牛羊乳α-酪蛋白的B細胞抗原表位預測及免疫反應性分析

薛海燕， 韓 波， 李 珊， 操 歌

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

牛羊乳α-酪蛋白的B細胞抗原表位預測及免疫反應性分析

薛海燕， 韓 波， 李 珊， 操 歌

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

牛羊乳的α-酪蛋白營養(yǎng)功能相似，但蛋白質(zhì)亞類結(jié)構(gòu)和含量不同，可能是造成其過敏性差異的原因.本文旨在利用生物信息學DNAStar Protean軟件、SOPMA以及the BepiPred 1.0服務(wù)器對牛羊乳主要過敏蛋白αs1-酪蛋白(Casein，CN)的二級結(jié)構(gòu)、親水性、抗原指數(shù)、表面可及性和柔韌性進行預測，分析鑒定主要B細胞抗原表位.合成相應表位肽段序列，制備酪蛋白抗體，采用間接ELISA法分析驗證合成多肽的免疫反應性.結(jié)果表明：牛羊乳αs1-CN的氨基酸序列同源性89%，但抗原表位存在差異，與牛乳αs1-CN相比，羊乳抗原表位數(shù)目相差不大，但兩者抗原表位區(qū)域存在一定的包含重疊關(guān)系.且羊乳αs1-CN合成肽段P-1037(26～31，LSPEVP)、P-1040(140～142，EGN)和牛乳αs1-CN合成肽段P-1038(189～208，TDAPSFSDIPNPIGSENSEK)、P-1039(99～102，EDVP)都具有免疫反應性，該結(jié)果為過敏原表位的選擇提供基礎(chǔ)，為牛羊乳過敏原性比較及改性加工提供理論依據(jù).

牛羊乳；αs1-酪蛋白； 二級結(jié)構(gòu)； 抗原表位

Abstract:Bovine and goat milkα-casein were very similar in the aspect of nutrition and function,but they induced different allergen reaction in consumers because of the differences in protein subclass structure and content.The purpose of this paper was to analyze and identify the B cell epitopes by predicting the secondary structure,hydrophilicity,antigenicity index,surface accessibility and flexibility of major allergic proteinαs1-casein from cow and goat milk using DNAStar Protean software,SOPMA and the BepiPred 1.0 server.Prepared the casein antibody by synthesizing the corresponding epitope peptide sequence and then used an indirect ELISA method to identify the immunoreactivity of the synthetic polypeptide.The results showed that the amino acid sequence homology of cow and goat milkαs1-CN was 89%,but the epitopes were different.The number of epitopes of goat milk was similar compared with cow milkαs1-CN,but there was a certain overlap between the two epitope regions.The peptide fragment P-1037 (26～31,LSPEVP),P-1040 (140～142,EGN) synthesized by the goat milkαs1-CN and the peptide P-1038 (189～208,TDAPSFSDIPNPIGSENSEK),P-1039(99～102,EDVP) synthesized by the cow milkαs1-CN had the immunoreactivity,which provided the basis for the selection of the allergen epitope,and provided the theoretical basis for the comparison of sensitization and modification of cow and goat milk.

Keywords:cow and goat milk;αs1-CN; the secondary structure; epitopes

0 引言

牛乳中富含多種蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)，是人體優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)來源，但同時也是聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織FAO (1995)報告的八大類過敏食物之一[1].牛乳過敏是指機體對牛乳蛋白的高反應性(hypersensitivity)，是嬰幼兒最常見的食物過敏之一，在歐美發(fā)達國家，嬰兒牛乳過敏癥狀發(fā)生率達0.3%～7.5%[2].目前普遍認為，牛乳蛋白中的酪蛋白(Casein，CN)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-LG)和α-乳白蛋白(α-lactalbumin，α-LA)是最主要的過敏原，其中酪蛋白主要由αs1、αS2、β和κ酪蛋白組成，約80%是由αs1-酪蛋白(αs1-CN)組成，對酪蛋白過敏的患者一般都對αs1-CN過敏[3,4].羊乳總熱量、干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪以及礦物質(zhì)含量均高于牛乳，具有較高的營養(yǎng)價值，且易被人體消化吸收利用，在國際營養(yǎng)學界被譽為“乳中之王”[5].以羊乳替代牛乳作為嬰幼兒主要的營養(yǎng)來源被廣泛認可.羊乳和牛乳中酪蛋白所占比例相似，但羊乳中以β和κ-酪蛋白為主，αs1-CN含量(18.9%)遠低于牛乳中的含量 (30.8%)[6].羊乳中αs1-CN含量較低，理論上具有較低的致敏性，Hodgkinson等[7]也證實了低αs1-CN含量的山羊乳可以減少抗原攝入量，降低致敏性.然而Muraro等[8]認為山羊乳與牛乳具有相同的致敏性.所以，就目前山羊乳的低致敏性及其在預防嬰幼兒牛乳過敏中的應用仍存在爭議.

