短短芽孢桿菌M01產抗菌物質工藝條件優化及其主要抑菌成分探究

王忠忠， 龔國利,2

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021； 2.西安市微生物藥物工程實驗室， 陜西 西安 710021)

短短芽孢桿菌M01產抗菌物質工藝條件優化及其主要抑菌成分探究

王忠忠1， 龔國利1,2

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021； 2.西安市微生物藥物工程實驗室， 陜西 西安 710021)

采用選育的短短芽孢桿菌株M01進行抗菌活性物質發酵工藝及其主要抑菌成分的研究.通過單因素和正交試驗，優化得出一條發酵生產抗菌物質的最佳工藝，其工藝條件分別為初始pH6.0，接種量8%，發酵溫度28 ℃，發酵周期48 h，優化后生產的抗菌物質的抑菌活性比優化前提高了38.7%.此外，經80%的冷乙醇提取抗菌物質，對其進行透析脫鹽，Sephadex-50凝膠過柱初步分離純化，SDS-PAGE分析發現分子量為62.0 kD、 40.0 kD、 29.0 kD、20.1 kD的蛋白可能是菌株M01抑菌活性物質的主要成分，其中29.0 kD左右的蛋白可能是菌株M01抑菌活性物質的重要成分.

短短芽孢桿菌M01； 抑菌活性； 正交優化； 主要抑菌成分

Abstract:A new strain ofBrevibacillusbrevisM01 was carried out to reserach the main components of the active antibacterial substance and optimize its fermentation conditions.The optimum conditions to produce the antimicrobial substances were as follows:Initial pH6.0,inoculation amount 8%,fermentation temperature 28 ℃ and fermentation cycle 48 h by single factor and orthogonal experiment,after optimization,the activity of antibacterial substances was 38.7% higher than before.In addition,the 80% of cold ethanol was used to extract the antimicrobial substance that was desalted and purified by Sephadex-50 gel column,and SDS-PAGE analysis showed that the protein with molecular weight of 62.0 kD,40.0 kD,29.0 kD and 20.1 kD could be the main component of the antimicrobial active substance of strain M01,and the protein of about 29.0 kD may play an important role in it.

Keywords:BrevibacillusbrevisM01; antimicrobial activity; orthogonal optimization; main antibacterial ingredients

0 引言

短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)于1996年根據遺傳信息的差異性從短芽孢桿菌屬中劃分以來，現已確定的有二十多種，其中大多數菌種都具有重要的生物學意義.

據報道，短短芽孢桿菌(B.brevis)能夠分泌短桿菌肽(gramieidin)、短桿菌酪肽(tyrocidine)、胞外多糖[1]、幾丁質酶[2]以及羥苯乙酯[3]等多種抗菌物質抑制病原菌的生長[4,5].例如，Murray T等[6]探究發現的十肽抗生素，短桿菌肽S已被證明具有高效的殺菌能力. Li S等[2]報道的短短芽孢桿菌產生的高穩定性的幾丁質酶在蔬菜霉菌病的防治中已表現出顯著的抗菌效果.Wafaa M等[7]報道的短短芽孢桿菌產生的抗菌活性物質能夠成功抑制番茄和生菜體內外的灰霉病.Bapat S等[8]報道的短短芽孢桿菌有可能作為一種生防試劑治愈豌豆和黃瓜農作物的鐮刀菌枯萎病.同時，短短芽孢桿菌產生的胞外拮抗物質能夠誘導霉菌病原體的腫脹，導致其細胞破裂而死亡[9].并且該菌能以活體形式寄居到大量的真菌植物病原體中,有效的抑制病原體的生長[10,11]，因此在農業生物防治上具有廣闊的應用前景.

在這項研究中，采用的菌株短短芽孢桿菌M01是由本課題組實驗室分離保存，其產生的抗菌物質對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，黑曲霉等細菌和真菌都具有良好的抗性.因此對該菌產抗菌物質工藝條件的探究具有重要的工業化生產意義，此外，對抗菌活性物質主要成分進行了初步的分析，發現蛋白類物質是該抗菌物質的主要抑菌成分，但具體是哪種蛋白成分還需進一步的確定.

1 材料與方法

1.1 主要原料與試劑

(1)供試菌株：短短芽孢桿菌M01，指示菌：金黃色葡萄球菌CVCC1885.

(2)NA：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂1.5%，pH 7.2.

(3)發酵培養基：豆餅粉1.5%，蛋白胨2.0%，氯化鈣0.20%，Tween-20 1%，pH 7.2.指示細菌培養基NA.

