綠豆皮可溶性膳食纖維提取工藝優(yōu)化及其物理特性研究

羅 磊 王雅琪 馬麗蘋 朱文學(xué) 張 寬 姬青華 馬永哲

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2. 河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023)

綠豆皮可溶性膳食纖維提取工藝優(yōu)化及其物理特性研究

羅 磊1,2王雅琪1,2馬麗蘋1,2朱文學(xué)1,2張 寬1,2姬青華1,2馬永哲1,2

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2. 河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023)

以綠豆皮為原料，采用超微粉碎技術(shù)輔助酶法提取可溶性膳食纖維，通過二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計對提取條件進行優(yōu)化，并對其性質(zhì)進行研究。結(jié)果表明，超微粉碎可顯著提高綠豆皮可溶性膳食纖維的得率，當物料粒徑為25～38 μm時，酶法提取綠豆皮可溶性膳食纖維的最佳工藝為：液料比33∶1 (mL/g)，酶解溫度60 ℃，酶底比190 U/g，酶解時間2 h。該條件下可溶性膳食纖維的得率達14.02%，持水力389%，持油力142%，膨脹力2.67 mL/g，對膽酸鈉的吸附率為30.29%。

綠豆皮；可溶性膳食纖維；提取；物理特性

Abstract： Superfine grinding-assisted enzymatic extraction of soluble dietary fiber fromPhaseolusRadiatushull were studied, and the extraction conditions were optimized by two general rotary combination design. Then the properties were studied. The results showed that the superfine grinding could significantly improve the extraction rate of soluble dietary fiber of Phaseolus radiatus hull, when the particle size was 25～38 μm, and the enzymatic extraction of soluble dietary fiber were: ratio of solvent-to-solid 33∶1 (mL/g), enzyme solution temperature, 60 ℃, ratio of enzyme-substrate 190 U/g, the enzymolysis time 2 h. Under this conditions, the yield of soluble dietary fiber reached 14.02%, the water holding capacity was 389%, the oil holding capacity was 142%, the expansion force was 2.67 mL/g, and the adsorption rate of sodium cholate was 30.29%.

Keywords：phaseolusRadiatushull; soluble dietary fiber; extract-ion; physical characteristics

綠豆皮是綠豆芽加工過程中的副產(chǎn)物，富含多種生物活性物質(zhì)，但目前大多被作為廢渣或飼料而未被充分利用，造成了嚴重的環(huán)境污染及資源浪費。有研究[1]表明，綠豆皮中膳食纖維含量高達65.85%。隨著營養(yǎng)學(xué)的深入發(fā)展以及人們對健康飲食的追求，膳食纖維作為“第七類營養(yǎng)素”得到學(xué)術(shù)界和普通百姓的廣泛關(guān)注。膳食纖維可分為可溶性膳食纖維(Soluble Dietary Fiber，SDF)和不可溶性膳食纖維(Insoluble Dietary Fiber，IDF)兩大類。據(jù)報道[2]，可溶性膳食纖維具有降低血脂與膽固醇，預(yù)防心血管疾病；降低血糖，減少糖尿病發(fā)生；預(yù)防腫瘤發(fā)生及其進展等多種生理功能。近年來，國內(nèi)外制備可溶性膳食纖維的原料有：米糠、蘆筍、椪柑渣、癩葡萄渣、梨渣[3-7]等。但以綠豆皮為原料制備可溶性膳食纖維鮮有報道。

綠豆皮結(jié)構(gòu)致密、韌性和硬度較強，不利于其SDF的提取。超微粉碎技術(shù)能使粉體顆粒微細化，比表面積和孔隙率增加[8]，可有效地促進原料中SDF的溶出。利用酶法降解細胞壁，能夠減少提取時的阻力，從而提高效率并縮短時間，同時酶法具有條件溫和、操作簡單、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點[9]。因此本研究擬利用超微粉碎技術(shù)輔助酶法提取綠豆皮中的SDF，并對SDF的性質(zhì)進行研究，為綠豆皮SDF開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆皮：洛陽新農(nóng)村豆芽廠；

纖維素酶(5萬U/g)、α-淀粉酶(4萬U/g)、木瓜蛋白酶(1萬U/g)：江蘇瑞陽生物科技有限公司；

膽酸鈉：分析純，上海藍季生物科技發(fā)展有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：分析純，上海伊卡生物技術(shù)有限公司；

醋酸、醋酸鈉、無水乙醇、濃硫酸、糠醛、抗壞血酸(VC)、三乙酸、氯化鐵、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、過氧化氫、水楊酸等：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速多功能粉碎機：HC-1000Y2型，永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；

