洋蔥皮黃酮抑制脂肪細胞生成作用

韓 英 林 墨 劉昊明 許美娜 徐紅艷,3 李官浩,3

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130000；2. 延邊大學食品研究中心，吉林 延吉 133000；3. 延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133000)

洋蔥皮黃酮抑制脂肪細胞生成作用

韓 英1林 墨2劉昊明2許美娜2徐紅艷2,3李官浩2,3

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130000；2. 延邊大學食品研究中心，吉林 延吉 133000；3. 延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133000)

以乙醇提取洋蔥皮中黃酮類化合物，通過正交試驗優(yōu)化提取工藝，驗證實驗顯示洋蔥皮黃酮提取率為21.58%。通過制備液相分離黃酮類化合物單體，作用于3T3-L1前脂肪細胞，測定了洋蔥皮黃酮類單體誘導分化第8天的3T3-L1前脂肪細胞中脂肪分化相關(guān)基因FAS的mRNA表達量。結(jié)果表明：槲皮素對3T3-L1前脂肪細胞分化抑制效果最好，加藥處理組FAS的mRNA相對表達量都低于對照組的基因表達量，且槲皮素處理組基因表達量下調(diào)極為顯著(P<0.01)，說明洋蔥皮中通過制備分離的黃酮類單體化合物對3T3-L1前脂肪細胞分化具有抑制效果，抑制效果大小為槲皮素>山奈酚>蘆丁。

洋蔥皮；黃酮；抗肥胖；3T3-L1前脂肪細胞；基因表達

Abstract： Extractions of flavonoid compounds in onion with ethanol, using the optimization factors of single factor and orthogonal design experiments, the flavonoids extraction rate of onion peel was 21.58%. The effect of quercetin on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes was best by separating the flavonoids from the liquid phase and acting on the 3T3-L1 preadipocytes. The expression of fat differentiation related gene FASmRNA was measured in 3T3-L1 adipocytes induced by flavonoid monomers of onion skin for eighth days. The results showed that the relative expression of FAS in 3T3-L1 preadipocytes induced by mRNA in quercetin group was significantly lower than that in control group after 8D.

Keywords： Onion peel; flavonoids; anti obesity; 3T3-L1 preadipocytes; gene expression

洋蔥(AlliumcepaL.)，又名蔥頭、圓蔥、玉蔥、球蔥，為百合科蔥屬 2 年生草本植物，在中國分布很廣[1]。洋蔥中含有硫化物、揮發(fā)油、多糖和前列腺素類等生物學活性成分，現(xiàn)階段洋蔥已經(jīng)被開發(fā)研制成各種保健品，如洋蔥汁、洋蔥皮茶等。人們通過這些保健品來提高自身的免疫力，并通過改善免疫系統(tǒng)、新陳代謝防止自身老化、預防感冒等疾病[2-3]。但洋蔥和洋蔥皮中富含的很多營養(yǎng)物質(zhì)并沒有完全開發(fā)出來，比如洋蔥中黃酮(如槲皮素、山奈酚，以及花葵素、花青素和葡萄糖連接所構(gòu)成的葡糖苷等)主要存在于鱗莖、葉和皮中，且洋蔥鱗莖可食部分由外到內(nèi)黃酮類物質(zhì)含量依次降低[4-6]。

由于不良的飲食習慣，肥胖癥日益嚴重，臨床人群也越來越年輕化。劉昊明等[7]研究表明洋蔥皮中的黃酮類物質(zhì)具有抗肥胖作用。Augusti等[8]和Fang等[9]將從大豆中提取的異黃酮，加入到肥胖大鼠的飼料里，發(fā)現(xiàn)肥胖大鼠體重較飼喂正常飼料的呈下減趨勢。隋苗苗[10]35通過提取洋蔥皮中總黃酮作用于小鼠肝臟細胞，證明洋蔥皮中黃酮成分有抗肥胖作用。薛冬娜等[11]通過灌胃小鼠試驗證實了荷葉中的黃酮也是一種天然的減肥降脂成分。雖然關(guān)于黃酮類化合物對降脂減肥作用相關(guān)研究報道很多，但這些研究都主要以動物試驗為主，且都以提取粗黃酮作用于肝臟及調(diào)控脂質(zhì)代謝，有關(guān)制備提純黃酮類單體化合物對3T3-L1前脂肪細胞分化作用以及對脂合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄基因研究較少。楊俊朋等[12]研究表明，肥胖是因為脂肪細胞的分化增殖，以及脂肪細胞內(nèi)的脂肪滴積聚過多所導致的。3T3-L1前脂肪細胞是由多功能干細胞分化成充質(zhì)前體細胞，再進一步發(fā)育而成的脂肪細胞，且3T3-L1前脂肪在適當誘導條件下，能夠在體外分化為成熟脂肪細胞，可以認為此細胞株能較好地模擬活體脂肪組織[13]。如果能夠通過一定的方法來抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化，將有助于預防或治療肥胖。