(4)試劑：Sephadex-50、大孔樹脂XAD-16、過硫酸銨、30%丙烯酰胺溶液、 蛋白marker均購自上海生工生物工程有限公司.

1.2 菌株M01生長曲線的測定

取菌株M01菌懸液0.5 mL加入含50 mL的發酵培養基中，輕微振蕩，使菌體分布均勻，將接種后的培養基置于搖床上，37 ℃，220 r/min培養0、4、6、8、10、12、14、16、22、30、38、44、50 h，分別依次取樣，4 ℃保存，待全部完成培養后在波長600 nm下進行比濁測定.以未接種的液態發酵培養基作對照，記錄光密度值OD600，以培養時間為橫坐標，光密度值OD600為縱坐標，繪制菌株M01的生長曲線.

1.3 不同工藝條件對菌株M01產抗菌活性物質的影響

1.3.1 初始pH對菌株M01抑菌活性的影響

以4%(V/V)的接種量接種菌株M01菌懸液至60 mL(300 mL搖瓶，下同)的發酵培養基中，將發酵培養基初始pH值分別調為3、4、5、6、7、8、9、10、11，28 ℃，180 r/min搖瓶培養48 h，取其離心上清液用0.45μm細菌過濾器過濾，吸取濾液230μL，采用瓊脂打孔擴散法分別進行不同初始pH值對菌株M01抑菌活性影響的測定，以空白發酵培養基作對照(CK)，每組試驗重復三次.

1.3.2 溫度對菌株M01抑菌活性的影響

以4%(V/V)的接種量接種菌株M01菌懸液至60 mL的發酵培養基中，分別以24、26、28、30、32、34、37、40、45 ℃的溫度條件，180 r/min搖瓶培養48 h，取其離心上清液用0.45μm細菌過濾器過濾，吸取濾液230μL，采用瓊脂打孔擴散法分別進行不同溫度對菌株M01抑菌活性影響的測定，以空白發酵培養基作對照(CK)，每組試驗重復三次.

1.3.3 發酵周期對菌株M01抑菌活性的影響

以4%(V/V)的接種量接種菌株M01菌懸液至60 mL的發酵培養基中，28 ℃，180 r/min搖瓶培養8、16、24、36、48、60、72、84 h，取其離心上清液用0.45μm細菌過濾器過濾，吸取濾液230μL，采用瓊脂打孔擴散法分別進行不同發酵時間對菌株M01抑菌活性影響的測定，以空白發酵培養基作對照(CK)，每組試驗重復三次.

1.3.4 接種量對菌株M01抑菌活性的影響

分別以2%～14%的接種量接種菌株M01菌懸液至60 mL的發酵培養基中，28 ℃，180 r/min搖瓶培養48 h，取其離心上清液用0.45μm細菌過濾器過濾，吸取濾液230μL，采用瓊脂打孔擴散法分別進行不同接種量對菌株M01抑菌活性影響的測定，以空白發酵培養基作對照(CK)，每組試驗重復三次.

1.4 菌株M01抗菌活性物質的提取方法選擇及提取

1.4.1 菌株M01發酵離心上清液活性物質萃取

以4%(V/V)的接種量接種菌株M01菌懸液至60 mL的發酵培養基中，28 ℃，180 r/min搖瓶發酵48 h，11 000 r/min離心10 min，取其離心上清液用0.45μm細菌過濾器過濾，吸取濾液150 mL，分別加入等體積的正丁醇、氯仿、乙酸乙酯、二甲基亞砜、石油醚等有機溶劑過夜萃取，將有機相與水相分離，水相溶液經0.45μm濾膜過濾，有機相濃縮至5 mL.采用瓊脂打孔擴散法分別測定水相和有機相溶液的抑菌活性，以空白有機溶劑作對照.

1.4.2 大孔樹脂XAD-16吸附法提取菌株M01活性抗菌物質

500 mL的發酵離心上清液加入25 g大孔樹脂XAD-16，室溫條件下，140 r/min振蕩6h，將大孔樹脂與上清液分離，向含有吸附物的大孔樹脂中加入4倍體積的丙酮溶液進行2 h解吸，采用瓊脂打孔擴散法分別測定丙酮解析液和XAD-16吸附過濾后的上清液抑菌活性，以空白丙酮溶液作對照.

1.4.3 硫酸銨分段鹽析法提取菌株M01主要抗菌活性物質

菌株M01發酵離心上清液中緩慢加入固體硫酸銨粉末，使其終濃度分別達到30%、40%、50%、60%、70%、80%，于4 ℃靜止過夜，11 000 r/min離心15 min，分別收集上清及沉淀，將沉淀溶于25 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中，采用瓊脂打孔擴散法分別測定上清及沉淀的抑菌活性，以終濃度為80%的硫酸銨對空白發酵培養基作相同的處理，其沉淀溶于25 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中作對照.

