產銀杏內酯內生真菌的分離與鑒定

陳小明 何福林 李志忠 袁志輝

(1. 湖南科技學院化學與生物工程學院，湖南 永州 425199；2. 湖南省銀杏工程技術研究中心，湖南 永州 425199；3. 湘南優勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，湖南 永州 425199；4. 湖南省恒偉藥業股份有限公司，湖南 永州 425199；5. 永州市畜牧水產局，湖南 永州 425199)

產銀杏內酯內生真菌的分離與鑒定

陳小明1,2,3,4何福林1,2,3李志忠5袁志輝1,2,3

(1. 湖南科技學院化學與生物工程學院，湖南 永州 425199；2. 湖南省銀杏工程技術研究中心，湖南 永州 425199；3. 湘南優勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，湖南 永州 425199；4. 湖南省恒偉藥業股份有限公司，湖南 永州 425199；5. 永州市畜牧水產局，湖南 永州 425199)

利用組織塊培養法從健康的銀杏根、莖中分離得到116株內生真菌。通過高效液相色譜(HPLC)法對內生真菌的代謝產物進行分析，最終篩選出1株能夠產銀杏內酯的內生真菌，利用標準曲線法測定其發酵液和菌絲體中總內酯產量約為11.4 mg/L。形態學特征和真菌rDNA間隔序列(internal transcribed spacer，ITS)的系統進化分析結果表明，該菌株屬于毛霉屬，為產銀杏內酯內生真菌的首次報道。

銀杏；內生真菌；內酯類化合物；鑒定

Abstract： In the present study, the method of tissue culturing was used to isolate the endophytic fungi from healthy ginkgo roots and stems. After repeated separation and purification, 116 Ginkgo endophytes were isolated. Metabolites of these fungi were preliminarily analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC), and a ginkgolide producing endophyte strain was finally screened out. The production of ginkgolides by this strain was more than 11.4 mg/L. The endophytic fungi strain was identified asMucorspp. by morphology characteristics and phylogenetic analysis of internal transcribed spacer (ITS), and It was the first report in the ginkgolides producing endophytic fungus fromGinkgobiloba.

Keywords：Ginkgobiloba; endophytes; ginkgolides; identification

植物內生微生物是指在植物組織內部度過其全部或部分生命周期的所有微生物[1-2]。內生微生物對藥用植物具有重要的誘導作用[3]，能轉化植物次生代謝產物[4]，可促進植物有效成分的合成和積累[5]。且部分植物內生微生物可體外培養，通過基因工程或工業發酵手段可大量獲得結構新穎、活性獨特的次生物質，使得內生微生物成為活性天然產物資源開發和研究的熱點之一[6]。

銀杏是一種古老的藥食兩用植物[7]，多個部位均可入藥，如銀杏果中的某些蛋白質具有抗氧化劑和抗菌的作用[8]。最常見的入藥物質是銀杏提取物(Extracts ofGinkgobiloba, EGb)，其主要有效成分是黃酮類和萜內酯類化合物[9]，且EGb是目前得到銀杏內酯的唯一途徑[10]，且受限于含量低、分離純化困難和來源單一。銀杏內生微生物具有合成與宿主植物相同或相似的活性成分的功能[11]，但產銀杏內酯內生真菌的分離研究僅集中在中國少數幾家單位。嚴鑄云等從銀杏組織中分離到的內生真菌發酵液進行檢測發現，4株曲霉屬、1株盤長孢屬、1株色串孢屬和1株組絲菌屬共7株內生真菌能夠產生銀杏內酯C或其類似物[12]；在此基礎上進一步篩選出一株銀杏內酯B產量較高的煙曲霉原變種FG052，總內酯產量為0.13 mg/mL[13]；對該菌株進行紫外線和亞硝酸復合誘變并優化發酵條件后，其產量較出發菌株提高了56%[14]。包飛等[15]從分離到的109株銀杏內生真菌中篩選出一株產銀杏內酯B的卵形孢霉屬菌株，發酵產量為9.3 mg/L。Qian等[10]也獲得了一株產白果內酯的銀杏內生真菌PestalotiopsisuvicolaGZUYX13。Cui等[16]篩選到一株同時產銀杏內酯A、B、C和白果內酯的內生菌株尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)SY0056。而對于自然界常見且已在銀杏組織中檢測到的毛霉屬(Mucorsp.)真菌，尚未見其具有產萜內酯類物質能力的報道。本研究以銀杏為研究對象，利用組織塊分離法從根、莖等部位分離內生真菌，并從中篩選出產銀杏內酯的菌株，為后期利用微生物發酵生產內酯類化合物提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

銀杏組織材料：取自湖南省永州市雙牌縣桐子坳村，樹約為800年齡的銀杏根、莖組織。樣品放入經滅菌的廣口瓶，在24 h內運至實驗室進行處理。內生真菌分離采用PDA培養基和馬丁氏(MMN)培養基，用前按30 mg/L加入鏈霉素。發酵采用不加瓊脂的PDA培養液，即PDB培養液。

