RS3型秈米抗性淀粉制備方法對其結構和理化性質的影響

歐陽夢云 王 燕 趙傳文

(1. 湖南農業大學食品科技學院，湖南 長沙 410128；2. 長沙凱雪糧油食品有限公司，湖南 長沙 410008)

RS3型秈米抗性淀粉制備方法對其結構和理化性質的影響

歐陽夢云1王 燕1趙傳文2

(1. 湖南農業大學食品科技學院，湖南 長沙 410128；2. 長沙凱雪糧油食品有限公司，湖南 長沙 410008)

以微波預糊化秈米淀粉為原料，研究超聲間歇式輔助雙酶法和晶種誘導-雙酶法對RS3型秈米抗性淀粉結構和理化性質的影響。結果表明，原料淀粉呈多面體結構，表面邊界棱角分明，顆粒晶型為A型，結晶度僅為8.9%；而超聲間歇式輔助雙酶法和晶種誘導—雙酶法所得RS3型秈米抗性淀粉，表面變得粗糙，凹凸不平，出現“蜂窩” 狀結構，其溶解度、膨脹度及持水力均降低，顆粒晶型表現為致密且穩定的B型或B+V型結構，結晶度最高可達20.10%，且在RS3形成過程中無新官能團產生，淀粉的化學結構未發生改變。兩種制備工藝在酶添加順序上，先添加普魯蘭酶后添加異淀粉酶可較優地促進淀粉晶體形成有序結構。

RS3型秈米；抗性淀粉；X-射線衍射；紅外光譜

Abstract：The indica starch pregelatinized by microwave as raw material, the effect of ultrasonic auxiliary-dual enzyme method and seed induced-dual enzyme method on the structure and physicochemical properties of indica rice resistant starch of type RS3were researched in this study. The results showed that the structure of the raw starch was polyhedron, the edge of the surface was distinct, the crystal form was type A, and the crystallinity was only 8.9%. While the structure of RS3were made by ultrasonic auxiliary-dual enzyme method and seed induced-dual enzyme method became rough and uneven, the solubility, swelling degree and water holding capacity were decreased, the crystal forms were dense and stable type B or type B+V, and the highest crystallinity was 20.10%. There was no new functional group was formed during the formation process of RS3and their chemical structure has not changed. The enzyme addition sequence showed that pullulanase was added before isoamylase better to promote starch crystal formation of ordered structure.

Keywords：indica rice resistant starch of type RS3; X-ray diffraction; infrared spectroscopy

RS3型抗性淀粉又稱為回生或重結晶淀粉，這類淀粉即使經加熱處理，也難以被淀粉酶類消化，RS3除具有抗性淀粉獨特的生理功能外，還具有晶體粒度細小、風味良好、顏色白皙、溶解度低等特點，可很好地替代膳食纖維，作為一種良好的食品功能因子運用于保健食品的研制和開發[1-3]。RS3主要由回生重結晶的直鏈淀粉組成，因此淀粉中直鏈淀粉含量高低直接影響RS3產率。目前國內外以RS3作為食品功能因子的研究還處于基礎階段，研發的產品主要有主食制品[4-5]、烘焙食品[6-7]、飲料及發酵制品[8-9]、膨化食品[10-11]等。RS3制備工藝上的創新及產率的提高日益成為食品科學家和營養學家研究的熱點之一。秈米因其粗糙的口感、易碎、較差的加工品質和易陳化等劣勢，商品價值極低。研究[12]表明，秈米淀粉中直鏈淀粉含量遠高于粳米和糯米，是極好的生產抗性淀粉原料，而自然條件下秈米淀粉中僅含抗性淀粉1.0%～2.1%。歐陽夢云等[13]對超聲間歇輔助異淀粉酶和普魯蘭酶分步脫支制備RS3型秈米抗性淀粉的工藝進行了優化，此方法避免了目前研究中使用液化酶導致直鏈淀粉損失且產生大量糊精影響RS3生成等負面影響，但尚未對試驗所得RS3的理化性質做出分析。晶種誘導技術是指在分子重結晶前期晶核將要形成時加入少量晶種，通過有效降低溶液過飽和度，縮短析晶時間，提高產率[14]。馬鈴薯含有豐富的直鏈淀粉，可作為制備RS3晶種的原料。晶種誘導技術目前廣泛應用于分子篩領域[15-17]，自2013年起已有少部分文獻以該方法制備抗性淀粉[18-19]，而以晶種誘導復合異淀粉酶、普魯蘭酶的分步脫支酶解過程制備RS3型秈米抗性淀粉的研究還未見報道。