超微粉碎機：HMB-701型，北京環(huán)亞天元機械技術(shù)有限公司；

臺式低速離心機：TDZ5-WS型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-Ⅲ型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

紫外可見分光光度計：UV2400型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

雙功能水浴恒溫振蕩器：SHA-B型，北京科偉永興儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-S型，江蘇金壇市億通電子有限公司；

電子分析天平：FA1004型，上海上平儀器公司；

pH計：PHS-3C型，上海越平科學(xué)儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：101-2-BS型，上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 綠豆皮樣品的制備 綠豆皮經(jīng)蒸餾水反復(fù)清洗、除雜后，在室溫下干燥至恒重，后經(jīng)高速粉碎機粉碎后過50目篩，得到綠豆皮粗粉。向綠豆皮粗粉中加入20 U/g的α-淀粉酶，置于65 ℃水浴恒溫振蕩器中振蕩1 h，沸水浴滅酶10 min后，冷卻，加入10 U/g的木瓜蛋白酶，置于45 ℃水浴恒溫振蕩器中振蕩2 h[10]，沸水浴滅酶10 min后，過濾、烘干至恒重，得到綠豆皮粉樣品。

1.3.2 可溶性膳食纖維的提取 稱取一定質(zhì)量的樣品置于100 mL離心管中(每組3個平行試驗)，將纖維素酶用醋酸—醋酸鈉緩沖溶液溶解后，加入離心管中與綠豆皮樣品充分混合，振蕩，恒溫水浴提取一段時間后，沸水浴加熱10 min，滅酶，冷卻后，于4 000 r/min離心15 min，過濾棄去殘渣，取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上清液濃縮至一定體積，濃縮液用4倍體積的無水乙醇沉淀2 h，然后離心(3 600 r/min，10 min)，取沉淀。收集到的固體物質(zhì)放在40 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥，稱重，即得到綠豆皮SDF，按式(1)計算SDF的得率。

(1)

式中：

c——SDF得率，%；

m1——提取的可溶性膳食纖維質(zhì)量，g；

m2——樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 超微粉碎對綠豆皮可溶性膳食纖維提取率的影響

取一定量的綠豆皮樣品放入超微粉碎機(1.5 kW)中粉碎，得到綠豆皮超微粉，將所得粉末分別過50，100，200，300，400，500目的篩網(wǎng)，得到不同粒徑的超微粉，按1.3.2中方法進行可溶性膳食纖維的提取，探究超微粉粒度大小對提取率的影響，得到最佳粉末粒度，并在此試驗基礎(chǔ)上，對酶法提取綠豆皮SDF的工藝進行進一步優(yōu)化。

1.3.4 單因素試驗

(1) 液料比對SDF得率的影響：固定反應(yīng)條件為酶底比200 U/g、酶解時間2 h、酶解溫度55 ℃，考察不同的液料比[10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1 (mL/g)]對綠豆皮SDF得率的影響。

(2) 酶底比對SDF得率的影響：固定反應(yīng)條件為液料比30∶1 (mL/g)、酶解時間2 h、酶解溫度55 ℃，考察不同的酶底比(100，150，200，250，300，350 U/g)對綠豆皮SDF得率的影響。

(3) 酶解時間對SDF得率的影響：固定反應(yīng)條件為液料比30∶1 (mL/g)、酶底比200 U/g、酶解溫度55 ℃，考察不同的酶解時間(1.0、，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h)對綠豆皮SDF得率的影響。

(4) 酶解溫度對SDF得率的影響：固定反應(yīng)條件為液料比30∶1 (mL/g)、酶解時間2 h、酶底比200 U/g，考察不同酶解溫度(40，45，50，55，60，65 ℃)對綠豆皮SDF得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 根據(jù)1.3.4的結(jié)果，選取對綠豆皮得率影響相對較大的因素，以綠豆皮SDF得率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.5軟件對所得數(shù)據(jù)進行處理并分析，得出提取綠豆皮SDF的最佳工藝條件。

1.3.6 綠豆皮SDF持水力的測定 參考鄭慧等[11]的方法，并做一定的調(diào)整，準確稱取質(zhì)量為m1的綠豆皮SDF粉末放入離心管中，加入50 mL蒸餾水，在室溫下攪拌24 h，在3 000 r/min的條件下離心15 min，棄去上清液，用濾紙吸干離心管內(nèi)壁殘留水分，稱其質(zhì)量為m3。按式(2)計算SDF的持水力。

(2)