食物蛋白質(zhì)引起機體致敏的主要原因是消化道內(nèi)未水解的蛋白質(zhì)抗原表位被免疫系統(tǒng)識別.抗原表位預測中，B細胞線性表位預測是目前研究的重點，它是研究抗原表位與已知氨基酸序列在蛋白質(zhì)上的某些結(jié)構(gòu)特征之間的關(guān)系，從氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)，親水性，表面可及性，柔韌性等方面，進行序列的分析預測[6,9].常用的分析軟件有ABCpred[10]，BepiPred[11]，SOPMA[12]，DNAStar[13]，其中BepiPred，SOPMA，DNAStar這三種軟件較為常用，其基本原理是結(jié)合抗原蛋白的結(jié)構(gòu)特點，統(tǒng)計顯著性度量，理化性質(zhì)等指標進行簡單預測，操作簡單，只需輸入蛋白質(zhì)氨基酸序列，即可得出結(jié)果.該研究采用BepiPred，SOPMA和DNAStar這三種預測軟件對牛羊乳過敏原αs1-CN B細胞線性抗原表位進行預測分析，并通過實驗驗證合成的抗原表位是否具有免疫反應性，為進一步對比驗證牛乳和羊乳之間的抗原關(guān)系提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

(1)主要材料：兔抗牛α-CN多克隆抗體(α-CN-IgG，效價1∶204800)，本室制備；HRP-羊抗兔Ig G抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；碳酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、明膠等常規(guī)試劑均為進口或國產(chǎn)分析純.

(2)主要儀器：MULTISKANmk3型酶標儀，賽默飛世爾上海儀器有限公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海島析實業(yè)有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 牛羊乳αs1-CN氨基酸序列

通過NCBI數(shù)據(jù)庫檢索牛羊乳αs1-CN氨基酸序列，該序列在NCBI的基因登錄號分別為NP_851372、P18626.

1.2.2 牛羊乳αs1-CN二級結(jié)構(gòu)預測

利用DNAStar Protean軟件(Gamier-Robson方法)和SOPMA網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器輸入檢索到的牛羊乳αs1-CN氨基酸序列分析預測兩者的二級結(jié)構(gòu).

1.2.3 牛羊乳αs1-CN親水性、抗原指數(shù)、表面可及性及柔韌性預測

應用DNAStar Protean軟件，采用Kyte-Doolittle法、Jameson-Wolf法、Emini法和Karplus-Schulz法分別對檢索到的牛羊乳αs1-CN氨基酸序列進行親水性、抗原指數(shù)、表面可及性及柔韌性預測.

1.2.4 B細胞線性抗原表位確定

利用the BepiPred 1.0服務(wù)器，直接輸入牛羊乳αs1-CN氨基酸序列，抗原指數(shù)高于1即為可能表位區(qū)域[14].并與牛羊乳αs1-CN二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果和親水性、抗原指數(shù)、表面可及性及柔韌性預測結(jié)果相結(jié)合，綜合分析得到B細胞線性抗原表位.

1.2.5 牛羊乳αs1-CN多肽合成及鑒定

選擇牛羊乳差異較大的抗原表位肽段，由杭州丹港生物科技有限公司，應用全自動多肽合成儀，采用固相合成法從肽鏈C端向N端依次合成.經(jīng)反高效液相色譜(RP-HPLC)以及質(zhì)譜對其進行純度鑒定，純度大于98%，符合實驗室要求.