本試驗擬用從洋蔥皮黃酮類化合物制備分離出的單體化合物，誘導分化3T3-L1前脂肪細胞，通過觀察脂肪細胞的分化和抑制脂肪沉積相關(guān)基因FAS的mRNA的表達量，考察洋蔥皮黃酮類單體化合物對3T3-L1前脂肪細胞抑制效果，為研發(fā)天然降脂減肥保健品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

洋蔥皮：采集于延吉市某農(nóng)貿(mào)市場；

3T3-L前脂肪細胞：中國科學院細胞典藏中心；

甲醇、乙腈：色譜純，迪馬科技有限公司；

無水乙醇、磷酸：分析純，科密歐化學試劑有限公司；

蘆丁、槲皮素、山奈酚標準品：北京索萊寶科技有限公司；

增殖培養(yǎng)基：北京淘素生物科技有限公司；

胎牛血清(FBS)：美國Hy Clone公司；

地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素：美國Sigma公司。

1.1.2 主要儀器與設備

電子天平：FA1104N型，上海精密科學有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：FYFLAN-1001型，東京理化器械株式會社；

糖度計：WY032'T型，重慶蜀江科技貿(mào)易有限公司；

高速粉碎機：FW-200型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：EYELAN-1001型，東京理化器械株式會社；

冷凍干燥機：LGH-18型，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；

高效液相色譜儀：LC-2010型，日本島津公司；

CO2細胞恒溫培養(yǎng)箱：MCO-20AIC型，日本山洋公司；

倒置顯微鏡：MC20-C型，重慶光電儀器有限公司；

臺式低速離心機：TDZ5-WS型，湖南赫西儀器裝備有限公司；

-80 ℃冰箱：86-150W型，海爾集團公司；

PCR擴增儀：TC-96/G/H(b)C型，杭州博日科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 洋蔥皮提取物的制備 將洋蔥皮擦凈烘干粉碎，用乙醇提取趁熱過濾，濾渣中加一定量的醇水溶液，在相同溫度下萃取 30 min 后過濾，按此方法再進行一次，將3次濾液合并，濃縮至原體積的1/5，冷凍干燥，采用高效分析液相測定并計算提取率。在前期單因素試驗結(jié)果的基礎上建立正交試驗因素水平表(表1)，通過正交試驗確定最佳提取工藝[14]。

表1 正交試驗因素水平

1.2.2 洋蔥皮黃酮單體化合物的制備 采用Waters Pre-HPLC對洋蔥皮黃酮類物質(zhì)進行制備[15]，收集黃酮單體，色譜條件：流速為8 mL/min，以甲醇和水作為流動相，分別選取體積比為甲醇∶水=60∶40、甲醇∶水=55∶45以及甲醇∶水=50∶50的條件下，等度洗脫80 min，流動相在波長270 nm紫外吸收的出峰順序接收單體。

1.2.3 黃酮類物質(zhì)的測定方法 使用高效液相色譜儀，在色譜柱條件為Diamonsil C18(250×4.6 mm 5 μm)，選擇體積比為20∶80的乙腈—0.5%甲酸溶液作為流動相，柱溫條件27 ℃，流速0.9 mL/min，進樣量10 μL，在370 nm波長下測定黃酮類物質(zhì)[16-17]。

1.2.4 洋蔥皮黃酮類單體化合物對3T3-L1前脂肪細胞的影響 制備分離的蘆丁、槲皮素、山奈酚用分化前期培養(yǎng)基(成分：50 mL增殖培養(yǎng)基+5 μL地塞米松+250 μL 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)配成70 μg/mL的濃度作用于3T3-L1前脂肪細胞48 h后，當細胞回合度達到90%以上時，用磷酸鹽緩沖液清洗2次后，再用配置濃度為70 μL/mL的蘆丁組、槲皮素組、山奈酚組的分化后期培養(yǎng)基(成分：1 mL增殖培養(yǎng)基+1 μg胰島素)每2 d更換一次分化培養(yǎng)基，在分化誘導第8天，用顯微鏡觀察對照組與加藥處理組的脂肪滴沉積現(xiàn)象，并加入解離液刮板提取分化誘導第8天時3T3-L1前脂肪細胞RNA，用熒光定量法(PCR試劑盒)測出FAS的mRNA 基因表達量。

