因此為它以后開發(fā)納米纖維素產(chǎn)品提供了一定的條件.

圖4 不同工藝處理后纖維寬度的變化(堿 處理和蛋白酶處理的條件均為最佳工藝)

2.5 酶-堿結(jié)合處理對豆渣纖維結(jié)構(gòu)的影響

紅外光譜廣泛地被用于測量聚合物在分子水平上的結(jié)構(gòu)與功能[19].未處理的豆渣和通過酶-堿結(jié)合處理后的豆渣的紅外光譜圖如圖5所示，其中酶-堿結(jié)合處理的條件采用上述研究過程得出最佳工藝參數(shù)進行.

由圖5可見，與未處理的豆渣的特征吸收峰相比較，酶-堿結(jié)合處理后的豆渣的特征吸收峰的位置基本沒有變化，說明預(yù)處理沒有改變豆渣纖維的主要化學(xué)成分.在波數(shù)為3 394 cm-1的特征吸收峰是由-OH和-NH的伸縮振動引起的，由于分子間氫鍵和分子內(nèi)氫鍵多分子締合，因此吸收峰呈一個寬的吸收帶；2 935 cm-1附近的吸收峰是甲基(-CH3)和亞甲基(-CH2-)的伸縮振動引起的；1 373 cm-1處的吸收峰是甲基-CH3的彎曲振動引起的；1 049 cm-1處的吸收峰是由纖維素中C-O鍵的伸縮振動和O-H鍵的彎曲振動引起的.1 741 cm-1主要是半纖維素中沒有結(jié)合的羰基和半纖維素中阿魏酸或?qū)ο愣顾岬孽セ械聂驶奈辗澹?堿結(jié)合處理之后，它消失說明半纖維素在酶-堿結(jié)合處理的過程中被溶解[20-22].除此之外，在1 741 cm-1、 1 541 cm-1、1 248 cm-1處附近可能存在來自蛋白質(zhì)、脂類的羰基、環(huán)乙酰基的伸縮振動[23].由圖5可以看出經(jīng)過酶-堿處理后1 541 cm-1和1 248 cm-1的峰消失，說明有一部分的蛋白質(zhì)、脂肪被溶解，這與掃描電鏡觀察的現(xiàn)象一致.

a：未處理的豆渣； b：處理后的豆渣圖5 未處理的豆渣和酶-堿結(jié)合 處理后的豆渣紅外光譜圖

2.6 酶-堿結(jié)合處理對豆渣纖維聚合度的影響

表7是酶-堿結(jié)合處理后豆渣纖維的平均聚合度和分子量的變化情況.由表7可以看出，酶-堿結(jié)合處理后豆渣纖維的平均聚合度和分子量都減少.纖維素的聚合度表示纖維素分子鏈中所連接的葡萄糖單元數(shù)目[24]，間接的可以表示出纖維素分子鏈的長短.由表7可知，未處理的豆渣的聚合度為278，基本達到普通微晶纖維素的程度；處理后的豆渣聚合度為255，下降了8.27%.在堿處理的過程中，纖維素會發(fā)生降解反應(yīng)，導(dǎo)致纖維素大分子鏈逐漸斷裂，纖維素的平均聚合度減小，而纖維素的平均聚合度的大小可以反映出纖維素分子量的大小，因此纖維素的分子量也減少.

表7 酶-堿結(jié)合處理對聚合度的影響

3 結(jié)論

(1)酶-堿結(jié)合處理豆渣的最佳工藝條件如下：堿處理的工藝為反應(yīng)pH是11、溫度是65 ℃、時間是60 min；蛋白酶處理的條件為反應(yīng)溫度是55 ℃、pH是6、蛋白酶的添加量是0.3%(w/w)、反應(yīng)時間是1 h，此時的得率為80.47%.

(2)通過酶-堿結(jié)合處理可以有效的去除豆渣纖維表面附著的蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)，使纖維表面變得光滑，纖維的長度和寬度都減少，平均聚合度有一定降低，為豆渣進一步開發(fā)成納米纖維素提供了一定的理論基礎(chǔ).

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【責(zé)任編輯：蔣亞儒】

Preparationandcharacterizationofcellulosefromsoybeandregsbyalkalitreatmentandproteasehydrolysis

LI Pei-yi1，2， HOU Qing-qing1，2， LI Xin-ping1，2， LIU Xu1，2， CHEN Li-hong3

(1.College of Bioresources Chemical and Materials Engineering, Shaanxi Province Key Laboratory of Papermaking Technology and Specialty Paper, Key Laboratory of Auxiliary Chemistry and Technology for Chemical Industry, Ministry of Education, Key Laboratory of Paper Based Functional Materials, China National Light Industry, Shaanxi University of Science & Technology，Xi′an 710021，China； 2.National Demonstration Center for Experimental Light Chemistry Engineering Education (Shaanxi University of Science & Technology), Xi′an 710021，China; 3.College of Chemistry and Chemical Engineering， Shaanxi University of Science & Technology， Xi′an 710021， China)

2017-08-15

陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃項目(2015JM3118)； 浙江省廢棄生物質(zhì)循環(huán)利用與生態(tài)處理技術(shù)重點實驗室開放基金項目(2016REWB20)； 天津市制漿造紙重點實驗室開放基金項目(201608)； 陜西科技大學(xué)博士科研啟動基金項目(BJ15-29)

李佩燚(1981-)，女，陜西寶雞人，副教授，博士，研究方向：植物資源高值化利用、纖維素功能材料

2096-398X(2017)05-0016-06

TQ353

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