多孔鈦表面羥基磷灰石鈣磷涂層的制備及生物活性的研究

楊立軍， 施 蘭， 閆程程， 張 佳， 王 哲， 代文豪， 李寧寧

(陜西科技大學 機電工程學院， 陜西 西安 710021)

多孔鈦表面羥基磷灰石鈣磷涂層的制備及生物活性的研究

楊立軍， 施 蘭， 閆程程， 張 佳， 王 哲， 代文豪， 李寧寧

(陜西科技大學 機電工程學院， 陜西 西安 710021)

針對鈦及鈦合金用于生物醫用材料所表現的生物活性不夠高的問題，選用多孔鈦為基體利用仿生礦化法在其表面制備HA鈣磷涂層，得到Ti/HA鈣磷涂層復合材料，分析不同表面前處理對涂層形貌的影響,并對涂層的表面形貌、組成和微觀結構進行系統分析和表征.再通過模擬體液(SBF)體外浸泡實驗對Ti/HA復合材料和多孔鈦的生物活性進行研究.結果表明，經前處理后的多孔鈦在模擬體液中能誘導羥基磷灰石生成，表現出良好的生物活性.且經沉積液浸泡后的多孔鈦的生物活性更高.

多孔鈦； 羥基磷灰石； 仿生礦化； 模擬體液； 生物活性

Abstract:In order to solve the problem that the biological activity is not high enough when titanium and titanium alloy used in biomedical materials,The hydroxyapatite calcium phosphate coating was prepared by using biomimetic mineralization on the surface of porous titanium.And analyze the effects of different surface pretreatments on the morphology of the coating and the surface morphology,composition and microstructure of the coating were systematically analyzed and characterized.The bioactivity of Ti / HA composites and porous titanium was investigated by simulating body fluid(SBF)immersion experiments.The results showed that the pre-treated porous titanium could induce the formation of hydroxyapatite in simulated body fluids and showed good biological activity.And the biological activity of the porous titanium after immersion in the sediment is higher.

Keywords:porous titanium; hydroxyapatite; biomimetic method; simulation body fluids; biological activity

0 引言

醫用金屬材料具有較高的機械強度、硬度及較好的韌性、抗沖擊性能，已廣泛的應用于人體硬組織修復及替換材料.常用的醫用金屬材料主要是鈦及鈦合金材料，其主要特點是密度小、比強度高、耐蝕性好且具有良好的生物相容性.但是，鈦及鈦合金是生物惰性金屬材料，與新生骨之間只能形成機械鎖合，兩者之間的結合強度較低，會引起植入體松動或自體骨斷裂.另外，鈦及鈦合金與骨的彈性模量不匹配，且其拉伸強度、抗壓強度和抗彎強度都比人骨高得多，在應力作用下，將產生不同的應變，出現"應力屏蔽"現象，使得骨組織退化、萎縮，導致植入體的松動和斷裂，不能滿足長期的使用要求[1].

目前常用的植入體是多孔結構材料，其中多孔鈦被認為是最有應用前景的生物醫用材料之一.多孔鈦及其合金具有開放多孔狀結構，使得新骨細胞組織可在植入體內生長及體液傳輸，且能促進成骨細胞在植入材料表面和孔隙中生長.另外，多孔鈦在彈性變形后有一個較長的應力平臺，可起到緩沖外來沖擊力的作用[2].羥基磷灰石(HA)是脊椎動物硬組織的礦物質成分，具有良好的生物相容性及生物活性，HA種植體能誘導周圍骨組織的生長[3-5]，但是它強度低、脆性大，難以植入承重部位作為替代材料.

目前多數研究者在多孔鈦及其合金表面通過多種方法制備HA鈣磷生物活性涂層，HA涂層的制備工藝主要包括等離子噴涂法、溶膠-凝膠法、離子束輔助沉積技術、電化學沉積法[6]、激光法和仿生法等[7].Oliveira等[8]利用仿生礦化法在種植體表面納米級的羥基磷灰石涂層中摻入鍶，促進成骨和種植體-骨之間形成骨整合的作用.陳建良等[9]采用堿處理法經過預鈣化處理后在不同孔隙率的多孔鈦樣品表面制備了磷灰石涂層.

本文采用不同的前處理方式，利用仿生礦化法在多孔鈦表面制備HA鈣磷涂層，分析不同表面處理對涂層形貌的影響，并對涂層的表面形貌、組成和微觀結構進行系統分析和表征.再通過模擬體液(SBF)體外浸泡實驗對Ti/HA復合材料及多孔鈦的生物活性進行研究.