1.2.5 統(tǒng)計分析 采用 SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥皮提取黃酮正交試驗結(jié)果與分析

由表2、3可知，影響洋蔥皮黃酮提取率的因素主次依次為固液比、提取時間、提取溫度、乙醇濃度；各因素對洋蔥皮黃酮得率均有極顯著影響；最優(yōu)提取工藝為A3B3C2D1。而正交表中的最優(yōu)組也為A3B3C2D1，故洋蔥皮提取黃酮類化合物的最優(yōu)條件為固液比1∶40 (g/mL)、提取時間1.5 h、提取溫度90 ℃、乙醇濃度40%。

2.2 黃酮類化合物單體對3T3-L1前脂肪細胞的分化抑制效果

由圖1可知，蘆丁、槲皮素、山奈酚處理組的脂肪滴明顯少于對照組的脂肪滴，說明從洋蔥中提取的黃酮單體化合物對3T3-L1前脂肪細胞分化有抑制作用，抑制效果槲皮素>山奈酚>蘆丁。

表2洋蔥皮提取異黃酮L9(34)正交試驗設計及方差分析

Table 2 Orthogonal design and analysis of isoflavones L9(34) by onion peel

序號ABCD黃酮提取率/%1111117.362122217.783133317.624212319.575223119.406231219.257313220.838321320.399332121.58k10.17590.19250.19000.1945k20.19410.19190.19640.1929k30.20930.19480.19280.1919R0.03350.00290.00640.0026因素主次ACBD

表3 方差分析表?

? **表示影響極顯著，P<0.01；a為小數(shù)點后數(shù)比較多軟件自動生成。

圖1 洋蔥皮提取物蘆丁、槲皮素、山奈酚以70 μg/mL作用于3T3-L1前脂肪細胞的分化影響(×200)

Figure 1 The fermentation of onion peel extract rutin, quercetin, kaempferol in 70 μg/mL on 3T3-L1 adipocyte differentiation effect

2.3 加藥后分化誘導8 d時3T3-L1前脂肪細胞基因的表達量

由圖2可知，將70 μg/mL蘆丁、槲皮素、山奈酚作用于3T3-L1前脂肪細胞分化8 d后，可以看到70 μg/mL加藥處理組FAS的mRNA相對表達量與對照組相比都顯著降低了，其中槲皮素處理組(P<0.01)基因表達量下調(diào)極為顯著。說明洋蔥皮黃酮類提取物單體在以70 μg/mL濃度作用于3T3-L1前脂肪細胞可以通過調(diào)控抑制FAS脂肪因子表達量抑制3T3-L1前脂肪細胞分化，其中槲皮素處理組表達量下調(diào)最為顯著，說明洋蔥皮總黃酮抑制3T3-L1前脂肪細胞分化作用過程中，槲皮素起主要作用。

圖2 脂肪代謝相關(guān)基因的FAS mRNA相對表達量

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，洋蔥皮中提取制備的黃酮類單體化合物蘆丁、槲皮素、山奈酚可調(diào)控FAS的mRNA表達量抑制3T3-L1前脂肪細胞分化，且槲皮素的抑制效果最為顯著。隋苗苗[10]17-35的試驗結(jié)果表明，洋蔥皮中含量最多的黃酮類物質(zhì)為槲皮素，通過動物試驗測定了小鼠血脂水平及肝臟細胞形態(tài)，通過脂質(zhì)代謝及是否有效抑制肝臟細胞膨大證明洋蔥皮具有抗肥胖作用。本研究進一步證明了洋蔥皮中黃酮類物質(zhì)具有抗肥胖作用，為高效新型天然降脂減肥保健品的研發(fā)提供了理論依據(jù)，并提高了洋蔥皮的附加值。

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Study on the inhibitory effect of onion peel flavonoids on adipocyte production

HAN Ying1LINMo2LIUHao-ming2XUMei-na2XUHong-yan2,3LIGuan-hao2,3

(1.ProcessingandStorageofAgricultureProductsofJiliAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130000,China; 2.FoodResearchCenterofYanbianUniversity,Yanji,Jilin133000,China; 3.AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,Yanji,Jilin133000,China)

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.08.008

吉林省科技廳重點項目(編號：20140307011YY)；中國博士后科學基金面上資助項目(編號：171950)

韓英，女，吉林農(nóng)業(yè)大學在讀碩士研究生。

李官浩(1975—)，男，延邊大學副教授，博士。 E-mail: ghli@ybu.edu.cn

2017—05—07