1.2.6 多肽免疫反應性鑒定

采用間接ELISA檢測合成多肽的免疫反應性.將上述合成的多肽用包被緩沖液稀釋至10μg/mL，每孔加入100μL，以α-CN、β-LG蛋白分別作為陽性、陰性對照，4 ℃包被過夜[15].棄去蛋白包被液，每孔加入300μL PBST洗滌液洗滌3次，每次4 min，拍干，除去殘留氣泡和液體.每孔加入200μL明膠封閉液，37 ℃溫箱封閉1.5 h，洗滌，拍干.每孔加入濃度為5μg/mL的α-CN-Ig G 100μL(實驗室制備，抗牛乳α-CN多克隆抗體兔血清)，同時設(shè)置陰性血清對照，37 ℃溫箱溫育1.5 h，使抗原抗體充分反應，洗滌拍干.用PBS稀釋液將羊抗兔HRP-Ig G以1∶4000的比例稀釋作為二抗，每孔加入100μL，37 ℃溫箱溫育1 h，洗滌，拍干.每孔加入50μL TMB顯色液，37 ℃溫箱避光顯色15 min，顯色后每孔加入50μL終止液2 mol/L H2SO4終止反應，450 nm測定吸光值.檢測時以P/N值>2.1(即多克隆抗體上清的吸光值大于陰性血清值的2.1倍)判定檢測結(jié)果為陽性，P/N值<2.1(即多克隆抗體上清的吸光值小于陰性血清值的2.1倍)判定檢測結(jié)果為陰性[15].

2 結(jié)果與分析

2.1 牛羊乳αs1-CN所對應的氨基酸序列

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對比分析牛羊乳αs1-CN氨基酸序列，將不同差異位點標出，其同源性達到89%，且牛乳αs1-CN氨基酸序列相比羊乳氨基酸差異位點大多為一些極性親水性氨基酸.

2.2 牛羊乳αs1-CN的二級結(jié)構(gòu)

利用SOPMA網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器對牛羊乳αs1-CN二級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果如圖1所示.

(a)牛乳αs1-CN

(b)羊乳αs1-CN圖1 SOPMA預測牛乳αs1-CN 和羊乳αs1-CN二級結(jié)構(gòu)

利用DNAStar Protean軟件對牛羊乳αs1-CN二級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果如圖2所示.

(a)牛乳αs1-CN

(b)羊乳αs1-CN圖2 DNAStar預測牛乳αs1-CN 和羊乳αs1-CN二級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是抗原表位預測的重要參數(shù)之一.β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲由于其松散的結(jié)構(gòu)，易發(fā)生扭曲、盤旋，并展示在蛋白質(zhì)的表面，因此該區(qū)域常含有優(yōu)勢抗原表位而α-螺旋和β-折疊化學鍵能比較高，結(jié)構(gòu)規(guī)則不易變形，較難結(jié)合抗體，一般不作為抗原表位[16-18].綜合上述兩者的預測結(jié)果可推出牛乳αs1-CN可能抗原表位區(qū)域為19～27，41～43，60～62，99～102，118～120，127～129，148～150，185～186，189～210；羊乳αs1-CN可能抗原表位區(qū)域為18～31，41～42，59～62，78～83，99～103，119～121，128，140～142，172～178，183～186，189～210.對比分析預測出的牛羊乳αs1-CN抗原表位區(qū)域，從二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示羊乳可能抗原區(qū)域數(shù)目高于牛乳，且它們具有相同抗原區(qū)域189～210.

2.3 牛羊乳αs1-CN親水性、抗原指數(shù)、表面可及性及柔韌性預測結(jié)果

利用DNAStar Protean軟件對αs1-CN(bovine、capra hircus)親水性、抗原指數(shù)、表面可及性及柔韌性進行預測，結(jié)果如圖3所示.

