電針內關穴預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠NO、NOS及線粒體膜電位的影響

宋瑾,王超,陽仁達,馮果,譚成富,劉薇薇,嚴潔

(湖南中醫藥大學針灸推拿學院,長沙 410208)

·動物實驗·

電針內關穴預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠NO、NOS及線粒體膜電位的影響

宋瑾,王超,陽仁達,馮果,譚成富,劉薇薇,嚴潔

(湖南中醫藥大學針灸推拿學院,長沙 410208)

目的通過測定心肌缺血再灌注損傷(MIRI)大鼠一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)及線粒體膜電位,探討電針內關穴預處理對心肌缺血再灌注損傷(MIRI)大鼠NO、NOS及線粒體膜電位的影響。方法將40只SD雄性大鼠隨機分為假手術組、缺血再灌注組(模型組)、電針內關穴組和電針環跳穴組,每組10只。采用冠脈結扎法造模,電針內關組和電針環跳組在造模前,分別給予電針刺激20 min/d,共7 d。記錄造模前后心電圖Ⅱ導聯T波電壓值,HE染色檢測心肌病理形態學的變化,采用硝酸還原酶化學比色法檢測血清NO、NOS的含量,熒光技術法測心肌細胞線粒體膜電位的變化。結果模型組血清NO、NOS含量及線粒體膜電位較假手術組明顯下降(P＜0.01,P＜0.05);電針內關穴組血清NO、NOS含量較模型組、假手術組和電針環跳組明顯升高(P＜0.01,P＜0.05);電針內關穴組線粒體膜電位較模型組、電針環跳穴組和假手術組明顯升高(P＜0.05);模型組與電針環跳穴組間無明顯差異(P＞0.05)。結論電針內關穴預處理對MIRI大鼠具有預保護作用,可以通過提高NO含量、增強NOS活性,減少心肌細胞線粒體膜電位下降,抑制細胞凋亡,從而對心肌產生保護作用。

心肌再灌注損傷;電針;穴,內關;一氧化氮合酶;線粒體膜電位;大鼠

近年來,隨著冠心病的發病率逐年上升,發病年齡逐漸年輕化,有的發病年齡甚至不到30歲,因此,掌握冠心病的預防及治療方面的基本常識顯得尤為重要,本課題組經過大量的實驗及臨床研究證明電針內關穴對心肌缺血有明顯的改善作用[1-5]。一氧化氮(NO)是機體內重要的信使分子和效應分子,為神經傳遞、血管舒張、調節神經功能的內源性介質,與神經系統的生理和病理過程關系密切[6-8],而一氧化氮合酶(NOS)是 NO生物合成的限速酶。線粒體是介導細胞凋亡的重要細胞器,且可能是引發衰老和疾病的基礎原因。而兩者密切相關的關鍵點就是線粒體膜電位,線粒體膜電位是維持線粒體功能和結構的根本,它的改變將會造成線粒體膜發生一系列的功能和狀態的變化,線粒體膜電位的喪失被認為是心肌細胞凋亡早期的一個顯著的特征。內關穴為手厥陰心包經之絡穴,又為八脈交會穴之一,通于陰維脈,主治心痛、胸悶、心煩等心臟疾病及經脈循行部位的其他疾病[9-11]。本實驗主要通過觀察電針內關穴對實驗性大鼠心肌缺血后再灌注損傷與內源性保護物質NO、NOS及心肌線粒體膜電位的關系,為針刺內關穴防治心血管疾病及經穴臟腑理論提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選取SPF級雄性SD大鼠,250～300 g,共40只,由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供(SYXK湘 2013-0005,SCXK湘2013-0004)。隨機分為4組,假手術組、缺血再灌注模型組、針刺內關穴組、針刺環跳穴組,每組10只。

1.2 主要試劑與設備

細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);免疫組化檢測腺苷A1受體試劑盒,腺苷A1受體抗體規格1 mL(美國Santacruz公司),圖像分析軟件為 IPP(Image-Pro-Plus),顯微鏡(MOTIC BA210T);華佗牌 SDZ-Ⅴ型電子針療儀(蘇州醫療用品廠有限公司);漢醫牌一次性使用無菌針灸針(0.25 mm×13 mm,100支/盒)(長春愛泉醫療器械有限公司);醫用離心機臺式高速離心機 H1850動(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司);數字式心電圖機 ECG-1106G(深圳市凱沃爾電子有限公司);動物呼吸肌 ALC-V108(上海奧爾科特生物科技有限公司);流式細胞儀(南京建成生物工程研究所)。