銀杏內酯A、B、C標準品：美國Sigma公司；

白果內酯標準品：上海哈靈生物科技有限公司；

KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、乙醇、鹽酸、鏈霉素、葡萄糖、瓊脂：分析純；

乙酸乙酯、甲醇：色譜純。

1.2 試驗方法

1.2.1 銀杏組織的表面消毒 參考文獻[17]的方法，略作修改，分別選取新鮮銀杏根、莖，用清水洗凈后，流水沖洗0.5 h，放入裝有蒸餾水的燒杯中。

洗凈的材料各取5 g，首先用體積分數為75%酒精漂洗1 min，無菌水沖洗3次；再用0.1%的次氯酸鈉漂洗(根1.5 min，莖0.5 min)，無菌水沖洗3次；最后一次洗液置于滅菌的小燒杯中。

表面消毒后的材料在空白PDA培養基上滾動數圈，將培養基置于37 ℃培養2 d，檢測消毒效果。

1.2.2 銀杏內生真菌的分離、純化和保藏 經無菌處理后，樣品表面用無菌濾紙吸干，在超凈工作臺內，用滅菌的剪刀將莖剪成約0.5 cm長小段；根剪成大小適中的組織塊。每個PDA和MMN平板放置4～5塊組織塊，將切口面置于培養基上。將無菌處理過程中樣品的最后一次清洗液涂于培養基上培養，作為對照，分別編號記錄。操作完成后置于28 ℃恒溫培養箱中培養，每天觀察并記錄內生微生物生長情況。

待樣品表面或邊緣長出菌絲后，在超凈工作臺中用無菌剪刀或挑針挑取菌絲轉接到新的對應培養基上，進行編號。繼續置于28 ℃恒溫箱中閉光培養，每天觀察菌落生長情況。

待接種的菌體萌發后，用菌絲頂端分離法對分離得到的內生真菌進行多次傳代直至獲得典型的純化菌落。將已純化的菌株分別轉移至固體斜面培養基上，每株保存2支斜面，28 ℃恒溫箱中培養，待菌株生長旺盛時，取出置4 ℃保藏。1～2月后轉接入新的斜面。

1.2.3 檢測樣品的制備 用打孔器在長滿菌絲的培養基上打孔，將其接入裝有100 mL PDA培養液的250 mL三角瓶中，每瓶接入3個菌絲塊；置于恒溫震蕩培養箱中，28 ℃，120 r/min培養5～7 d，3層紗布過濾分離菌體和發酵液。

取過濾后的發酵液50 mL，加入等體積乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液后旋轉蒸發至近干，加入5 mL甲醇溶解固體物質，并用0.22 μm濾膜過濾待用；菌絲體在55 ℃烘箱中烘干后取2 g于研缽中，加入10 mL 50%甲醇溶液充分研磨，加入20 mL乙酸乙酯進行萃取，萃取液旋轉蒸發至近干，加入2 mL甲醇溶解固體物質，并用0.22 μm濾膜過濾待用。

1.2.4 樣品中內酯類物質的測定 采用HPLC-UV法銀杏內酯類物質的含量標準曲線法計算，標準品為銀杏內酯A、B、C和白果內酯。

1.2.5 產銀杏內酯內生真菌的鑒定 采用形態學特征和ITS序列分析方法進行鑒定。

(1) 形態學特征分析：挑取純化的菌株尖端菌絲接種于PDA培養基上，培養一段時間后觀察菌落的大小、顏色等形態特征；然后采用插片法進行菌絲體制片，在顯微鏡下觀察菌絲體和分生孢子的形態等特征，根據《真菌鑒定手冊》[18]進行初步鑒定。

(2) ITS序列分析：采用CTAB法提取目標菌株的基因組DNA[19]。ITS序列特異性引物[20](北京六合華大基因科技有限公司合成)為ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACC-TGCGG-3’和ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR反應條件：94 ℃預變性 5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1 min，25個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增片段與pMD19-T載體[寶生物工程(大連)有限公司]連接并轉化至大腸桿菌感受態細胞，陽性克隆經菌落PCR鑒定正確后，交由北京六合華大基因科技有限公司測序。測序結果提交NCBI進行序列比對分析，選取同源性最高的前幾條序列，利用MEGA7.0軟件[21]，基于鄰接法(Neighbor Joining Method)構建系統發育樹，Bootstrap檢驗值≥50%，1 000次重復。