式中：

c——持水力，%；

m1——綠豆皮SDF粉末質(zhì)量，g；

m2——離心管質(zhì)量，g；

m3——SDF粉末與離心管總質(zhì)量，g。

1.3.7 綠豆皮SDF膨脹力的測定 參考謝怡斐等[12]的方法，并做一定的調(diào)整，準確稱取質(zhì)量為m1的綠豆皮SDF粉末置于經(jīng)干燥的10 mL量筒中，記錄其原始體積V1；然后向量筒中加蒸餾水至刻度，攪拌均勻，室溫放置過夜后測定其吸水后體積V2，按式(3)計算SDF的膨脹力。

(3)

式中：

c——膨脹力，mL/g；

V1——原始體積，mL；

V2——吸水后體積，mL。

1.3.8 綠豆皮SDF持油力的測定 參考Wang等[13]的方法，并做一定的調(diào)整，準確稱取質(zhì)量為m1的綠豆皮SDF粉末放入離心管中，加入10 mL植物油，浸泡1 h，每隔10 min攪拌一次，然后在3 000 r/min的條件下離心15 min，棄去上清液，用濾紙吸干內(nèi)壁多余油脂，靜置5 min后，稱量剩余殘渣的重量記為m2，按式(4)計算SDF的持油力。

(4)

式中：

c——持油力，%；

m1——綠豆皮SDF粉末質(zhì)量，g；

m2——剩余殘渣的質(zhì)量，g。

1.3.9 綠豆皮SDF對膽酸鹽的體外吸附試驗

(1) 膽酸鈉含量的測定：采用糠醛比色法。精確稱取膽酸鈉0.100 0 g，加蒸餾水溶解到50 mL容量瓶中，并定容至刻度(2 mg/mL)；準確吸取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL至10 mL容量瓶中定容。

精確移取各個不同濃度的標準溶液1 mL于具塞試管中，加入45%的硫酸6 mL，再加入0.3%的糠醛溶液1 mL，振蕩混勻，置于65 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，冷卻至室溫后，以樣1為參比，于620 nm處測定吸光值[14]。

(2) 綠豆皮SDF對膽酸鹽的體外吸附：向250 mL錐形瓶中加入含0.2 g膽酸鈉的0.15 mol/L NaCl溶液100 mL，調(diào)節(jié)pH至7，加入1.0 g SDF，攪拌均勻使之充分溶解，在37 ℃恒溫水浴鍋中保溫，放入水浴鍋時移取1 mL反應(yīng)液用糠醛比色法在620 nm下測定其吸光度值，每隔15 min從其中移取1.0 mL溶液測定吸光度值并繪制時間—吸光度圖[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 超微粉粒度對SDF得率的影響

由圖1可知，隨著篩網(wǎng)目數(shù)的增大，綠豆皮SDF的得率逐漸提高，在50～400目(粉末粒徑270～25 μm)時，這種變化尤為明顯。當篩子目數(shù)達到400目時(此時樣品通過400目篩而未通過500目篩，粒徑為25～38 μm)，得率達到13.33%，可能是粉體顆粒微細化，比表面積增大，與溶劑的接觸面積增大[16]，促進了SDF的溶出；同時強作用力使得綠豆皮的細胞破碎的更徹底，綠豆皮的細胞壁得到進一步降解，其親水性增強，SDF可直接溶于溶劑中，而不必通過細胞膜進行緩慢擴散[17]。當篩網(wǎng)為500目時(樣品通過500目篩，粒徑小于25 μm)，得率為13.36%，較400目變化較小，且過細的顆粒可能會影響提取效果，因此選擇通過400目而未通過500目篩(粒徑為25～38 μm)的樣品進行纖維素酶酶解研究。

圖1 超微粉粒度對SDF得率的影響

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 液料比對SDF提取率的影響 由圖2可知，在液料比小于30∶1 (mL/g)時，隨著液料比升高，綠豆皮SDF得率增加。可能是液料比越大，原料與溶劑的接觸更充分，有助于SDF的溶出；提取液中SDF質(zhì)量濃度越低，傳質(zhì)推動動力越大，提取速率增大[18]。當超過30∶1 (mL/g)時，隨著液料比繼續(xù)增大，SDF的得率變化趨于平緩，同時過高的液料比會造成原料的浪費和醇析時乙醇的大量消耗，給后處理工序增加困難，所以，在保證高得率的前提下，盡量減少溶劑用量，降低蒸發(fā)濃縮負荷，因此選擇適宜液料比為30∶1 (mL/g)。

