不同極性柳葉蠟梅葉萃取物總酚含量及其抗氧化、抑菌能力研究

吳永祥 王 祥 江海濤 丁康俊 趙成龍 胡長玉

(黃山學院生命與環境科學學院，安徽 黃山 245041)

不同極性柳葉蠟梅葉萃取物總酚含量及其抗氧化、抑菌能力研究

吳永祥 王 祥 江海濤 丁康俊 趙成龍 胡長玉

(黃山學院生命與環境科學學院，安徽 黃山 245041)

采用甲醇回流提取、梯度萃取得到正己烷萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物5個不同極性部分，以多酚含量、還原能力、對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 自由基的清除能力及抑制微生物生長為評價指標，研究其體外抗氧化和抑菌活性能力。結果表明：柳葉臘梅葉多酚量較為豐富，乙酸乙酯萃取物含量最多，為(309.5±4.81) mg/g。柳葉臘梅葉萃取物具有較強的抗氧化活性，其還原能力和對DPPH自由基清除能力隨其濃度的增加而增強。甲醇、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物對DPPH自由基清除能力的半數抑制濃度 (IC50) 值分別為1.24，1.11，0.61，0.48，0.98，1.36 mg/mL。柳葉臘梅葉萃取物對大腸桿菌、金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌均有抑制作用，二氯甲烷萃取物的抑菌活性最顯著，其對4種受試菌的最低抑制濃度為2 mg/mL。故柳葉臘梅葉萃取物具有較好的抗氧化和抑菌特性，為進一步分離提取活性化合物提供依據。

柳葉臘梅葉；極性；萃取物；抗氧化；抑菌

Abstract：ChimonanthussalicifolicusHu leaves extracts were prepared by methanol circumfluence extraction. Five fractions were obtained by extraction with different polar solvents including n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, n-butanol and water. Then fractions were detected by total polyphenol content, reducing power, scavenging DPPH free radical and antimicrobial activities. The results showed that all the fractions exhibited high content of total polyphenol, and ethyl acetate fraction had the highest phenolic compounds, with the content of (309.50±4.81) mg/g. The fractions had strong antioxidative capacities such as reducing power and DPPH free radical scavenging ability. The fractions of methanol, n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, n-butanol and water had certain scavenging ability on DPPH free radical withIC50of 1.24, 1.11, 0.61, 0.48, 0.98 and 1.36 mg/mL, respectively. The fractions also had the inhibiting effects onE.coli,S.aureus,B.subtilisandP.aeruginosa. Dichloromethane fraction presented the best antimicrobial effect than other fractions. Its MIC against four common bacterial strains was 2 mg/mL. In conclusion, the fractions have good antioxidant and antimicrobial activities, and this research was profitable for the further study of the separation of active compounds fromChimonanthussalicifolicusHu leaves.

Keywords：ChimonanthussalicifolicusHu leaves; different polarity fractions; antioxidant; antimicrobial activity

柳葉臘梅(ChimonanthussalicifolicusHu)為臘梅科臘梅屬半常綠灌木，是中國特有植物，主產于江浙皖南一帶。柳葉蠟梅葉揉碎極芳香，可入藥，是畬族民間常用的藥材[1]，可用于治療因感受風寒而引起的肚痛、肚脹、腹瀉，或傷食所致的消化不良、腹部脹痛等[2]。現代藥理學表明：柳葉臘梅葉中含有揮發油、生物堿、香豆素類、黃酮類、蒽醌類等活性成分[3-5]，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、修復酒精性肝損傷及增強機體免疫等功效[6-8]。目前國內外學者對柳葉蠟梅葉的研究主要集中在揮發油及其抗氧化方面[3,9]，對柳葉蠟梅葉主要活性成分系統分離的研究仍然缺乏，比較全面的研究其抗氧化和抑菌性能尚未見報道。

現在抗氧化、抑菌的食品化學添加劑濫用又日趨嚴重，而柳葉蠟梅葉作為藥食同源的天然植物，具有多種生物活性且無任何副作用，是研究開發新的抗氧化與抗菌藥物的理想資源。本研究擬以柳葉臘梅葉為原料，采用甲醇回流提取、梯度萃取得到正己烷萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物5個不同極性部分，分析萃取物的多酚含量、還原能力、對DPPH自由基的清除能力及抑菌效果，為該植物活性成分的進一步分離及開發利用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