本研究以微波預糊化秈米淀粉為原料，擬采用超聲間歇式輔助雙酶法和晶種誘導-雙酶法制備RS3型秈米抗性淀粉，并對試驗所得RS3的溶解度、膨脹度和持水力，及掃描電鏡、X-射線衍射、傅里葉紅外光譜結果進行分析，探究超聲間歇式輔助雙酶法和晶種誘導-雙酶法促進秈米淀粉回生的原因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秈米碎米：購自湖南邵陽；

馬鈴薯淀粉：市售；

異淀粉酶：50 000 U/g，天津拓程生物科技有限公司；

普魯蘭酶：1 000 ASPU/mL，江蘇銳陽生物科技有限公司；

葡萄糖淀粉酶：≥100 Units/mg，上海瑞永生物科技有限公司；

耐高溫α-淀粉酶：≥4 000 U/g，上海瑞永生物科技有限公司；

胃蛋白酶：≥1 200 U/g，國藥集團化學試劑有限公司；

其他試劑均為化學純國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫水浴鍋：B-260型，上海亞榮生化儀器廠；

美的微波爐：EG23B-DC(F)型，廣東美的微波爐制造有限公司；

數控超聲波清洗器：KQ-100DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9240A型，上海飛越實驗儀器有限公司；

紫外分光光度計：UV-2450型，日本島津公司；

傅里葉紅外光譜儀：VECTOR33型，德國Bruker公司；

射線衍射儀：D/MAX-3AX型，日本理學公司；

掃描電子顯微鏡：JSM-6360LV型，日本電子公司。

1.3 方法

1.3.1 微波預糊化秈米淀粉的制備 參考文獻[13,20]制備微波預糊化秈米淀粉Mic-PS。

1.3.2 RS3型秈米抗性淀粉的超聲間歇式輔助雙酶法制備

以微波預糊化秈米淀粉為原料，利用超聲波間歇式輔助異淀粉酶和普魯蘭酶的分步脫支酶解制備RS3型秈米抗性淀粉，具體步驟參照文獻[21]。RS3型秈米抗性淀粉的超聲間歇式輔助雙酶法制備工藝中異淀粉酶和普魯蘭酶的添加順序與試樣名稱見表1。

表1 雙酶添加順序與試樣名稱

1.3.3 RS3型秈米抗性淀粉的晶種誘導-雙酶法制備 稱取10 g馬鈴薯全粉，用蒸餾水配制淀粉質量分數為10%的馬鈴薯淀粉乳，85 ℃水浴條件下預糊化30 min，直至淀粉乳呈透明凝膠狀后再于120 ℃高壓條件下處理30 min，冷卻后置于4 ℃冰箱中冷藏24 h。參考Goni法[22]對淀粉乳純化處理后制得RS3型馬鈴薯抗性淀粉濕晶種。

稱取適量微波預糊化秈米淀粉，用pH為5.0的磷酸鹽緩沖溶液配制淀粉質量分數為10%的淀粉乳，85 ℃恒溫水浴條件下處理30 min，降溫至50 ℃，恒溫條件下添加異淀粉酶8 U/g，異淀粉酶酶解4 h，85 ℃恒溫水浴條件下滅酶10 min，冷卻，用0.1 mol/L HCl調pH至4.5，60 ℃恒溫水浴條件下添加普魯蘭酶8 U/g，普魯蘭酶酶解3.5 h，85 ℃恒溫水浴條件下滅酶10 min，冷卻至40 ℃，添加濕晶種5%，混勻后將淀粉乳迅速置于4 ℃冰箱回生24 h。RS3型秈米抗性淀粉的純化參考Goni法[22]，70 ℃烘箱中烘干8 h，備用。RS3型秈米抗性淀粉的晶種誘導-雙酶法制備工藝中異淀粉酶和普魯蘭酶的添加順序與試樣名稱見表2。