1 實驗部分

1.1 試樣前處理

實驗采用的多孔鈦最大孔徑為30μm，將多孔鈦板切割成尺寸規格為10 mm×10 mm×1.5 mm的試樣，依次用400號、600號、800號金相砂紙磨光，分別在無水乙醇、蒸餾水中進行超聲波清洗.各次清洗加熱溫度均為20 ℃、超聲功率密度40%、清洗時間30 min.在室溫下進行干燥，干燥后備用.

切割打磨后的試樣在100 mL 18 wt% HCl和100 mL 48 wt% H2SO4混合酸溶液中浸泡30 min，用恒溫水浴鍋將溫度控制在60 ℃，處理完后用去離子水超聲波清洗30 min，干燥后試樣再分成3組，A3組放入10 mol/L的NaOH溶液處理18 h.清洗干燥后放在飽和的Ca(OH)2溶液中室溫浸泡24 h.A4組浸泡在10%的H2O2溶液中處理18 h，再放在飽和的Ca(OH)2溶液中室溫浸泡24 h.A5組先放入10 mol/L的NaOH溶液中處理再浸泡在10%的H2O2溶液中處理2 h，用水浴鍋將溫度控制在60 ℃，之后浸泡在飽和的Ca(OH)2溶液中.試樣分組及其前處理方式如表1所示.

表1 試樣分組及其前處理方式

1.2 仿生沉積

將HA粉末溶解于0.1 mol/L HCl溶液中，用三羥甲基氨基甲烷和0.1 mol/L的HCl溶液調節溶液pH至7.4，離心處理，得到沉積液.將A3、A4、A5各組樣品浸泡沉積液中，首先在4 ℃下恒溫浸泡24 h以獲得晶種，然后轉移至37 ℃下浸泡5天(d)從而獲得涂層[10，11]，浸泡完成后，用蒸餾水小心清洗樣品表面，真空干燥箱37 ℃恒溫干燥12 h.

1.3 體外模擬體液浸泡

為了檢測不同前處理方式下多孔鈦的生物活性，將前處理的A3、A4、A5組試樣及A4組經沉積液浸泡后的樣品分別浸泡在標準模擬體液(SBF)中，每兩天更換一次SBF溶液，每次SBF的加入量為50 mL，浸泡12 d后取出干燥.

1.4 表面檢測

用金相顯微鏡觀察表面形貌，X射線衍射進行涂層物相結構分析，掃描電子顯微鏡觀察涂層表面形貌并用設備自帶的能譜分析儀對涂層進行能譜分析，計算鈣磷比.

2 結果與討論

2.1 試樣前處理

圖1為在100倍的金相顯微鏡下不同前處理工藝的表面形貌.圖1(a)是未經表面處理的多孔鈦試樣，表面凹凸不平并可以看到不規則的孔隙；圖1(b)為金相砂紙打磨后的多孔鈦基板，表面呈現清晰的直線狀平行的結構，凹坑已明顯被磨平，仍能看見微小的孔隙；圖1(c)是酸處理后的試樣，由圖可以看出試樣表面出現交錯復雜的溝壑狀結構；圖1(d)是堿溶液處理后的試樣，其表面的凹點或溝壑較圖1(c)有所平緩，凹坑孔徑更小，試樣的表面粗糙度更高；圖1(e)是H2O2溶液處理后的試樣表面形成一層模糊的凝膠狀物質；圖1(f)為NaOH和H2O2混合處理的的試樣，由圖可以看出試樣表面有少量的凝膠物質，凹點和溝壑平緩，表面相對粗糙.

(a)打磨前 (b)打磨后

(c)酸處理后 (d)堿處理后

(e)H2O2處理后 (f)NaOH和H2O2混合處理后圖1 不同前處理工藝的表面形貌

對不同前處理后的多孔鈦試樣進行了X射線衍射分析.如圖2所示，其中曲線1、2、3分別為A4、A3、A5組經過不同前處理后的多孔鈦基板XRD衍射圖譜，從圖2中可以看到明顯的鈦酸鈉峰.比較三組不同前處理方式下的XRD衍射圖譜，發現曲線2、3十分相似，說明NaOH和H2O2混合前處理與NaOH溶液前處理的效果相似.