柳葉臘梅葉：2016年3月于安徽省黃山市采集，新鮮，無病蟲害；

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)：武漢大學微生物保藏中心；

二甲基亞砜、甲醇、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、三氯乙酸、三氯化鐵、氯化鈉、無水硫酸鈉、鐵氰化鉀、苯酚、無水乙醇、無水碳酸鈉等：分析純，南京化學試劑有限公司；

蛋白胨、牛肉膏、瓊脂：生物試劑，北京陸橋技術有限責任公司；

DPPH、VC、丹寧酸、Folin-Ciocalteu試劑、對羥基苯甲酸丙酯 (Propylparaben, PP)：美國Sigma公司。

1.1.2 主要儀器設備

全波長酶標儀：SpectraMax-190型，美國Molecular Devices公司；

電子天平：FA2004N型，上海精密科學儀器有限公司；

旋轉蒸發儀：EV341型，北京萊伯泰科儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HWS-24型，上海一恒科學儀器有限公司；

鼓風干燥箱：GRX20型，上海精宏實驗設備有限公司；

臺式高速微量離心機：TG16A型，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；

生物安全柜：BHC-1300IIB2型，蘇州安泰技術有限公司；

不銹鋼立式電熱蒸汽消毒器：YM50Z型，上海三申醫療器械有限公司；

智能生化培養箱：SPT-P250A型，安徽佳創醫療器械有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 柳葉臘梅葉不同極性萃取物的制備 新鮮柳葉臘梅葉清水洗凈后，60 ℃烘干至恒重，粉碎成粉末。取柳葉臘梅葉粉末80 g，加入甲醇400 mL，60 ℃恒溫回流提取3 h，抽濾得甲醇提取液，濾渣用甲醇以同樣方法重復提取2次。合并3次濾液，于50 ℃下減壓濃縮回收溶劑，得到甲醇提取物(methanol extract, MeOH)27.87 g。再依次用不同溶劑進行萃取[10-12]，分別減壓濃縮回收溶劑，冷凍干燥得到柳葉蠟梅葉的正己烷萃取物(n-hexane fraction, Hexane) 6.82 g、二氯甲烷萃取物 (dichloromethane fraction, CH2Cl2) 0.84 g、乙酸乙酯萃取物 (ethyl acetate fraction, EtOAc) 0.45 g、正丁醇萃取物 (n-butanol fraction, BuOH) 5.57 g 和水萃取物 (water fraction, H2O) 13.6 g。按式(1)計算各萃取物的提取率。

(1)

式中：

T——各萃取物的提取率，%；

WS——各萃取物濃縮干燥后的重量，g；

W0——甲醇提取物的重量，為27.87 g。

1.2.2 總多酚含量測定 根據文獻[13～15]，采用Folin-Ciocalteu法修改如下：取0.000，0.025，0.050，0.100，0.150，0.200 mL單寧酸(1 mg/mL)，將溶液定容至1 mL，制成待測液。取0.05 mL各待測液和0.05 mL Folin-Ciocalteu試劑 (0.25 mol/L)，反應3 min后，加入1 mL 0.7 mol/L碳酸鈉溶液，30 ℃靜置1 h顯色，精確吸取0.2 mL于酶標儀750 nm處測定吸光度。同時將Folin-Ciocalteu試劑換成去離子水作為空白對照組，繪制質量濃度—吸光值的標準曲線。按同法測定柳葉蠟梅葉不同萃取物的多酚含量，其中1 g 萃取物中的多酚含量以單寧酸當量 (tannic acid equivalent，TAE) 計。

1.2.3 還原能力的測定 參考文獻[16～17] 修改如下：取0.1 mL不同濃度的柳葉蠟梅葉萃取物 (0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL) 與0.1 mL pH 6.6磷酸緩沖溶液、0.1 mL 1%鐵氰化鉀溶液混合，50 ℃水浴反應20 min，冷卻后加入0.1 mL 10%三氯乙酸，3 000 r/min離心15 min，取上清液0.1 mL，加入超純水0.1 mL與0.01 mL 0.1%三氯化鐵，靜置10 min后于酶標儀700 nm波長處測定吸光值。同時將鐵氰化鉀溶液替換成0.1 mL去離子水作為空白對照組。以VC為陽性對照，重復3次，取平均值。