表2 雙酶添加順序與試樣名稱

1.3.4 顆粒形態 利用掃描電鏡分析Mic-PS、U-PI-RS3、U-IP-RS3、S-PI-RS3和S-IP-RS3顆粒形態[23]。

1.3.5 溶解度、膨脹度及持水力的測定 Mic-PS、U-PI-RS3、U-IP-RS3、S-PI-RS3和S-IP-RS3的溶解度、膨脹度和持水力測定參考文獻[24～26]。

1.3.6 X-射線衍射 利用X-射線衍射分析Mic-PS、U-PI-RS3、U-IP-RS3、S-PI-RS3和S-IP-RS3晶體形態。衍射條件：特征射線CuKα，石墨單色器，管電壓40 kV，管電流30 mA，掃描范圍2θ為470°，掃描速度10/min[27]。試樣的結晶度為微晶區面積與微晶區和亞微晶區面積和的比值[28-29]。

1.3.7 傅里葉紅外光譜 利用傅里葉紅外光譜分析Mic-PS、U-PI-RS3、U-IP-RS3、S-PI-RS3和S-IP-RS3分子基團變化[30]。

2 結果與分析

2.1 RS3型秈米抗性淀粉顆粒形態分析

由圖1可知，微波預糊化秈米淀粉Mic-PS呈多面體狀，周圍邊界清晰，棱角分明，表面有些許爆裂微孔和酥松絮狀物。其原因可能是水分子在微波高頻電場的作用下反復快速取向轉動，摩擦加劇生熱，導致淀粉分子在高溫下爆裂。這些酥松微孔增大了脫支酶與底物的接觸面積。U-IP-RS3、U-PI-RS3、S-IP-RS3和S-PI-RS3都失去原有淀粉顆粒形貌，無明顯邊界，表面變得透明光亮，都呈現明顯的“蜂窩”狀結構，S-IP-RS3出現了深陷溝壑，依稀還可以看見片層樣結構，U-PI-RS3表面變得凹凸不平，塌陷結構非常明顯。分析原因可能是超聲波的空穴作用使淀粉分子內產生局部高溫，淀粉顆粒吸水膨脹，超聲停止后，取出物料，淀粉瞬間遇冷而形成分子內外壓差，顆粒表面形成塌陷。淀粉分子充分發生水合作用凝膠化后，異淀粉酶和普魯蘭酶都專一性破壞支鏈淀粉的α-1,6糖苷鍵，生成大量鏈長不等的直鏈淀粉，在冷藏過程中，呈無序態的直鏈淀粉通過氫鍵重新相互締合形成穩定的雙螺旋結構，晶種誘導工藝因體系中添加的少量RS3晶種而降低了溶液過飽和度，直鏈淀粉不僅可相互締合形成致密微晶束，還可使直鏈淀粉在較低的過飽和度時以外加晶種為籽晶包覆長晶。RS3晶體的網狀結構致密而堅硬，具有較強的抗酶解能力。