1：A4組；2：A3組；3：A5組圖2 前處理后試樣的XRD圖譜

通過各組試樣的表面形貌和XRD衍射圖譜，可以看出前處理方式的不同，對基體表面的形貌影響很大，采用硫酸和鹽酸配置的混合酸可以使基體表面產生大量的酸蝕凹點或溝槽，增大鈦基體的表面粗糙度，同時基體的表面積也增大，為HA的生長提供了更大的空間.堿液處理也會增大鈦基體的表面粗糙度，會使鈦基體表面產生納米級微孔[12]，有利于磷灰石的形成.有研究結果表明，粗糙表面較之光滑表面更易于骨基質沉淀和成骨細胞的附著，從而有利于“骨整合”的形成[13].此外，經過堿處理后的鈦基體表面會形成多孔鈦酸鈉結構，含有帶負電的Ti-OH基團，有利于HA的形成.在H2O2溶液中，鈦表面促進H2O2的分解及鈦的氧化，基體表面產生空洞，溶液中產生OH-、OOH-，這些離子吸附到基體表面的氧化鈦層上，使基體表面帶上-OH或-OOH[14]，可以在鈦表面形成一層富含Ti-OH基團的非晶態TiO2，這同堿液處理的效果很接近.Ca(OH)2預鈣化液為堿性,其中含有Ca2+和OH-，預鈣化過程中這兩種離子均可能吸附于基體表面，它們都是HA構晶離子，因此樣品經過預鈣化后，在沉積液中培養，吸收鈣離子更加迅速，有利于HA在鈦酸鹽的多孔表面上成核長大.

2.2 仿生沉積結果

圖3 (a)、(b)、(c)為A3～A5各組試樣在37 ℃沉積液中浸泡5 d后的SEM圖，可以看出試樣表面有少量白色的沉積物，說明多孔鈦板在pH為7.4的HA過飽和溶液4 ℃低溫浸泡24 h，再經37 ℃恒溫浸泡可以在表面制備出HA鈣磷涂層.

(a)A3沉積液浸泡5 d (b)A4沉積液浸泡5 d

(c)A5沉積液浸泡5 d圖3 各組試樣37 ℃沉積液浸泡5 d的SEM圖

實驗過程中，轉入37 ℃恒溫箱后，對A3、A4、A5各組樣品每隔1 d檢測殘余沉積液的pH值.表2為4 ℃低溫浸泡后轉移至37 ℃沉積液浸泡5 d，A3、A4、A5各組沉積液的pH變化數據.圖4為37 ℃沉積液浸泡5 d溶液pH值變化曲線，浸泡1 d后A3、A4組的pH值增大，隨后又減小，A5組前三天pH呈下降趨勢，浸泡4 d的三組試樣沉積液的pH值均有回升，之后又是大幅下降.總的來看，沉積液的pH值隨時間的增加呈下降趨勢，且整個過程中pH處于波動狀態，說明沉積過程是一個動態過程.

表2 37 ℃下沉積液的pH值數據

圖4 37 ℃下沉積液pH值變化曲線

沉積過程中會發生以下的反應[15，16]：

TiO2+OH-→HTiO3-

(1)

Ti+3OH-→Ti(OH)3++4e-

(2)

Ti(OH)3++e-→TiO2·2H2O+0.5H2↑

(3)

Ti(OH)3++OH-?Ti(OH)4

(4)

TIO2·nH2O+2OH-?HTiO3-

(5)

10Ca2++6PO43-+2OH-→Ca10(PO4)6(OH)2↓

(6)

從式(6)可以看出，HA鈣磷涂層的沉積反應會消耗沉積溶液中的OH-離子，使得溶液的pH值降低，由于所有的化學反應都是可逆的，若沉積液中OH-離子過度消耗而得不到補充即有可能促使涂層沉積反應逆向進行[17].在這種情況下，涂層就可能發生降解.從圖4的曲線圖中可以看出，沉積3 d時pH值達到了第一個最小值，3 d后沉積液的pH值開始緩慢升高是因為涂層周圍的OH-離子因離子擴散作用的補充量超過消耗量引起的，因此在沉積過程中可以2～3 d之間更換沉積液，使得沉積效果更佳明顯.

2.3 模擬體液浸泡實驗結果

由前面可知NaOH和H2O2混合前處理與NaOH溶液前處理的效果相似.因此將A3、A4組的試樣經過標準SBF溶液12 d培養，干燥后對其表面進行XRD衍射分析，衍射圖譜如圖5(a)所示.其中，曲線1為A3組的XRD衍射圖譜，曲線2為A4組的XRD衍射圖譜.對比羥基磷灰石標準XRD衍射PDF圖片可知，2θ=26 °、2θ=32 °等均為HA的特征.相比圖2中，HA的特征峰很明顯，且鈦的特征峰部分被覆蓋，說明多孔鈦表面有羥基磷灰石生成，進而表明幾種前處理方式均提高了多孔鈦的生物活性.另外，圖5(a)、圖5(b)中均可以看到鈦的氧化物(TiO2，Ti3O5)和氫化物(TiH2).這是因為前期在強堿溶液加熱的條件下金屬鈦電解反應會生成TiH2，堿熱處理過程中多孔鈦表面會生成金紅石型TiO2，Ti3O5則能是由鈦的高價氧化物與低價氧化物相互作用生成的[18].