圖2 液料比對SDF得率的影響

2.2.2 酶解時間對SDF得率的影響 由圖3可知，酶解時間在1～2 h時，SDF的得率隨時間的推移而不斷增加，在2 h時達到最大(13.11%)，在2 h后得率降低，可能是SDF在酶作用下充分水解使得率增大，隨著反應(yīng)時間的增加，酶的作用有限，提取量達到飽和，同時時間越長SDF中包含的果膠物質(zhì)以及部分半纖維素越易發(fā)生降解[19]，因此選擇適宜的酶解時間為2 h。

2.2.3 酶底比對SDF得率的影響 由圖4可知，在酶底比<200 U/g時，隨著纖維素酶添加量的增加，SDF的得率逐漸增大，當酶底比>200 U/g時，得率降低。可能是在適量纖維素酶的作用下，SDF不斷溶出，同時部分不溶性膳食纖維發(fā)生降解，分子鏈斷裂，分子量降低，溶解度發(fā)生變化轉(zhuǎn)變?yōu)镾DF；隨著纖維素酶的繼續(xù)添加，不溶性膳食纖維會降解為較低分子量的多糖或低聚糖，它們因分子量小而不能被乙醇沉淀下來[20]，使得率降低。因此選擇酶底比為200 U/g。

圖3 酶解時間對SDF得率的影響

圖4 酶底比對SDF得率的影響

2.2.4 酶解溫度對SDF得率的影響 由圖5可知，隨著溫度升高，SDF得率逐漸先上升后下降，在55 ℃達到最大值。可能是當溫度低于55 ℃時，纖維素酶的活性被抑制不能得到充分發(fā)揮，SDF不能完全水解；而溫度過高造成酶的活性降低，原料提取液隨著溫度升高黏度增大，從而導(dǎo)致綠豆皮SDF得率降低。因此纖維素酶的最適宜溫度為55 ℃，選擇酶解溫度為55 ℃。

2.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

(1) 因素水平編碼表的確定：根據(jù)單因素結(jié)果，固定酶解時間為2 h，選取對綠豆皮得率影響相對較大的因素：液料比、酶解溫度、酶底比進行三因素五水平的二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計，見表1。

圖5 酶解溫度對SDF得率的影響

(2) 模型的建立：二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗結(jié)果見表2。

表1三元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗因素水平表

Table 1 Factors and levels of three-factor second order rotation combination experimental design

編碼X1液料比(mL/g)X2酶解溫度/℃X3酶底比/(U·g-1)-1.68226.6446.59149.55-128.0050.00170.00030.0055.00200.00132.0060.00230.001.68233.3663.41250.45△j2530

表2 三元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗結(jié)果

采用Design-Expert 8.05軟件進行數(shù)據(jù)分析。對表2試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，得SDF得率對液料比(X1)、酶解溫度(X2)、酶底比(X3)的二次多項式回歸模型：

(5)

對回歸模型進行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗，結(jié)果見表3。由表3可知，模型顯著性極高(P<0.000 1)，R2=0.959 0，說明該模型與實際數(shù)據(jù)相關(guān)性較好；失擬性檢驗不顯著(P>0.05)，說明回歸方程的擬合性好。因此該模型可用來對酶法提取綠豆皮SDF進行分析和預(yù)測。

(6)

表3三元二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗結(jié)果方差分析表

Table 3 Analysis of variance for the regression model developed for extraction yield of polysaccharides

變異來源平方和自由度均方比值FP值X129.6645129.664581.06860<0.0001X210.1422110.142227.717080.0003X39.264319.264325.317860.0004X214.827014.827013.191340.0037X228.350418.350422.820420.0006X2312.6026112.602634.441010.0001X1X20.279510.27950.763710.3863X1X31.688511.68854.614380.0501X2X36.914416.914418.896100.0011回歸85.664399.518326.01200<0.0001剩余3.6592100.3659失擬1.693050.33860.861000.5632誤差1.966150.3932總和89.323519

(3) 模型雙因素交互作用分析：將回歸方程中的任意1個因素固定在零水平，對其余2個因素經(jīng)Design-Expert 8.05軟件分析，考察其余2個因素的交互作用，得到交互因素的響應(yīng)面和等高線圖，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，響應(yīng)面坡度都比較陡峭，說明酶解溫度(X2)和酶底比對SDF得率均有較大的影響。響應(yīng)曲面的等高線圖呈橢圓形，表明二者交互作用非常顯著，與表4的顯著性分析結(jié)果一致。X2X3交互作用顯著的原因可能是酶解溫度的變化影響酶的活性、酶底比的變化影響SDF的溶出及IDF轉(zhuǎn)變?yōu)镾DF，兩者相互作用改變綠豆皮SDF的得率。