2 結果與分析

2.1 產銀杏內酯內生真菌的篩選

從銀杏根、莖組織中共分離出內生真菌116株，其中根莖中分別為76，40株。采用HPLC對發酵液和菌絲提取物樣品進行分析。由圖1、2可知，菌株Gbph112的發酵液和菌絲提取物中均含有與標準品銀杏內酯A、B、C和白果內酯相對應的色譜峰，表明菌株Gbph112可產生銀杏內酯A、B、C和白果內酯，并且白果內酯、銀杏內酯B和C大部分分泌到細胞之外，而銀杏內酯A有相當一部分存在于菌絲細胞內。除此之外，HPLC色譜圖上還存在對應3種標準品之外的吸收峰，說明發酵液和菌體中還含有其它種類的化合物。標準曲線法測定菌株Gbph112的發酵液和菌絲提取物中內酯類物質總量分別為(7.60±0.12)，(3.80±0.06) mg/L。

白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C保留時間分別為3.05，3.41，3.81，4.48 min

圖1 銀杏內酯類物質標準品的HPLC圖譜

Figure 1 HPLC chromatograms of four ginkgolides standards

圖2 銀杏內生真菌Gbph112產內酯類物質的HPLC圖譜Figure 2 HPLC chromatograms of the gingkolides produced by Ginkgo biloba endophytic fungus strain Gbph112

2.2 產銀杏內酯菌株的鑒定

菌株Gbph112菌落及其分生孢子呈現毛霉屬真菌典型特征見圖3。在28 ℃于PDA平板上生長較快，菌落形狀多樣，初期為疏松白色菌絲，中后期菌絲逐漸生長密集，顏色漸變為淺黃色，產生孢子后菌落整體呈淺黃至褐色茸毛狀，菌落背面呈黃色。氣生菌絲無隔，呈分枝狀，無匍匐菌絲和假根；菌絲體上直接生出總狀分枝的孢囊梗，頂端著生球形孢子囊，無囊托，產圓形、光滑的孢囊孢子。其ITS序列通過BLAST搜索后獲取相關種屬的ITS序列，用MEGA 7.0軟件按鄰接法構建系統進化樹。結果顯示，菌株Gbph112與Mucoramphibiorum的序列最大相似性達到99%，見圖4。綜合菌落、菌體形態和ITS序列分析信息，將該菌株鑒定為毛霉屬。

圖3 菌株Gbph112菌落及其分生孢子形態

圖4 基于ITS序列的菌株Gbph112與其相關種系統進化樹

3 結論

本研究從銀杏根、莖組織中分離出內生真菌116株。通過HPLC檢測分析，從中篩選出1株產銀杏內酯內生真菌，即菌株Gbph112，形態學和分子生物學鑒定結果顯示其為毛霉屬真菌，為首次從銀杏組織中分離篩選到的能夠產銀杏內酯的毛霉屬菌株。利用標準曲線法測定該菌發酵液和菌絲體中總內酯產量約為11.4 mg/L，高于包飛等[15]分離到的卵形孢霉屬菌株，但低于嚴鑄云等[12-14]篩選和誘變之后的煙曲霉原變種FG052。

研究[22]表明，銀杏提取物中含有30余種黃酮化合物和萜類、酚類、微量元素及氨基酸等有效成分，其研究和藥效利用已較為成熟。同時，對銀杏提取物的植物病原菌如柑橘青霉病菌[23]的抑制活性研究也正逐步開展。而利用內生真菌生產藥用活性成分才剛剛起步，許多基礎性工作有待深入研究。就銀杏內生微生物而言，雖然本研究篩選到的產銀杏內酯內生真菌相對來說有較高的產量，但目前發現的內生微生物極少達到工業化生產標準。所以，應繼續擴大內生微生物分離的數量和種類，篩選產量更高且植物體外傳代產量穩定的菌株，對分離得到菌株進行生理特性和菌體內內酯類物質代謝途徑的研究，并通過誘變選種、生長培養基設計、發酵條件和工藝優化等方法和手段，提高微生物發酵內酯類物質的產量及內生微生物植物體外傳代的穩定性，使利用微生物發酵生產內酯類物質成為可能。

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Isolation and identification of ginkolides-producing endophytic fungi from Ginkgo biloba Linn.

CHEN Xiao-ming1,2,3,4HEFu-lin1,2,3LIZhi-zhong5YUANZhi-hui1,2,3

(1.CollegeofChemistryandBioengineeringinHunanUniversityofScienceandEngineering,Yongzhou,Hunan425199,China; 2.HunanProvincialEngineeringResearchCenterforGinkgoBiloba,Yongzhou,Hunan425199,China; 3.KeyLaboratoryofComprehensiveUtilizationofAdvantagePlantsResourcesinHunanSouth,Yongzhou,Hunan425199,China; 4.HunanHengweiPharmaceuticalCo.,Ltd.,Yongzhou,Hunan425199,China; 5.YongzhouBureauofAnimalHusbandryandFishery,Yongzhou,Hunan425199,China)

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.08.007

湖南省教育廳科研項目(編號：15C0585)；湘南優勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室開放基金項目(編號：XNZW15C11)

陳小明，男，湖南科技學院講師，碩士。

袁志輝(1981—)，男，湖南科技學院副教授，碩士。 E-mail：zhh_yuan@126.com

2017—05—22