1.3 造模方法

造模參照汪謙[12]的方法,大鼠 250～300 g以10%水合氯醛麻醉0.3 mL/100 g腹腔注射。行氣管插管后,接動物人工呼吸機(頻率 70～80次/min,潮氣量 5～6 mL/100 g),然后沿左側第4、5肋骨間開胸,輕輕剪破心包膜,提起左心耳,在冠狀動脈左前降支1/3處穿4“0”號線,置一硅膠管結扎,以心電圖ST段的改變及冠脈向外膨脹發紺為結扎成功標志,結扎 40 min后,剪開/取下硅膠管恢復左前降支灌流60 min,腹主動脈取血3～5 mL,摘取心臟。

1.4 穴位定位及處理方法

1.4.1 穴位定位

內關、環跳定位參照林文注主編《實驗針灸學》并結合解剖學定位。內關位于前肢內側,離腕關節約3 mm左右的尺橈骨縫間。環跳穴位于股骨大轉子后上緣凹陷處。

1.4.2 處理方法

參照汪謙[12]的方法,假手術組和模型組飼養至第7天,其中假手術組開胸,左冠狀動脈前降支上、中1/3交界處穿線不結扎,40 min后,再灌注60 min后,記錄心電圖,模型組左冠狀動脈前降支上、中1/3交界處穿線結扎,40 min后,再灌注60 min后,記錄心電圖。電針內關穴組和電針環跳穴組在進行心肌缺血再灌注損傷造模之前 7 d,每天給予電針刺激,分別針刺雙側內關穴和環跳并連接 SDZ-V型電子針療儀(10 Hz,疏密波),時間20 min,每日1次,共針刺7次后再行造模。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 心電圖Ⅱ導聯T波

分別打印各組大鼠術前、結扎后 1 min、結扎后40 min、再灌注后60 min心電圖圖紙,選取Ⅱ導聯T波電壓作為觀察指標,量取每只大鼠連續10個心動區間的T波電壓值,并計算出10個心動區間T波的平均值。

1.5.2 光鏡及電鏡觀察大鼠左心室缺血心肌細胞形態學的變化

1.5.2.1 標本采集

各組大鼠分別在造模結束后取材,用眼科小剪刀取下左冠狀動脈前降支穿線(假手術組)或結扎(模型組、電針內關組及電針環跳組)下段左心室心肌組織,將剪取的心肌組織迅速以冰冷的生理鹽水洗凈,并分成兩份,將其中一份心肌組織迅速修成 5 mm×1 mm×1 mm組織塊(約距心尖3～5 mm區域)后浸入2.5%戊二醛固定 24 h(4℃)用于觀察左心室缺血區組織超微結構;另一份心肌組織迅速放入含有0.1%DEPC的4%多聚甲醇固定液中固定,用于HE染色及免疫組化檢測。

1.5.2.2 HE染色觀察左心室缺血區組織病理形態學的變化

石蠟切片厚度5 μm,裱于干凈載玻片上,60℃烘箱中烤片4 h,而后二甲苯脫蠟兩次,每次15 min→100%乙醇Ⅰ→100%乙醇Ⅱ→95%乙醇→80%乙醇→蒸餾水蘇木素染胞核 10 min→10%鹽酸乙醇分化→自來水沖15 min(反藍)→蒸餾水Ⅰ→蒸餾水Ⅱ→伊紅染胞漿→各級乙醇脫水→二甲笨透明→樹脂膠封片→光鏡下觀察心肌細胞組織形態學變化,照相。

1.5.3 JC-1染色法測線粒體膜電位

取500 μL JC-1工作液將細胞均勻懸浮,37℃,5%CO2的培養箱中孵育 15～20 min;室溫離心(200 rpm,5 min)收集心肌細胞,用 500 μL 1×染色結合液洗兩次;吸取500 μL 1×染色結合液重新懸浮細胞,用流式細胞儀進行流式檢測。