圖1 原料淀粉與RS3的電鏡掃描照片

2.2 制備方法對RS3型秈米抗性淀粉溶解度、膨脹度、持水力的影響

游離直鏈淀粉易溶于水，是影響淀粉溶解度的主要原因。淀粉懸浮液在加熱過程中，其顆粒微晶束結構發生改變呈多孔片層狀，內部直鏈淀粉從膨脹的淀粉顆粒小孔中游離出來而被溶解，水分子也會滲入小孔進入顆粒內部，使淀粉分子發生水合作用形成一種共聚膠狀物，促使體積膨脹，直鏈淀粉和支鏈淀粉的極性分子與水分子發生締合，表現出一定的持水能力。淀粉的膨脹程度也由淀粉中支鏈淀粉含量決定，可反映出淀粉晶體結構的強弱以及淀粉顆粒的緊密性。淀粉的膨脹度與持水力呈正相關。由表3可知，Mic-PS的溶解度、膨脹度及持水力均較高。分析原因可能是Mic-PS表面產生的大量爆裂微孔為分子內直鏈淀粉的溶出提供了良好的“通道”，此時試樣中支鏈淀粉含量也較高，所以溶解度和膨脹度都較高，持水力也維持在較高水平，也可說明Mic-PS的晶體結構很弱，顆粒松散，結構易改變。與Mic-PS相比，U-IP-RS3、U-PI-RS3、S-IP-RS3及S-PI-RS3溶解度、膨脹度及持水力都出現了很大程度的下降，兩種制備工藝條件淀粉經異淀粉酶和普魯蘭酶分步脫支處理后，直鏈淀粉含量大幅度增加而水溶解程度降低，是因為直鏈淀粉在冷藏過程中通過氫鍵相互締合成致密的雙螺旋結構，最后形成難以復水的高聚結晶體，在加熱過程中也不被分解。說明兩種制備工藝均能形成結構致密，穩定性較好的RS3晶體，特別是S-IP-RS3，其表現出的低溶解度和膨脹度，非常適宜作為飲料的食品功能添加因子，可提高不透明度和懸浮度。

表3原料淀粉與RS3的溶解度、膨脹度及持水力

Table 3 Solubility, swelling power and water holding capacity of raw starch and indica RS3 %

2.3 X-射線衍射分析

淀粉晶體顆粒是一種含有非結晶區和結晶區的多晶聚合物，對其進行一定角度內的X-射線衍射有衍射峰出現，根據其特征峰出現位置可判斷各種淀粉的結晶晶型，分為A、B、C、V 四類，一般經過糊化后的淀粉含有V型結晶。相對結晶度可表示為淀粉顆粒中的微結晶區面積比上亞微結晶區面積與微結晶區面積之和，根據30°以內的衍射峰值可計算顆粒的相對結晶度，結果見表4。

由圖2、3可知，微波預糊化淀粉Mic-PS在15°，17°，19°，23°處有強衍射峰，13°處有較微弱衍射峰，說明Mic-PS的結晶結構為A型。與Mic-PS相比，U-IP-RS3在15°，17°處無明顯衍射峰，在22°，24°處出現較弱衍射峰，表現為弱B型結構，說明超聲輔助先異淀粉酶后普魯蘭酶的脫支酶解工藝使秈米淀粉的結晶區遭受破壞，低溫凝沉重結晶效果不理想；而U-PI-RS3、S-IP-RS3及S-PI-RS3均在15°，17°，22°，24°處出現明顯衍射峰，在13°，20°處也出現了較明顯衍射峰，表現為B+V型結構，且晶種誘導輔助先異淀粉酶后普魯蘭酶的脫支酶解工藝制得的S-IP-RS3表現出特征衍射峰最為強烈，其B+V型結晶結構最為穩定。表現出V型結構除因淀粉糊化導致，還可能是脫支酶對秈米支鏈淀粉的脫支處理生成了較多的直鏈淀粉，其與原料中未脫除干凈的脂質作用形成復合物，這種復合物表現出較強穩定性。

圖2 原料淀粉與超聲輔助雙酶法制得RS3 的X-射線衍射圖Figure 2 X-ray diffraction pattern of raw starch and indica RS3 prepared by ultrasonic auxiliary-dual enzyme method

圖3 原料淀粉與晶種誘導-雙酶法制得RS3的X-射線衍射圖Figure 3 X-ray diffraction pattern of raw starch and indica RS3 prepared by seed induced-dual enzyme method

樣品相對結晶度/%晶型結構Mic-PS8.96AU-IP-RS315.82BU-PI-RS317.81B+VS-IP-RS318.69B+VS-PI-RS320.10B+V

