采用不同菌種發酵對臍橙殘次果飼料真蛋白含量的影響

張 強，陳榮強，孔智偉，鐘如意，劉瑞平，郭添福，2*

（1.贛州市畜牧研究所，江西 贛州 341401；2.江西農業大學省部共建豬遺傳改良與養殖技術國家重點實驗室，江西南昌 330045）

采用不同菌種發酵對臍橙殘次果飼料真蛋白含量的影響

張 強1，陳榮強1，孔智偉1，鐘如意1，劉瑞平1，郭添福1，2*

（1.贛州市畜牧研究所，江西 贛州 341401；2.江西農業大學省部共建豬遺傳改良與養殖技術國家重點實驗室，江西南昌 330045）

通過采用單一菌種、雙菌組合發酵，旨在提高臍橙殘次果中真蛋白含量，開發畜禽發酵飼料，解決臍橙殘次果未經處理對環境污染和畜牧業面臨的優質植物蛋白飼料資源緊缺問題。結果表明：采用枯草芽孢桿菌和乳酸菌組合的優選菌種配伍并添加纖維素酶，發酵產物中真蛋白含量最高達到15.59%，與對照組相比提高了12.15%。

臍橙殘次果；菌種；發酵飼料；真蛋白

贛南作為全國最大的臍橙主產區，被譽為“世界橙鄉”，2016年臍橙種植面積達10.47萬公頃，總產量128萬噸，產值達51.2億元。因貯藏能力嚴重不足，深加工滯后，每年殘次果達30萬噸以上，導致不符合標準的臍橙殘次果無法加工轉化，大部分廉價出售、丟棄或以廢棄物處理，沖擊市場價格，造成嚴重的環境污染和資源浪費。開發臍橙殘次果發酵飼料，有利于解決臍橙殘次果未經處理對環境污染和畜牧業面臨的優質植物蛋白飼料資源緊缺問題，促進經濟可持續發展。

目前，利用臍橙殘次果制作發酵飼料的相關報道較少，并且未有研究菌種與臍橙殘次果發酵飼料真蛋白含量的相互關系的文獻資料。而關于柑橘皮渣在飼料工業上利用的文獻則相對多一些。吳厚玖等[1]利用柑橘皮生產發酵飼料，發酵后蛋白質含量、氨基酸含量、維生素含量都得到了增加。周煉等[2]對甜橙皮渣發酵進行了菌種篩選，研制出了一種強化蛋白飼料，該飼料樣品的粗蛋白含量比相應對照高出近80%。鐘良琴等[3]對利用柑橘廢渣生產單細胞蛋白進行了研究，結果表明，柑橘廢渣生產單細胞蛋白飼料真蛋白含量最高。2011年宋睿等[4]用響應面法對冰糖橙皮固態發酵產菌體蛋白進行了研究，得到經優化后真蛋白含量由19.93%提高到23.85%。Nwabueze 等[5]利用柑橘皮渣生產單細胞蛋白，研究試驗得出生產單細胞最優的生長情況是在進行分批發酵時，當pH 5.5、溫度為36 ℃時的12 h 發酵周期內，4%柑橘廢棄物制造了57%粗蛋白。

菌種的選擇對混菌發酵臍橙殘次果生產菌體蛋白飼料具有重要作用。芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌是常用的生產菌體蛋白飼料的菌種。本文首次以臍橙殘次果為發酵原料，研究臍橙殘次果在不同菌種發酵培養下飼料真蛋白含量的變化，通過單一菌種、雙菌組合發酵試驗，研究菌種對臍橙殘次果發酵飼料的影響。枯草芽孢桿菌進入動物腸道能迅速萌發成具有新陳代謝作用的營養型細菌，調節腸道菌群平衡、提高飼料利用率、增強動物機體免疫力，從而提高動物的健康水平和生產性能[6]。因此，在雙菌組合發酵試驗中，本文選取枯草芽孢桿菌作為一種發酵菌種；通過選用一株菌種與枯草芽孢桿菌進行雙菌組合發酵試驗，研究不同雙菌組合對發酵產物中真蛋白含量的影響。在雙菌組合發酵基礎上，通過向固態培養基中添加纖維素酶，考察其對發酵產物中真蛋白含量的影響。