1.4.4 低溫乙醇沉淀法提取菌株M01主要抗菌活性物質

菌株M01發酵離心上清液中緩慢加入冰冷無水乙醇，使其終濃度分別達到30%、40%、50%、60%、70%、80%，于4 ℃靜止過夜.11 000 r/min離心15 min，分別收集上清及沉淀，將沉淀溶于25 mmol/L PBS緩沖液中，以終濃度為80%的冷乙醇對空白發酵培養基作相同的處理，其沉淀溶于25 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)中作對照.采用瓊脂打孔擴散法分別測定上清及沉淀的抑菌活性.

1.5 菌株M01胞外抗菌粗提物初步純化

經80%冰冷無水乙醇沉淀下來的抗菌活性物質溶解于25 mmol/L PBS緩沖液中，置于分子量為8～14 kDa的透析袋中透析脫鹽，以5%的柱床體積上樣量進行Sephadex-50過柱純化，流速0.4 mL/min，每管8 mL收集洗脫液(緩沖液35 mmol/L Tris-HCl)，將收集管內的洗脫液置于透析袋內，PEG20000包埋濃縮30 min，采用瓊脂打孔擴散法測定各收集管洗脫液抑菌活性.

1.6 SDS-PAGE分析

取具有抑菌活性組分的各收集管的濃縮液16μL至200μL的Ep管中，加入4μL蛋白上樣緩沖液，混勻，沸水浴煮沸10 min使其充分變性，加樣開始電泳分析.SDS-PAGE電泳條件：配膠：5%的濃縮膠，15%的分離膠，電壓：濃縮恒壓90 V，分離恒壓160 V.

2 結果與討論

2.1 菌株M01生長曲線

菌株M01生長曲線如圖1所示.由圖1可以看出，菌株M01的指數生長期處于4～18 h，18 h后是該菌的生長穩定期，根據此生長曲線進行試驗，發現菌株M01在生長過程中抗菌物質活性變化趨勢如圖2所示.由圖2可知，菌株M01在指數生長后期就開始產抗菌物質，生長穩定后期抗菌物質的抑菌活性達到最大.這一發現可為菌株種子液的制備以及發酵周期的選定提供理論參考，提高抗菌物質的產量及生產效率.

圖1 菌株M01生長曲線

圖2 菌株M01生長過程抗菌物質 活性變化趨勢

2.2 不同工藝條件對菌株M01發酵生產抗菌物質的影響

2.2.1 抗菌物質生產周期的確定

發酵時間對菌株M01產生的抗菌物質的抑菌活性影響如圖3所示.由圖3可知，菌株M01在發酵開始后的前48 h，該抗菌物質的抑菌活性隨著時間的增加而提高，發酵開始后的48～84 h，該抗菌物質的抑菌活性隨著時間的增加而下降，因此生產該抗菌物質的最適發酵時間是48 h，此時抗菌物質的抑菌活性最高，其抑菌直徑達15.6 mm.

圖3 發酵時間對抗菌物質活性影響

2.2.2 發酵溫度對菌株M01發酵生產抗菌物質的影響

發酵溫度對菌株M01產生抗菌物質的抑菌活性大小有著重要的影響，不同的溫度條件下產生的抗菌物質的抑菌活性有所差異，溫度對菌株M01產生的抗菌物質抑菌活性大小的影響趨勢如圖4 所示.由圖4可知，在研究的溫度變化范圍內，當發酵溫度處于28 ℃時，菌株M01產生的抗菌物質的抑菌活性最好，其抑菌直徑達15.87 mm，總體的變化趨勢是隨著溫度的增加，抗菌物質的抑菌活性先增大后減小.

圖4 溫度對抗菌物質活性影響

2.2.3 初始pH對菌株M01抑菌活性的影響

培養基初始pH對菌株M01產生抗菌物質的抑菌活性影響如圖5所示.由圖5可知，將發酵培養基初始pH分別調為3、4、5后，發酵液中無抑菌活性物質產生，這可能是該菌體自身對酸較敏感，超高了其耐受范圍，限制了菌體的生長，從而影響了菌株M01分泌活性抗菌物質.還可能是發酵液中一定酸度的存在，改變了菌株M01代謝調控通路，使該菌不能產生抗菌活性物質.當培養基初始pH分別調為6～11后，發酵液中有明顯的抑菌活性物質產生，且pH調為7時，菌株M01產生的抗菌物質抑菌活性最高.從圖5進一步可以看出，培養基初始pH對菌株M01抗菌物質生產非常重要.