圖5(b)為A4組(H2O2前處理)經標準模擬體液培養前后試樣的XRD圖譜.其中曲線1為沉積液浸泡5 d后試樣的XRD衍射圖譜，HA的特征峰十分微小，曲線2是A4組試樣經過標準SBF溶液培養12 d后的XRD衍射圖譜，可以看到在2θ=26 °、2θ=32 °明顯的HA特征峰且有鈦的氧化物產生，曲線3為沉積液浸泡5 d后再經標準SBF溶液培養12 d后的XRD衍射圖譜，圖中HA的特征峰比曲線2高，且有磷酸三鈣生成，磷酸三鈣在人的骨骼中普遍存在，是一種良好的骨修復材料.比較3條曲線可以發現經過沉積浸泡，再用模擬體液培養后的試樣表面的Ti特征峰基本完全被覆蓋，說明該復合涂層材料具有良好的生物活性.

1：A3 SBF浸泡12 d；2：A4 SBF浸泡12 d (a)A3、A4組SBF浸泡12 d的XRD圖譜

1：A4沉積液浸泡5 d； 2：A4 SBF浸泡12 d； 3：A4沉積液浸泡5 d+SBF浸泡12 d (b)A4組沉積液、SBF浸泡的XRD圖譜圖5 試樣的XRD圖譜

對不同前處理后在標準模擬體液中浸泡12 d的試樣進行掃描電鏡觀察，如圖6(a)、圖6(b)、圖6(c)所示.其中，圖6(a)為A3組標準模擬體液浸泡后試樣的SEM圖，表面生成了少量的網狀磷灰石結構.圖6(b)為A4組浸泡后的SEM圖，試樣表面生成了羥基磷灰石聚集體，還有集聚的鹽類結構，由XRD可知該物質為磷酸三鈣.由相關文獻可知[19,20]，經H2O2處理過的多孔鈦表面生成了雙相磷酸鈣涂層.雙相磷酸鈣陶瓷是由羥基磷灰石和磷酸三鈣兩相成分構成的陶瓷.通常其生物活性高于羥基磷灰石陶瓷，其化學組成與骨組織的無機成分相似，且具有良好的生物相容性、生物活性和生物安全性.

圖6(c)為A5組標準模擬體液浸泡后試樣的SEM圖，可以看到少量片狀的磷灰石結構.多孔鈦與羥基磷灰石涂層復合材料在標準SBF溶液中浸泡12d后，涂層表面被新的HA涂層基本完全覆蓋.這表明，Ti/HA鈣磷涂層復合材料能夠引導磷灰石晶核在其表面形成，而模擬體液為磷灰石的過飽和溶液，磷灰石晶核一旦形成，就可以通過消耗周圍溶液中的鈣離子和磷離子而自發長大.同時也說明羥基磷灰石與鈦的復合材料具有良好的生物活性.

(a)A3組SBF浸泡12 d (b)A4組SBF浸泡12 d

(c)A5組SBF浸泡12 d圖6 SBF浸泡12 d后復合試樣的SEM圖

圖7是A3組試樣在模擬體液中浸泡12 d后試樣表面涂層的EDS能譜，圖7中可以看到顯著的Ca、P信號，表明試樣表面有磷灰石相形成，計算其Ca/P比大約是1.53，這與羥基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)的化學計量比十分接近，表明該涂層試樣具有良好的生物活性.

圖7 模擬體液浸泡后表面涂層EDS能譜

3 結論

本文通過仿生礦化法在多孔鈦表面制備HA鈣磷涂層，分析不同表面處理對涂層形貌的影響并對涂層的表面形貌、組成和微觀結構進行系統分析和表征.再通過模擬體液(SBF)體外浸泡實驗對Ti/HA復合材料及多孔鈦的生物活性進行研究.結果表明，通過初始pH為7.4的HA過飽和溶液4 ℃低溫浸泡24 h和37 ℃恒溫浸泡5 d能在多孔鈦板表面制備HA鈣磷涂層.前處理后的多孔鈦在模擬體液中能誘導羥基磷灰石鈣磷涂層的生成，表現出良好的生物活性，且經沉積液浸泡后的多孔鈦的生物活性更高.

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【責任編輯：陳佳】

Preparationandresearchofbioactiveactivityofhydroxyapatitecalciumphosphatecoatingonporoustitaniumsurface

YANG Li-jun, SHI Lan, YAN Cheng-cheng, ZHANG Jia,WANG Zhe, DAI Wen-hao, LI Ning-ning

(College of Mechanical and Electrical Engineering， Shaanxi University of Science & Technology， Xi′an 710021，China)

2017-06-20

國家自然科學基金項目(50972086)

楊立軍(1974-)，男，陜西西安人，教授，博士，研究方向：生物醫用材料

2096-398X(2017)05-0071-06

TG14

A