1.5.4 硝酸還原酶化學比色法測NO、NOS

按NO、NOS試劑盒檢測步驟,用754紫外分光光度計測定NO、NOS活性;以硝酸還原酶比色法測定其組織蛋白含量。

1.6 統計學方法

應用SPSS16.0統計軟件,計量資料以均數±標準差表示。所有數據進行正態性檢驗,滿足正態性時,采用單因素方差分析。組間比較若方差齊時采用LSD法檢驗,方差不齊時用Tamhane’s T2法檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電針內關穴對大鼠心電圖T波的影響

各組大鼠術前T波電壓比較差異無統計學意義(P＞0.05),說明各組大鼠術前齊同可比。造模后各時段模型組、電針內關組、電針環跳組與假手術組比較差異有統計學意義(P＜0.01,P＜0.05),表明造模成功。結扎后40 min與再灌注60 min,與模型組比較,電針內關組T波均明顯下降(P＜0.01),而電針環跳組與模型組之間無明顯差異(P＞0.05),與電針內關組比較,電針環跳組T波均明顯升高(P＜0.01)。以上結果提示,電針內關穴預處理能改善心肌缺血再灌注大鼠心電圖T波。詳見表1。

表1 各組大鼠結扎后T波的比較 (±s)

表1 各組大鼠結扎后T波的比較 (±s)

注：與假手術組比較1)P＜0.01,2)P＜0.05;與模型組比較3)P＜0.01;與電針內關組比較4)P＜0.01

組別 n 結扎前 結扎后1 m i n 結扎后4 0 m i n 結扎后6 0 m i n假手術組 1 0 0.2 0 3±0.0 2 1 0.2 8 4±0.0 3 3模型組 1 0 0.2 0 8±0.0 2 4 0.4 1 9±0.0 4 41)電針內關組 1 0 0.2 0 7±0.0 2 2 0.3 8 8±0.0 4 31)電針環跳組 1 0 0.2 0 9±0.0 1 7 0.4 1 8±0.0 4 11)0.2 8 2±0.0 2 3 0.2 7 7±0.0 2 3 0.6 3 8±0.0 4 01) 0.4 1 6±0.0 4 21)0.4 9 4±0.0 3 91)3) 0.3 6 2±0.0 4 92)3)0.6 0 8±0.0 6 61)4) 0.4 1 1±0.0 4 61)4)

2.2 電針內關穴對大鼠心肌組織病理學改變的影響

假手術組心肌組織無明顯病理變化,心肌細胞排列整齊,胞核形態正常,胞質無嗜酸性變。模型組心肌細胞嚴重紊亂、斷裂,胞核固縮及胞漿嗜酸性變明顯,充血、水腫及炎細胞浸潤明顯。電針內關穴組心肌細胞紊亂、斷裂程度較輕,核固縮及胞漿嗜酸性變明顯減少,無明顯充血、水腫。電針環跳組心肌細胞紊亂、斷裂,核固縮及胞漿嗜酸性變明顯,有明顯充血、水腫及炎細胞浸潤。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學改變(×400)

2.3 電針內關對MlRl 大鼠NO、NOS含量的影響

模型組血清NO、NOS的含量與假手術組相比明顯下降(P＜O.01,P＜0.05);電針內關穴組血清 NO、NOS含量較模型組明顯升高(P＜0.01);電針內關穴組血清NO、NOS含量較假手術組和電針環跳組明顯升高(P＜O.01,P＜0.05);而電針環跳穴組與模型組間無明顯差異(P＞0.05)。以上結果提示,電針內關穴預處理可以使心肌缺血再灌注損傷大鼠血清中 NO的含量升高,NOS的活性增強。詳見表2。

表2 各組大鼠血清NO、NOS含量的比較 (±s,μmol/L)

表2 各組大鼠血清NO、NOS含量的比較 (±s,μmol/L)

注：與假手術組比較1)P＜O.05,2)P＜O.01;與模型組比較3)P＜0.01;與電針環跳組比較4)P＜0.05,5)P＜0.01

組別 n NO NOS假手術組 10 45.00±8.01 35.44±2.14模型組 10 30.52±6.241) 32.24±3.182)電針內關組 10 51.75±7.183)4) 37.80±1.943)5)電針環跳組 10 38.94±14.75 34.20±3.74