圖5 初始pH對抗菌物質活性影響

2.2.4 接種量對菌株M01抑菌活性的影響

接種量對細菌菌株的生長及產物的分泌有著重要的影響，一般來說，接種量越小，細菌生長的遲滯期越長，菌體生長緩慢，發酵周期延長，增加生產成本；接種量過大，發酵底物消耗過快，菌體大量形成，不利于菌體代謝產物的形成.不同接種量對菌株M01產生的抗菌物質抑菌活性的影響如圖6所示.由圖6可知，當發酵培養基的接種量為6%時，抗菌物質的抑菌活性最好.

圖6 接種量對抗菌物質活性影響

2.2.5 發酵工藝參數正交試驗優化

以單因素實驗結果為正交優化依據，如表1所示選定正交試驗的因素水平，并以抗菌物質的抑菌直徑為正交優化試驗的測定指標進行試驗，通過直觀的極差分析，得到產抗菌物質的最佳工藝.

表1 發酵工藝參數因素水平

發酵工藝優化正交試驗分析結果如表2 所示.由表2可知，短短芽孢桿菌M01產抗菌物質的最佳發酵工藝為A2B1C2D3，即發酵溫度為28 ℃，發酵培養基初始pH 6.0，發酵周期48 h，接種量8%，抗菌物質的抑菌直徑達27.6 mm.對實驗結果進行極差分析可知，RC>RB>RA>RD.

即選取的影響因素對抗菌物質的抑菌活性影響主次順序為：發酵周期>發酵培養基初始pH>發酵溫度>接種量，表明發酵時間對抗菌物質的抑菌活性影響最為明顯，發酵培養基初始pH次之，發酵溫度第三，接種量影響相對最小.

表2 發酵工藝的正交試驗優化

2.2.6 發酵工藝優化前后的抑菌活性

菌株M01發酵工藝優化前后產抗菌物質的抑菌活性大小如圖7所示.由圖7可知，發酵工藝優化前得到的抗菌物質的抑菌直徑為18.6 mm，發酵工藝優化后菌株M01產生的抗菌物質的抑菌直徑為25.8 mm，比優化前產生的抗菌物質的抑菌活性提高了38.7%，表明優化后的發酵工藝能夠明顯的提高抗菌物質的抑菌活性.此外，研究發現優化后的發酵工藝同樣適用于發酵罐(15 L)發酵，瓊脂打孔擴散法測定發酵罐發酵產生的抗菌物質的抑菌活性可達28.3 mm，因此該工藝的開發對于菌株M01抗菌物質的批量生產具有重要經濟效益及社會價值.

1：工藝優化后抗菌物質的抑菌活性；2：工藝優化前抗菌物質的抑菌活性；CK1 ：空白發酵培養基；CK2 ：無菌水圖7 菌株M01發酵工藝優化驗證

2.3 菌株M01抗菌活性物質的提取

采用正丁醇、氯仿、乙酸乙酯、二甲基亞砜、石油醚過夜萃取菌株M01發酵離心上清液，分別得到有機相和水相，經抑菌活性測定，有機相溶液對指示細菌無抑菌活性，而水相溶液對指示細菌有明顯的抑菌活性，且與未經萃取的上清液抑菌活性基本一致.這說明了以上有機試劑均無法達到萃取上清液中抗菌物質的目的.其原因可能是該抗菌活性物質是極性較大的化合物.以大孔樹脂XAD-16對上清液中的抗菌物質進行提取，發現經大孔樹脂XAD-16吸附后，只有部分抗菌物質能夠被提取出來，因此大孔樹脂XAD-16吸附提取法無法達到完全提取抗菌物質的目的.試用硫酸銨分段鹽析法提取菌株M01代謝產生的主要抗菌活性物質，試驗結果發現硫酸銨分段鹽析法也無法將上清液中的抗菌物質提取出來.

試用低溫乙醇沉淀法對菌株M01發酵離心上清液中的主要抗菌活性物質進行提取，等體積的上清液緩加入不同飽和度的冰冷無水乙醇，4 ℃冰箱靜止過夜，離心分離，分別測定不同飽和度的沉淀及上清液的抑菌活性，實驗結果如圖8所示.