(4) 驗證實驗：以綠豆皮SDF得率為指標，經(jīng)二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化得到的最佳提取工藝條件：液料比33.28∶1 (mL/g)，酶解溫度60.35 ℃，酶底比為185.18 U/g。為驗證回歸模型的可靠性，響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝的可行性，在模型所得最優(yōu)工藝條件下進行驗證。在實際操作中，采用液料比33∶1 (mL/g)，酶解溫度60 ℃，酶底比190 U/g，進行3次重復(fù)驗證實驗，測得綠豆皮SDF得率均值為14.02%，與理論預(yù)測值14.08%偏差較小，重復(fù)性好，沒有顯著差異，說明得到的模型參數(shù)準確可靠。

圖6 液料比(X2)與酶底比(X3)的交互作用圖

Figure 6 The interplay of extraction temperature value and solvent-to-solid ratio on yield of SDF fromPhaseolusRadiatushull

2.3 持水力、持油力和膨脹力測定結(jié)果

由表4可知，綠豆皮SDF的持水力為389%，膨脹力為2.67 mL/g，持油力為142%。李夢琴等[21]通過超高壓處理小麥麩皮制備SDF，測得SDF的持水力、膨脹力分別為308%和1.49 mL/g；苗敬芝等[22]以花生粕為原料提取SDF，其持水力為351%，溶脹力為2.37 mL/g；鞠健等[23]提取的山藥皮可溶性膳食纖維的持油性1.30 g/g，說明本試驗所得綠豆皮SDF具有很好的持水力、持油力和膨脹力。持水力、持油力和膨脹力高的SDF，能使人產(chǎn)生飽腹感，降低食欲，進而控制肥胖，并能夠刺激腸道蠕動，使糞便中的有害物質(zhì)能及時排出體外，大大減少患腸道癌、痔瘡等疾病的風(fēng)險。因此，綠豆皮SDF是一種優(yōu)良膳食纖維源，可以作為添加劑應(yīng)用于食品加工中。

2.4 膽酸鹽體外吸附試驗結(jié)果

由圖7可知，隨著時間的延長，SDF溶液中膽酸鈉的濃度不斷變小，尤其在前30 min內(nèi)變化比較顯著，然后趨于平緩最終趨向一個定值，可能是溶液中SDF的含量是有限的，其對膽酸鈉的吸附量也是有限的，因此SDF的吸附量會隨著時間的推移逐漸飽和，在反應(yīng)120 min時測得的膽酸鈉濃度為2.61 mg/mL，清除量為1.12 mg/mL，SDF對膽酸鈉的吸附率達到了30.29%。徐苗均等[24]測得小麥麩皮SDF對膽酸鈉的吸附率為17%；B.Drzikova等[25]以燕麥麩為原料，研究其膳食纖維各組分與膽酸鹽的結(jié)合作用，結(jié)果得到的結(jié)合率最高為40%。膽酸鹽是膽固醇分解后的產(chǎn)物，通過吸附膽酸鹽并將其排出體外可有效降低膽酸鹽在肝腸循環(huán)過程中的積累，從而促進膽固醇的代謝，使血清膽固醇下降，因此綠豆皮SDF具有一定的降血脂功能。

表4 SDF持水力、持油力和膨脹力測定結(jié)果

圖7 膽酸鈉溶液吸光度值隨時間變化圖

3 結(jié)論

本試驗采用超微粉碎輔助纖維素酶法提取綠豆皮SDF，顯著提高了綠豆皮SDF得率。所得SDF成品呈黃白色粉末狀，水溶性較好，具有良好的膨脹力、持水力和持油力，能使人產(chǎn)生飽腹感，促進糞便中有害物質(zhì)排出體外，從而降低患腸道癌、痔瘡等疾病的風(fēng)險；對膽酸鈉有較強的吸附能力，具有一定的降血脂功能。

在后期的研究中將對制備的綠豆皮SDF進行分離純化，并對其生理功能進行全面深入的探究，為綠豆皮資源的有效利用以及綠豆皮SDF的應(yīng)用提供進一步的理論依據(jù)。

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Study and optimization on extraction process and physical characteristics of soluble dietary fiber from Phaseolus radiatus Hull

LUO Lei1,2WANGYa-qi1,2MALi-ping1,2ZHUWen-xue1,2ZHANGKuan1,2JIQing-hua1,2MAYong-zhe1,2

(1.CollegeofFood&Bioengineering,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,Henan471023,China; 2.FoodMaterialsEngineeringTechnologyResearchCenterofHenanProvince,Luoyang,Henan471023,China)

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.08.032

羅磊，男，河南科技大學(xué)教授，博士。

朱文學(xué)(1967—)，男，河南科技大學(xué)教授，博士。 E-mail：zwx@haust.edu.cn

2017—05—14