1 材料與方法

1.1 原料與菌種

1.1.1 原料

粉碎臍橙殘次果、麩皮。

1.1.2 菌種

枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸菌，購買于河南君安生物科技有限公司產品；安琪高活性干酵母，市售；產朊假絲酵母，購買于無錫拜弗德生物科技有限公司產品。

1.1.3 酶

纖維素酶，購買于濟南天天香有限公司。

1.2 固態發酵培養基

固態發酵培養基：粉碎臍橙殘次果50%，麩皮45%，尿素2%，水3%等。121 ℃滅菌 30 min。

1.3 主要試劑及儀器

試劑：濃硫酸、硫酸銅、氫氧化鈉，西隴化工股份有限公司，分析純；硫酸鉀，中國醫藥上海化學試劑公司，分析純。

儀器：LAC-5080S 高壓滅菌鍋，上海博訊儀器儀表有限公司；粉碎機，河北金琦機械廠；GZX-GF101-3-BS-Ⅱ電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫療器械有限公司；FA2004電子天平，上海上平儀器有限公司；250 mL凱氏燒瓶，蜀牛；半微量定氮蒸餾器，上海昕滬實驗設備有限公司；DK-98-Ⅱ電爐，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 單一菌種發酵試驗

試驗組：將枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸菌、安琪酵母、產朊假絲酵母的菌粉分別以0.1%的接種量，接入固態發酵培養基。(30±1) ℃下發酵3 d后，將發酵產物在102 ℃下烘干，粉碎，進行真蛋白含量測定，每個處理3 次平行試驗。

對照組：以未接菌的固態發酵培養基作為空白對照試驗。在102 ℃下烘干，粉碎，進行真蛋白含量測定，測得的數值加上所加菌粉的蛋白含量，作為對照組的真蛋白含量數值。

1.4.2 雙菌發酵試驗

采用枯草芽孢桿菌和一株其他菌種的雙菌組合方式進行雙菌發酵試驗，兩種菌種的菌粉均采用0.1%的接種量，其余同單一菌種發酵試驗。

1.4.3 添加纖維素酶試驗

將枯草芽孢桿菌、乳酸菌的菌粉以0.1%的接種量，纖維素酶0.01%的量，接入固態發酵培養基，其余同單一菌種發酵試驗。

1.5 真蛋白含量測定

圖1 不同菌種對發酵產物中真蛋白含量、粗纖維含量的影響

圖2 雙菌組合對發酵產物中真蛋白含量的影響

在樣品水溶液中加入過量硫酸銅，在堿性條件下，純蛋白被氫氧化銅沉淀，用水洗去水溶性含氮物，沉淀部分按粗蛋白的測定方法測定其含氮量[7]。

1.6 數據處理

采用DPS7.05 軟件對所得數據進行統計分析，試驗結果以平均值±標準偏差表示，多重比較采用Duncan 新復極差法分析，P＜0.01為有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 單一菌種發酵試驗

將枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸菌、安琪酵母、產朊假絲酵母分別接入固態發酵培養基，發酵3 d后測定發酵產物中真蛋白含量，試驗結果如圖1所示。

從圖1可以看出，菌體發酵后，真蛋白含量有極顯著性升高 (P＜0.01)，其中安琪酵母發酵產物中真蛋白含量增加幅度最大，與對照組相比增加了5.24%，達到14.52%，說明安琪酵母提高發酵飼料真蛋白含量的能力較強。菌體發酵后，與對照組相比枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌試驗組的粗纖維含量有極顯著降低 (P＜0.01)，分別降低3.91%、3.70%，而其他3種菌無顯著性差異，說明枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌有一定的分解纖維素能力，而另外3種菌分解纖維素的能力不強。

由以上結果可以看出，不同菌種對臍橙殘次果發酵飼料中真蛋白含量的影響差別較大。其中，安琪酵母發酵后產物中真蛋白含量相對較高，可能是由于安琪酵母合成菌體蛋白能力較強。