2.4 電針內關對MlRl大鼠線粒體膜電位的影響

當線粒體膜電位較高時 JC-1聚集在線粒體的基質中,形成聚合物,可以產生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時,形成單體,產生綠色熒光,用流式細胞儀檢測細胞凋亡的情況,綠色熒光通過 FITC通道通常為FL1來檢測,紅色熒光通過PI通道通常為FL2來檢測。正常細胞(FL-1亮,FL-2亮;R1),凋亡細胞(FL-1亮,FL-2暗;R2),流失檢驗結果如圖2。R1(右上限)代表正常細胞,R2(右下限)代表凋亡細胞,流式細胞儀檢測到的顯綠色熒光的細胞數(凋亡細胞)可間接反映細胞線粒體膜電位的大小,凋亡細胞值越大,線粒體膜電位就越低。各組大鼠心肌細胞線粒體膜電位見表3。

表3 各組大鼠心肌細胞線粒體膜電位的比較 (±s,%)

表3 各組大鼠心肌細胞線粒體膜電位的比較 (±s,%)

注：與假手術組比較1)P＜O.01;與模型組比較2)P＜0.05;與電針環跳穴組比較3)P＜0.05

組別 n R 1(紅色熒光)正常細胞(%)R 2(綠色熒光)凋亡細胞(%)假手術組 1 0 3 0.2 6±5.0 9 6 9.6 7±5.0 3模型組 1 0 1 0.2 3±1.7 51) 8 9.9 5±1.5 61)電針內關組 1 0 3 0.5 9±1 6.5 42)3) 6 9.0 9±1 6.5 52)3)電針環跳組 1 0 1 2.1 5±3.1 6 8 7.7 9±3.1 7

圖2 各組流式檢驗結果

表3所示模型組凋亡細胞較假手術組有所升高(P＜0.01),則線粒體膜電位就越低;電針內關穴組凋亡細胞較模型組和電針環跳組明顯下降(P＜0.05),則線粒體膜電位越高;而電針環跳穴組與模型組間無明顯差異(P＞0.05),電針環跳組與假手術組間也無明顯差異(P＞0.05)。以上結果提示電針內關穴預處理可以使MIRI大鼠線粒體膜電位升高。

3 討論

本研究選用在體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型來模仿心肌梗死患者接受再灌注治療的臨床事件。心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是在心肌缺血恢復血流后,其細胞代謝功能障礙及結構破壞反而加重的現象,這種由再灌注誘發的一系列有害反應,損傷表現為心肌頓抑,心肌壞死和心肌凋亡等[13]。缺血再灌損傷的機制也較為復雜,參與因素眾多。

NO是生物體內重要的信使分子和效應分子,具有神經介質和調質的功能,廣泛參與體內生理和病理活動。一氧化氮(NO)的合成需一氧化氮合成酶(NOS)的催化才能完成,NOS為一含鐵的單氧化酶,主要分布于血管內皮細胞、神經細胞、中性粒細胞和巨噬細胞等細胞內,可催化左旋精氨酸轉化為瓜氨和 NO[14],NO、NOS共同參與調控冠脈血管的收縮與舒張,對缺血后心功能的恢復及預后具有重要作用。但是NO在心肌缺血再灌注中是起保護因子作用抑或是起細胞毒性作用目前尚有爭議,NO可能發揮損傷或保護的雙重作用[15]。一些研究發現,缺血再灌注模型組NOS活性增強、NO釋放增多,組織形態學觀察可見肌原纖維內大量收縮帶,肌質網擴張,肌纖維內脂滴增多,心肌細胞連接處電子密度降低,肌絲排列稀疏,潤盤解離,局部肌纖維內線粒體腫脹嵴疏松,部分嵴消失,心肌細胞損傷嚴重[16]。本研究中模型組血清NO和NOS含量明顯低于假手術組,說明心肌缺血再灌注損傷能抑制NOS的活性,減少NO含量的生成;電針內關穴組NO、NOS含量明顯多于模型組,說明電針內關穴可以提高NOS的活性,促進NO的生成;而電針環跳組與模型組間NOS、NO含量無明顯差異,同時電針內關組與電針環跳組相比NOS、NO含量明顯升高,說明內關穴對心肌損傷具有特異性的保護作用,為“胸脅內關謀”臟腑經脈理論提供依據。