2.4 紅外光譜分析

由圖4可知，Mic-PS、U-IP-RS3、U-PI-RS3、S-IP-RS3和S-PI-RS3的紅外光譜基本輪廓相似，說明兩種制備RS3型秈米抗性淀粉的工藝過程中沒有新官能團產生，其化學結構未發生改變。圖譜在基團頻率區(4 000～1 350 cm-1)和指紋區(1 350～400 cm-1)產生的較小差異屬于物理變化。3 740 cm-1歸屬為淀粉—OH的伸縮振動；3 404 cm-1處出現的寬而強的吸收峰為羥基的伸縮振動；1 478 cm-1為—CH2的彎曲振動峰；1 182 cm-1附近的峰為淀粉中C—O和C—C的伸縮振動，屬于淀粉規則線團結構，可表示為淀粉結晶區的結構特征；1 020 cm-1為氫鍵的變化吸收峰；950 cm-1為吡喃環的非對稱伸縮振動。與Mic-PS相比，U-PI-RS3、S-IP-RS3和S-PI-RS3都出現了非常明顯的—OH伸縮振動峰，其原因可能是異淀粉酶和普魯蘭酶對支鏈淀粉的脫支作用，使體系中直鏈淀粉含量增加，促使更多—OH生成。U-PI-RS3、U-IP-RS3、S-PI-RS3和S-IP-RS3在1 478 cm-1附近的—CH2彎曲振動都增強，說明淀粉經超聲輔助雙酶法和晶種誘導-雙酶法處理后，產生了更多碳不飽和鍵。4種RS3在1 182 cm-1處的吸收峰均增強，說明兩種工藝的處理均使淀粉晶體排列更為有序，5種淀粉在1 182 cm-1處的吸收峰強弱為S-PI-RS3>U-PI-RS3>S-IP-RS3>U-IP-RS3>Mic-PS，說明先添加普魯蘭酶后添加異淀粉酶可較優地促進淀粉晶體形成有序結構。

圖4 原料淀粉與RS3的紅外光譜圖

3 結論

(1) 微波預糊化秈米淀粉有明顯的邊界，呈多面體狀；而RS3秈米抗性淀粉失去原有淀粉形貌，表面呈現“蜂窩”狀、溝壑及片層樣結構，晶體結構致密且堅硬。

(2) 超聲間歇式輔助雙酶法和晶種誘導-雙酶法制得RS3的溶解度、膨脹度和持水力均低于微波預糊化秈米淀粉，表明兩種制備工藝都能制得穩定性好，結構致密，不易被淀粉酶類水解的RS3晶體。

(3) 微波預糊化秈米淀粉為A型結構，結晶度僅為8.96%；晶種誘導-雙酶法制得RS3均表現為B+V型結構；超聲間歇式輔助雙酶法，當酶添加順序為先異淀粉酶后普魯蘭酶時，所得RS3表現為B型結構，當酶添加順序為先普魯蘭酶有異淀粉酶時，所得RS3呈現出B+V型結構。說明晶種誘導-雙酶法較超聲間歇式輔助雙酶法更能有效促進秈米淀粉回生，試驗所得RS3的結晶度最高可達20.10%。

(4) 微波預糊化秈米淀粉與超聲間歇式輔助雙酶法和晶種誘導-雙酶法制得RS3的紅外光譜圖基本輪廓相似，說明兩種制備工藝均未改變秈米淀粉的化學結構。根據兩種制備工藝所得RS3在淀粉結晶區(1 182 cm-1)附近的吸收峰強弱，表明在酶添加順序上，以先添加普魯蘭酶后添加異淀粉酶可較優地促進RS3生成。

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Effect of preparation method on physical and chemical properties of indica rice resistant starch of type RS3

OU-YANG Meng-yun1WANGYan1ZHAOChuan-wen2

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China; 2.ChangshaKaixueGrainandOilFoodCo.,Ltd.,Changsha,Hunan410008,China)

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.08.004

歐陽夢云，女，湖南農業大學在讀碩士研究生。

王燕(1968—)，女，湖南農業大學教授，博士。 E-mail：693675748@qq.com

2017—05—09