圖8 不同乙醇濃度對抗菌物質的提取

由圖8可知，隨著冰冷無水乙醇飽和度的增加，處理后的沉淀的抑菌活性不斷增強，至80%飽和度處理后，沉淀對指示菌的抑菌活性達到最強，但處理后的上清液中的抑菌活性隨著冰冷無水乙醇飽和度的增加而下降，至80%飽和度處理后，上清夜中的抑菌活性完全消失，表明該法能夠將上清液中主要抗菌物質完全提取出來，且以80%乙醇為最適乙醇沉淀濃度.

2.4 菌株M01主要抑菌活性成分初步分析

在本研究中，菌株M01的主要抑菌活性物質不能被有機溶劑萃取，也不能被硫酸銨沉淀，但可以被終濃度為80%的冷乙醇沉淀，與短短芽孢桿菌HAB-5[12]、FM4B[13]和JK2[1]等報道的結果類似.將經80%乙醇沉淀下來的抗菌活性物質溶解于25 mmol/L PBS緩沖液中，置于透析袋內，24 h透析脫鹽，經Sephadex-50凝膠層析，收集58管洗脫液，每管8 mL,將其二倍稀釋在280 nm條件下測定各管的吸光值，其結果如圖9所示.

由圖9可知，在收集的4～18管洗脫液中，隨著收集管數的增加，洗脫液的吸光值呈現先增大后減小的變化趨勢，表明各管洗脫液中蛋白類物質的濃度同樣先增大后減小，且在第9管其濃度達到最大.吸取各收集管中溶液200μL進行抑菌活性測定發現5～16管具有抑菌活性，其抑菌活性的大小與收集管內蛋白類物質的濃度成正比.其余各收集管洗脫液均無抑菌活性.采用PEG20000對其余各收集管洗脫液進行30 min的透析濃縮，瓊脂打孔擴散法測定抑菌活性發現4、17、18收集管也有抑菌活性，由此可初步分析發酵上清液中的主要抗菌活性成分是蛋白類物質.

圖9 不同收集管洗脫液的吸光值測定

2.5 SDS-PAGE分析

經葡聚糖凝膠初步純化后具有抑菌活性的洗脫液跑SDS-PAGE凝膠電泳如圖10所示.由圖10可知，不同的收集管中蛋白質的分子量各不相同，同時也可以進一步看出，蛋白質濃度的大小與各收集管中蛋白質的種類與大小密切相關，通過抑菌活性測定發現9號收集管中的抗菌物質抑菌活性最好，15號管中的抗菌物質也具有良好的抗指示菌活性，但相對其余收集管抑菌活性較弱，由此可以初步說明分子量為62.0 kDa、40.0 kDa、29.0 kDa、20.1 kDa的蛋白都可能是菌株M01抑菌活性物質的主要成分，其中29.0 kDa左右的蛋白可能是菌株M01抑菌活性物質的重要成分.這與報道的HAB-5[12]的主要抑菌物質可能是分子量為60.0 kDa、59.0 kDa、43.5 kDa、和14.4 kDa大小的肽類物質，其中14.4 kDa更可能是HAB-5主要抑菌物質的分子量的研究結果極為相似.

圖10 菌株M01抑菌活性物質 的聚丙烯酰胺凝膠電泳

3 結論

本研究對生防菌短短芽孢桿菌M01產生抗菌物質的工藝條件進行優化，并得到了產抗菌活性物質的最佳發酵工藝條件：初始pH6.0，接種量8%，發酵溫度28 ℃，發酵周期48 h， 在該工藝條件下，菌株M01產生的抗菌物質對金黃色葡萄球菌CVCC1885抑菌活性比優化前提高了38.7%，采用80%乙醇沉淀法提取抗菌活性物質，得抗菌活性粗提物，對其進行透析脫鹽，過Sephadex-50凝膠層析柱初步分離純化，SDS-PAGE分析發現分子量為29.0 KD左右的蛋白可能是菌株M01抑菌活性物質的重要成分.具體哪一種分子量的蛋白是抗菌物質的主要成分還需進一步的純化做質譜分析.

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【責任編輯：陳佳】

OptimizationoftechnologicalconditionsforproductionantibacterialsubstancesfromBrevibacillusbrevisM01andinvestigationofthemainantibacterialcomponents

WANG Zhong-zhong1， GONG Guo-li1,2

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China； 2.Xi′an Microbiology and Pharmaceutical Engineering Laboratory, Xi′an 710021, China)

2017-06-21

陜西省教育廳自然科學專項科研計劃項目(14JK1101)； 西安市未央區科技計劃項目(201309)

王忠忠(1992-)，男，寧夏平羅人，在讀碩士研究生，研究方向：微生物發酵

2096-398X(2017)05-0145-06

Q939.92

A