2.2 雙菌發酵試驗

雙菌組合接入固態發酵培養基，發酵3 d后測定發酵產物中真蛋白含量，結果如圖2所示。

由圖2可看出，2種不同的菌種混合發酵臍橙殘次果，發酵產物中真蛋白含量較對照組有極顯著升高 (P＜0.01)，但枯草芽孢桿菌和安琪酵母組合除外。枯草芽孢桿菌和乳酸菌組合，真蛋白含量增加幅度最大，與對照組相比增加了6.65%，達到14.82%，說明枯草芽孢桿菌和乳酸菌組合提高飼料真蛋白能力較強。枯草芽孢桿菌和安琪酵母組合，真蛋白含量增加幅度最小，說明枯草芽孢桿菌和安琪酵母組合提高飼料真蛋白能力相對較弱。

圖3 加纖維素酶對發酵產物中真蛋白含量、粗纖維含量的影響

由以上分析看出，不同雙菌組合發酵臍橙殘次果飼料對真蛋白含量的影響較大。枯草芽孢桿菌和乳酸菌組合，發酵產物中真蛋白的含量高于對應的單一菌種，一方面可能是雙菌發酵比單菌發酵能更充分利用發酵基質，另一方面可能是菌種可形成了菌種間的互惠共生關系，從而促進真蛋白的生成。

2.3 添加纖維素酶試驗

將枯草芽孢桿菌、乳酸菌、纖維素酶加入固態發酵培養基，發酵3 d后測定發酵產物中真蛋白含量，結果如圖3所示。

由圖3可看出，加纖維素酶組，發酵產物中粗纖維含量較對照組有極顯著降低 (P＜0.01)，與對照組相比降低了10.33%，粗纖維含量降至為8.25%，說明添加的纖維素酶對降低臍橙殘次果飼料粗纖維含量效果顯著。加纖維素酶組，發酵產物中真蛋白含量較對照組有顯著升高 (P＜0.01)，與對照組相比提高了12.15%，達到15.59%，而圖2中枯草芽孢桿菌和乳酸菌組合的真蛋白含量僅提高6.65%，說明添加纖維素酶，可提高發酵產物中真蛋白含量。

由以上分析看出，添加纖維素酶，可明顯降低發酵產物中粗纖維含量，使得發酵產物中真蛋白含量進一步提升。

3 討論

通過采用雙菌組合發酵臍橙殘次果，結果顯示有的雙菌組合真蛋白含量高于單一菌種發酵，如枯草芽孢桿菌和乳酸菌組合真蛋白含量高于對應的單一菌種，這與聞學政等[8]以柑橘皮渣為發酵原料試驗得出的結論相似。楊柳燕等[9]文獻也有類似的報道，酵母菌可利用霉菌降解纖維素生成的葡萄糖進行生物合成，形成了霉菌和酵母菌間的共生關系，從而具有較強的轉化纖維素能力和菌體蛋白合成能力。但是，也有的雙菌組合真蛋白含量低于單一菌種發酵，這可能是因為菌種間存在抑制作用。

枯草芽孢桿菌可產生多種消化酶包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶等[10]。試驗結果顯示，使用的枯草芽孢桿菌對粗纖維有一定的降解作用，通過補加纖維素酶，增強對臍橙殘次果飼料中粗纖維的降解作用，同時菌種可以利用纖維素酶降解纖維素生成的葡萄糖進行生物合成，促進菌體蛋白的合成，提高飼料真蛋白含量。

4 結論

在單一菌種發酵試驗中，安琪酵母發酵臍橙殘次果飼料的真蛋白含量有較大幅度提高。在雙菌組合發酵試驗中，臍橙殘次果發酵生產活性蛋白飼料的優選雙菌配伍為枯草芽孢桿菌和乳酸菌。采用枯草芽孢桿菌和乳酸菌優選雙菌配伍并添加纖維素酶，發酵3 d后，發酵產物中真蛋白含量達到15.59%，比未發酵的對照組提高了12.15%。說明，枯草芽孢桿菌、乳酸菌和纖維素酶配伍發酵，能顯著提高臍橙殘次果中真蛋白含量。

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2017-09-02）

江西省星火計劃重點項目（20151BBF61033）；江西省星火計劃重點項目（20161BBF61030）江西省科技支撐計劃農村領域項目（20142BBF60050）

張強，碩士，生物工程專業；15779092391

*通訊作者：郭添福，博士生，動物遺傳育種與繁殖專業；高級畜牧獸醫師；13407978908