1.2.4 DPPH自由基清除能力的測定 參考文獻[18～20]修改如下：取0.1 mL不同濃度的柳葉臘梅葉萃取物 (0.00，0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mg/mL)，加入0.05 mL 2 mol/L的DPPH溶液，混勻，避光反應10 min，于517 nm處測定樣品吸光值(AS)。 樣品對照組為99.9%乙醇與萃取物混合測定吸光值(ASB)，空白組為DPPH溶液與二甲基亞砜混合測定吸光值(AC)，空白對照組為99.9%的乙醇與二甲基亞砜混合測定吸光值(ACB)。以Vc為陽性對照，重復3次，取平均值。按式(2)計算DPPH自由基清除率。

(2)

式中：

I——DPPH自由基清除率，%；

AS——樣品組吸光值；

ASB——樣品對照組吸光值；

AC——空白組吸光值；

ACB——空白對照組吸光值。

1.2.5 抑菌特性研究

(1) 菌種活化及菌懸液制備：將大腸桿菌、金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌接種到試管培養基斜面進行活化，于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h。長出菌落后，在無菌操作臺內各挑取已活化好的菌種接種到無菌生理鹽水中，配置各菌懸液濃度約為106～107CFU/mL[21-22]。

(2) 抑菌試驗：濾紙片法。參考文獻[23]修改如下：在超凈工作臺中，將滅菌好的培養基倒入已滅菌的培養皿中，約15～20 mL，冷卻凝固后，背面劃線，編號，倒放在37 ℃培養箱中培養2 h后，在超凈工作臺內取菌懸液0.1 mL于培養皿中，用涂布棒涂布均勻。吸取0.01 mL 不同濃度的柳葉臘梅葉萃取物 (0，2，4，6，8，10 mg/mL) 加在濾紙片中央，37 ℃倒置培養24 h后測量抑菌圈直徑，出現抑菌圈所對應的柳葉臘梅萃取物濃度即為最小抑菌濃度。以萃取物的溶劑 (二甲基亞砜) 為空白對照，以1 mg/mL對羥基苯甲酸丙酯 (Propylparaben，PP) 為陽性對照，重復3次，取平均值。

1.3 統計學分析

所得數據以平均值±標準差表示，運用SPSS 18.0軟件對試驗結果進行統計分 (One-way ANOVA)，利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行比較分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同極性萃取物的多酚含量

單寧酸的標準曲線回歸方程為：y=0.001 5x+0.012 8 (其中x表示丹寧酸質量濃度μg/mL，y表示吸光值)，R2=0.998 7，在0～0.2 mg/mL時，丹寧酸質量濃度與其吸光度線性關系良好，該方程可用于柳葉臘梅葉萃取物多酚含量測定。

由表1可知，由于溶劑極性不同對萃取物的得率、萃取物的成分組成有較大的影響，其中水相、正己烷相、正丁醇相的提取率較高(分別為48.80%，24.47%，19.99%)。多酚含量從大到小排序為乙酸乙酯相>正丁醇相>甲醇相>水相>二氯甲烷相>正己烷相，其中乙酸乙酯相從甲醇提取物中分離的酚類高達(309.5±4.81) mg/g。

表1不同極性萃取物的提取率和多酚含量?

Table 1 The extraction yields and content of polyphenol compounds of different polarity fractions ofChimonanthussalicifolicusHu leaves

萃取物提取率/%多酚含量/(mg·g-1)MeOH34.84196.70±4.10cHexane24.47132.05±4.17fCH2Cl23.01145.30±1.98eEtOAc1.61309.50±4.81aBuOH19.99233.60±3.96bH2O48.80175.15±1.06d

? 同列不同字母表示在統計學上具有顯著差異 (P<0.05)。

2.2 不同極性萃取物的還原能力

由圖1可知，柳葉臘梅葉不同極性萃取物均表現出不同程度的還原能力，在0.2～1.0 mg/mL時，隨著萃取物濃度的增加，其還原能力不斷增強，且呈明顯的計量依賴關系。還原力從大到小排序為乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>甲醇相>二氯甲烷相>正己烷相，當濃度為1.0 mg/mL時，還原能力吸光值分別為0.91±0.01，0.51±0.04，0.46±0.013，0.44±0.01，0.31±0.01，0.29±0.02，在同濃度條件下 VC的吸光值為1.39±0.02，表明乙酸乙酯萃取物具有較強的還原能力。