(a)牛乳αs1-CN

(b)羊乳αs1-CN圖3 DNAStar預測牛乳αs1-CN和 羊乳αs1-CN親水性、抗原指數(shù)、 表面可及性和柔韌性

蛋白質(zhì)的親水性、抗原指數(shù)、表面可及性和柔韌性在抗原形成方面起著主要作用，當親水性>0、抗原指數(shù)>0和表面可及性>1時，形成表位的可能性較大[19-21].綜合預測結(jié)果推出牛乳αs1-CN可能抗原表位區(qū)域為17～19，22～26，50～52，63～67，70～74，77～83，85～105，117～122，129～134，145～149，185～210；羊乳αs1-CN可能抗原表位區(qū)域為17～19，27，30～31，35，48～52，55，62～67，70～76，81～84，90～105，117～119，129～134，139～149，205～219.對比分析兩者抗原表位差異得出羊乳αs1-CN抗原表位區(qū)域與牛乳相比，其大多分布在αs1-CN氨基酸序列的C端，且羊乳αs1-CN表位區(qū)域于牛乳表位區(qū)域存在一定的包含重疊關(guān)系.

2.4 B細胞線性抗原表位綜合預測

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和氨基酸殘基的親水性、抗原指數(shù)、表面可及性和柔韌性都是影響B(tài)細胞線性抗原表位的重要因素[22].利用the BepiPred 1.0服務(wù)器對牛乳αs1-CN氨基酸序列的抗原指數(shù)進行預測得到的可能性抗原表位是21，60～68，80～81,85～86，99～102，142～152，173～179，187～208，羊乳αs1-CN可能性抗原表位是26～31，60～70，74～91，100～102， 140～146，187～208.將the BepiPred 1.0、SOPMA、和DNAStar這三種預測軟件得到的抗原表位綜合分析得出牛乳αs1-CN可能抗原表位為22～26，86～87，99～102，118～120，148～149，185～186，189～210，羊乳αs1-CN可能抗原表位為18～19，27，30～31，83～84，99～103，117～119，140～142，205～210.對比分析預測得到的牛羊乳αs1-CN抗原表位，較牛乳αs1-CN相比，羊乳αs1-CN同樣具有較多區(qū)域的抗原表位，且二者存在一定的包含關(guān)系.

2.5 牛羊乳αs1-CN合成肽的設(shè)計

綜合上述可能抗原表位，選擇其長度不同的四條預測表位肽段采用固相合成法合成.分別來自于羊乳αs1-CN命名為：P-1037(26～31，LSPEVP)和P-1040(140～142，EGN)；來自于牛乳αs1-CN命名為：P-1038(189～208，TDAPSFSDIPNPIGSENSEK)和P-1039(99～102，EDVP).

2.6 合成肽免疫反應性鑒定

利用實驗室制備的兔抗牛α-CN多克隆抗體作為一抗，間接ELISA法檢測合成肽的免疫反應性，以P/N>2.1為判斷標準，結(jié)果如圖4示.由圖4可知，合成的四種多肽和α-CN均與α-CN-Ig G呈陽性反應，且α-CN測出的吸光值高于合成的四種多肽；而β-LG與α-CN-IgG呈陰性反應，由此初步說明，合成多肽具有免疫反應性.其免疫原性還需進一步驗證.

圖4 合成多肽免疫反應性鑒定

3 討論

關(guān)于牛乳主要過敏原抗原表位的預測研究報道較多.B Ruite等[23]利用重疊肽的方法發(fā)現(xiàn)牛乳αs1-CN的T細胞表位識別位點即43-66，73-96，91-114和127-180.Picariello G等[24]利用體外模擬胃腸消化后的牛乳蛋白水解液通過在Caco-2細胞的轉(zhuǎn)運吸收研究發(fā)現(xiàn)β-Lg 40～60和125～135具有一定的致敏性.但目前從抗原位點出發(fā)研究羊乳過敏性的報道并不多見，Sanz C L等[25]利用豚鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)豚鼠經(jīng)口給予羊奶、牛奶和抗乳血清時，山羊奶的變應原性低于牛奶，其變應原性可能是由酪蛋白和抗乳血清不同蛋白質(zhì)之間的特異性抗原決定簇引起.本研究對牛羊乳主要過敏原αs1-CN B細胞線性抗原表位進行預測，可為對目前山羊乳的低致敏性及其在預防嬰幼兒牛乳過敏中的應用提供一定的理論和技術(shù)參考.