線粒體膜電位是維持線粒體功能和結構的根本,它的改變將會造成線粒體膜發生一系列的功能和狀態的變化。線粒體跨膜電位的下降被認為是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件。本研究結果顯示,與假手術組比,模型組出現大量凋亡細胞,且差異具有統計學意義,說明缺血再灌注損傷會導致線粒體膜電位下降,破壞線粒體膜的完整性;同時與缺血再灌注組比,電針內關組凋亡細胞數明顯減少,差異具有統計學意義,結果說明電針內關穴預處理可以提高心肌細胞線粒體膜電位,減少心肌細胞凋亡,從而保護心肌;與電針環跳組相比,電針內關穴組心肌細胞凋亡數明顯減少,差異具有統計意義,說明內關穴作為手厥陰心包經之絡穴,對保護心肌具有特異性作用。

有研究報道,NO通過抑制復合體Ⅰ阻止線粒體氧化應激,能夠抑制線粒體通透性轉移孔(MPTP)的開放,從而保持線粒體膜電位的穩定,發揮再灌注心肌保護作用[17]。本課題組近10年來,一直在研究電針內關穴對大鼠、家兔MIRI的保護作用及其機理,結果證明了電針內關穴對MIRI具有保護作用。以上實驗結果證實電針內關穴預處理對MIRI大鼠的保護作用,其可能作用機制與電針內關穴預處理可以增加心肌組織 NO含量、提高NOS活力,減少心肌細胞線粒體膜電位下降,穩定線粒體膜電位有關,從而達到抑制心肌細胞凋亡,減輕心肌再灌注損傷的目的。同時也證實了內關穴為保護心肌的特異性穴位,更好地為中醫治未病、臟腑經脈理論、“胸脅內關謀”提供實驗依據,也給我們臨床電針內關治療心血管疾病提供了保障。

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Effect of Point Neiguan(PC6) Electroacupuncture Pretreatment on NO, NOS and Mitochondrial Membrane Potential in Rats with Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury

SONG Jin,WANG Chao,YANG Ren-da,FENG Guo,TAN Cheng-fu,LIU Wei-wei,YAN Jie.Hunan University of Traditional Chinese Medicine School of Acupuncture and Massage,Changsha410208,China

ObjectiveTo explore the effect of point Neiguan(PC6) electroacupuncture pretreatment on nitric oxide(NO), nitric oxide synthase (NOS) and mitochondrial membrane potential by determining NO, NOS and mitochondrial membrane potential in rats with myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI).MethodForty male SD rats were randomized to sham operation, ischemia/reperfusion model, point Neiguan electroacupuncture and point Huantiao(GB30) electroacupuncture groups, 10 rats each. The model was made by coronary artery ligation.Before model making, electroacupuncture was given to the point Neiguan electroacupuncture and point Huantiao electroacupuncture groups, 20 min/d for a total of 7 d. T wave value in ECG lead Ⅱ was measured before and after model making. Myocardial pathomorphological changes were examined by HE staining. Serum NO and NOS contents were measured by a colorimetric nitrate reductase assay. Cardiomyocyte mitochondrial membrane potential was determined by fluorescence techniques.ResultSerum NO and NOS contents and mitochondrial membrane potential decreased significantly in the model group compared with the sham operation group (P＜0.05). Serum NO and NOS contents increased significantly in the point Neiguan electroacupuncture group compared with the model,sham operation and point Huantiao electroacupuncture groups (P＜0.01, P＜0.05). Mitochondrial membrane potential increased significantly in the point Neiguan electroacupuncture group compared with the model, point Huantiao electroacupuncture and sham operation groups (P＜0.01, P＜0.05). There was no statistically significant difference in mitochondrial membrane potential between the model and point Huantiao electroacupuncture groups (P＞0.05).ConclusionPoint Neiguan electroacupuncture pretreatment has a preventive protecting effect on MIRI rats. It produces a protecting effect on myocardium by increasing the NO content, strengthening NOS activity, reducing a decrease in cardiomyocyte mitochondrial membrane potential and inhibiting apoptosis.

Myocardial reperfusion injury; electroacupuncture; Point, Neiguan(PC6); Nitric oxide synthase;Mitochondrial membrane potential; Rats

R2-03

A

2017-03-25

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.10.1247

1005-0957(2017)10-1247-06

國家自然科學基金項目(81574080);湖南省中醫藥管理局課題(2015211);湖南省高校創新平臺開放基金項目(15k093); 2015年針灸推拿學湖南省“十二五”重點學科開放基金項目(序號06)

宋瑾(1990—),女,2014級碩士生

王超(1974—),女,副教授,碩士生導師,碩士,Email：592436380@qq.com