圖1 不同極性萃取物的還原能力

2.3 不同極性萃取物的DPPH自由基清除能力

由圖2可知，萃取物都有較強的抗氧化能力，在0.05～1.0 mg/mL時，柳葉臘梅葉萃取物對DPPH自由基的清除能力與萃取物濃度呈顯著正相關。當乙酸乙酯萃取物濃度為1.0 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率可達91.62%，在同濃度條件下 VC的清除能力為94.20%，說明乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力與VC的相當。抗氧化活性從大到小排序為乙酸乙酯相>二氯甲烷相>正丁醇相>正己烷相>甲醇相>水相，其IC50值分別為0.48，0.61，0.98，1.11，1.24，1.36 mg/mL，表明乙酸乙酯相的抗氧化能力最強。

圖2 不同極性萃取物對DPPH自由基清除作用

Figure 2 Scavenging activity against DPPH free radicals of different polarity fractions ofChimonanthussalicifolicusHu leaves

2.4 不同極性萃取物的抑菌作用

由表2可知，不同極性萃取物中二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯及甲醇提取物對大腸桿菌、金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌均有一定的抑制作用，以二氯甲烷萃取物的抑菌活性最顯著。當二氯甲烷萃取物濃度為10 mg/mL時，對大腸桿菌、金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的最大抑菌圈直徑分別為(11.50±1.05)，(11.33±0.82)，(11.57±1.62)，(11.25±1.04) mm，陽性對照PP(終質量濃度為1 mg/mL)的最大抑菌圈直徑分別為(11.88±0.83)，(12.17±0.98)，(12.38±0.92)，(11.88±0.64) mm。表明二氯甲烷萃取物和對羥基苯甲酸丙酯對4種供試的革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌都有明顯的抑制作用。

為了定量研究柳葉蠟梅葉萃取物對食品中常用菌的抑制活性，本試驗進一步測定了其最小抑菌濃度(MIC)，其中甲醇、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯不同濃度萃取物對大腸桿菌、金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的抑制效果可見圖3。由圖3可知，不同極性萃取物在一定濃度范圍內對4種菌的抑制效果呈濃度依賴性增大。二氯甲烷和正己烷萃取物對4種菌的最低抑制濃度為2 mg/mL；乙酸乙酯萃取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度為6 mg/mL，對枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的最低抑制濃度為4 mg/mL。通過各菌株抑制效果的比較可以看出，柳葉蠟梅葉不同極性萃取物對不同菌株的最小抑制濃度不同，其中二氯甲烷萃取物活性最強，可進一步通過柱層析分離二氯甲烷萃取物，能夠篩選出針對不同菌株的有效活性成分，從而開發出有針對性的抑菌藥物。

表2 不同極性萃取物對4種菌的抑菌圈直徑?

? 萃取物濃度10 mg/mL；同列不同字母表示在統計學上具有顯著差異 (P<0.05)。

圖3 不同極性萃取物對4種菌的抑菌圈直徑

3 結論

經過以上試驗，可知柳葉蠟梅葉不同極性萃取物的總酚含量豐富，均具有較強的還原能力和DPPH自由基清除能力。乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力最為顯著，可能與其高含量的總酚物質有關[24-25]。體外抑菌試驗顯示，除正丁醇和水萃取物無明顯抑制作用外，其它3種萃取物對大腸桿菌、金黃葡萄球菌、枯草芽抱桿菌和綠膿桿菌均具有顯著的抑菌效果。本試驗系統地探究了柳葉蠟梅葉萃取物的抗氧化和抑菌性能，填補了之前沒有柳葉蠟梅葉主要活性成分分離及抗氧化、抑菌性能系列數據的空白，為該植物的進一步活性成分分離及開發利用提供試驗依據。但柳葉蠟梅葉中總酚物質種類繁多，需更深入地分離純化，以篩選出更加明確有效的抗氧化和抑菌活性成分。

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Study on total polyphenol content and antioxidant, antimicrobial activities of different polarity fractions of Chimonanthus salicifolicus Hu leaves

WU Yong-xiangWANGXiangJIANGHai-taoDINGKang-junZHAOCheng-longHUChang-yu

(CollegeofLifeandEnvironmentScience,HuangshanUniversity,Huangshan,Anhui245041,China)

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.08.033

安徽省高校自然科學研究重點項目(編號：KJ2017A398)；2016年度安徽省大學生創新創業訓練計劃項目(編號：AH201610375055)；博士人才引進啟動基金項目(編號：2016xkjq004)

吳永祥，男，黃山學院講師，博士。

胡長玉(1956—)，男，黃山學院副教授，碩士。 E-mail：hcy@hsu.edu.cn

2017—04—01