蛋白引起致敏的前提是它具有抗原性，而抗原表位是蛋白質(zhì)具有抗原性的關(guān)鍵因素，是抗原與抗體特異性識別的基本單位.B細胞線性抗原表位是指抗原表面可被B細胞抗體識別的線性片段.所以，準確預測B細胞線性抗原表位，可為單克隆抗體的制備、羊乳抗原性的研究等奠定一定的基礎(chǔ).該研究首先采用SOPMA網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，DNAStar軟件對牛羊乳αs1-CN氨基酸序列進行對比分析，得出二者氨基酸序列同源性雖較高，但預測出二級結(jié)構(gòu)仍存在差異，其中羊乳αs1-CN β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的數(shù)量較多，如上述利用SOPMA網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器對牛乳αs1-CN二級結(jié)構(gòu)預測得到β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的數(shù)目為3.74%和38.32%，羊乳預測得到的數(shù)目為4.21%和44.39%，明顯大于牛乳.這些差異同牛羊乳αs1-CN氨基酸序列上個別氨基酸的不同存在一定的關(guān)系.其次采用DNAStar軟件對牛羊乳αs1-CN的親水性、抗原指數(shù)、表面可及性和柔韌性預測，由于在肽段1～200位個別氨基酸的不同，預測出的抗原表位在該位存在部分差異且有一定的包含關(guān)系，而在200～214肽位間的氨基酸幾乎無明顯差異，使得此區(qū)段預測出的牛乳αs1-CN抗原表位羊乳αs1-CN也同樣具有該表位.本研究僅采用了生物學軟件對牛羊乳αs1-CN的二級結(jié)構(gòu)，親水性，抗原指數(shù)，表面可及性和柔韌性等預測并通過實驗驗證了所預測氨基酸序列的免疫反應性，為深入研究羊乳過敏原提供一定的理論依據(jù).

在乳過敏性差異方面，該結(jié)果還不能全面的說明羊乳是否可作為低致敏產(chǎn)品代替牛乳作為牛乳過敏患者的直接乳源，還有待對主要過敏原αs2-CN和β-LG等對比分析.但該結(jié)果可初步判定羊乳αs1-CN抗原表位合成多肽具有免疫反應性，后續(xù)進一步通過動物實驗驗證其多肽是否具有免疫原性產(chǎn)生抗體.

4 結(jié)論

該研究綜合三種軟件預測參數(shù)得到牛乳αs1-CN可能抗原表位為22～26，86～87，99～102，118～120，148～149，185～186，189～210，羊乳αs1-CN可能抗原表位為18～19，27，30～31，83～84，99～103，117～119，140～142，205～210.分析比較牛羊乳αs1-CN B細胞線性抗原表位差異，與牛乳αs1-CN抗原表位相比，羊乳αs1-CN同樣具有相當?shù)目乖砦粎^(qū)域.因此，可以初步確定羊乳中雖含有少量的αs1-CN但其仍具有一定的抗原性.通過間接ELISA檢測合成多肽的免疫性，實驗表明合成多肽呈陽性反應，與抗體發(fā)生反應，具有免疫反應性，其免疫原性及過敏原性有待驗證.

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【責任編輯：蔣亞儒】

PredictionofBcellantigenepitopesofα-caseincowandgoatmilkanditsimmunoreactivityidentification

XUE Hai-yan, HAN Bo, LI Shan, CAO Ge

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

2017-08-11

國家自然科學基金項目(31301405)； 陜西省科技廳科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2013KTZB02-02-05(2))； 陜西省教育廳專項科研計劃項目(16JK1088)

薛海燕(1979-)，女，陜西興平人，副教授，博士，研究方向：食品營養(yǎng)與安全

2096-398X(2017)05-0133-06

Q518.1

A