灸法早期干預對5XFAD轉基因小鼠β淀粉樣蛋白1-40表達的影響

余靜,包燁華,張永生,楚佳梅

(1.杭州市中醫院,杭州 310007;2.浙江中醫藥大學,杭州 310053)

灸法早期干預對5XFAD轉基因小鼠β淀粉樣蛋白1-40表達的影響

余靜1,包燁華1,張永生2,楚佳梅1

(1.杭州市中醫院,杭州 310007;2.浙江中醫藥大學,杭州 310053)

目的探討灸法早期干預對阿爾茨海默病模型(AD)小鼠腦內Aβ1-40的影響,對艾灸防治AD的作用機制進行探討。方法PCR法鑒定轉基因AD傳代小鼠的基因表型,選取1.5月齡雌性轉基因陽性Tg6799小鼠隨機分為模型組9只和治療組8只,同齡、同背景的C57BL/6J野生型雌性小鼠9只為正常組。治療組進行雙側心俞、腎俞麥粒灸治療,治療結束后,應用免疫組化法檢測小鼠額葉皮層及海馬區Aβ1-40的表達水平。結果與模型組比較,治療組小鼠大腦額葉皮層和海馬區Aβ1-40表達明顯減少(P＜0.01,P＜0.05)。結論艾灸療法早期干預可減少AD模型小鼠腦內Aβ1-40的表達,延緩AD病理過程的進展。

阿爾茨海默病;5XFAD轉基因小鼠;麥粒灸;早期干預;β淀粉樣蛋白1-40

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種漸進性的神經系統退行性疾病,由德國神經解剖學家和精神病醫生Alois Alzheimer于1906年首次發現并報道[1]。AD發生的比例約占癡呆的 60%～70%,是癡呆中最常見的一種形式[2-4],其起病隱匿,病程呈進行性惡化,記憶障礙是該病早期最突出的癥狀,隨著病情的發展,逐漸出現其他認知功能障礙,精神、行為障礙和日常生活能力下降等[5-6]。隨著老齡化社會的到來,AD的發病率不斷上升,成為老年人病亡率的第4位,嚴重威脅著人類健康和社會發展[7-8],因此 AD的早期研究、早期防控、對癥治療具有很大意義[9]。目前,尚缺乏安全、有效、經濟的AD治療藥物,西藥如鹽酸美金剛、鹽酸多奈哌齊均為單一作用靶點,長期使用不良反應明顯[10-13]。隨著科學的發展,醫學發展也開始著重于以預防為主,傳承了中醫學“治未病”的重要思想[14-16]。艾灸療法作為中醫特色療法,具有延年益壽、保健及預防疾病的功效[17-19]。研究發現艾灸能調節內分泌系統、免疫系統、自由基代謝等,提高機體的抗病能力[20-23]。研究表明,Aβ1-40寡聚體能夠通過激活 N-甲基-D-天冬氨酸受體,導致在組建突觸后膜致密體和在突觸囊泡轉運中起著核心與重要作用的 PSD95(postsynaptic density protein 95,PSD95)和發動機蛋白(motor proteins, MP)的降解,擾亂突觸的可塑性和完整性,并且能夠加重 Tau蛋白的過度磷酸化,影響 AD小鼠早期行為記憶功能[24]。本實驗通過觀察在AD病理早期介入麥粒灸治療對可以共同表達5個家族性阿爾茨海默病(familial Alzheimer's disease,FAD)基因突變的 5XFAD轉基因小鼠腦內β淀粉樣蛋白1-40(β-amyloid protein1-40,Aβ1-40)表達的影響,對艾灸防治AD的作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799 Vas/J品系轉基因AD小鼠雜合體種鼠4只,由中科院上海生命科學院生化所景乃禾研究員惠贈,配種鼠由中科院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司提供[SCXK(滬)2007-0005]。飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心 SPF級轉基因動物室,并進行保種、繁衍后代。繁殖體系為雄性的雜合子小鼠與野生型雌性小鼠交配。出生的子代小鼠在3～4星期后剪尾鑒定。本研究中動物實驗嚴格遵循實驗動物倫理審查所依據的動物保護原則、動物福利原則、倫理原則和綜合性科學評估原則。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑

艾絨(中國漢醫艾絨);瓊脂糖凝膠、溴乙錠(EB)(上海生工生物工程有限公司);10%水合氯醛(批號02030,上海化學試劑有限公司);PBS磷酸鹽緩沖液(ZLI-9062)(北京中杉金橋生物技術有限公司);兔抗Aβ1-40(批號為 bs-0877R,北京博奧森生物技術有限公司);SP試劑盒(批號為 13152A10,北京中杉金橋生物技術有限公司);濃縮型 DAB試劑盒(ZLI-9032)(批號為60882801,北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2.2 主要儀器

PTC-200 PCR擴增儀(Biorad公司);臺式冷凍離心機(Thermo公司);脫水機STP120(Micron公司);包埋機 AP280-2(Micron公司);切片機 HM335E(Micron公司)。

1.3 方法

1.3.1 PCR法鑒定APP/PS1轉基因小鼠基因表型

繁殖所產生雌性后代共29只,3周齡時剪取小鼠鼠尾(約 0.5 cm)放入 1.5 mL離心管內。每管中加入 0.5 mL裂解液,56℃轉動 2 h以上或過夜。離心20 min,取上清,加入等體積異丙醇混勻,放置30 min; 12000 rmp離心10 min,沉淀DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA片段,制備2%瓊脂糖凝膠加溴化乙錠5 μL,加入擴增后 DNA10 μL,120 V,30 min 電泳,觀察PCR產物長度。

1.3.2 動物分組和治療方法

PCR檢測結束后,共有APP/PS1雙轉基因鑒定結果為陽性的雌性小鼠17只,1.5月齡時將17只雌性小鼠按隨機數字表隨機分為模型組和治療組(模型組9只,治療組8只)。同齡、同背景的C57BL/6J陰性純合子(野生型)雌性小鼠9只(1.5月齡)為正常組。

1.5 月齡時開始進行治療。治療組,人工固定小鼠,以麥粒大小圓錐形艾炷(直徑5 mm,高8 mm)灸雙側心俞穴和腎俞穴,艾炷燃燒至3/5,即去除,每次灸1壯,每壯時間約25～30 s。正常組和模型組給予抓取、固定及放置未燃燒的艾炷等刺激。小鼠治療時間均為每日1次,10次為1個療程,共治療9個療程,療程之間間隔2 d(治療全部結束后小鼠為5月齡)。在治療過程中,治療組小鼠死亡1只,模型組死亡2只,考慮是因體質虛弱而死亡。

1.3.3 樣本取材處理

治療結束后,各組小鼠腹腔注射 10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)進行麻醉,打開胸腔,經升主動脈及左心室灌注生理鹽水及 4%多聚甲醛,灌注固定后斷頭,完整取出小鼠腦,置4%多聚甲醛中固定24 h后常規石蠟包埋。包埋完成后,于每只小鼠腦組織包埋蠟塊視交叉前、后連續冠狀切片。

1.4 觀察指標

免疫組化法檢測Aβ1-40表達。石蠟切片脫蠟至水,3%H2O2孵育10 min;PBS洗 5 min×3次。滴加封閉用正常山羊血清孵育1 h,傾棄,勿洗,滴加適合濃度稀釋的一抗(Aβ1-401：150),移至 4℃冰箱孵育過夜。次日 PBS沖洗,滴加二抗,37℃孵育1 h,PBS洗5 min×3次。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP),37℃孵育1 h,PBS沖洗5 min×3次;滴加DAB顯色劑,顯微鏡下觀察顯色情況,蘇木素復染,脫水,樹脂封片,顯微鏡觀察。采用Carl Zeiss Imaging Systems圖像分析儀拍照,每張切片海馬區和額葉皮層各取 6個視野(×40),采用計算機圖像分析軟件Image Pro-plus5.0進行分析,測量其陽性面積(area)、總光密度值(Integrated optical density, IOD)并進行匯總。

1.5 統計學方法

采用SPSSl7.0對數據進行統計分析,各組數據結果描述均以均數±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析(One-Way-ANOVA),組間兩兩比較,方差齊時采用LSD檢驗;方差不齊,采用Dunnett’s T3檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 APP/PS1轉基因小鼠基因表型鑒定結果

本實驗所用的 APP/PS1雙轉基因小鼠表型穩定,PCR法鑒定子代小鼠基因型,PCR產物長度為Tg(APP),轉基因 377bp,野生型324bp;Tg(PS1),轉基因 608bp,野生型324bp。

圖1 PCR法鑒定APP/PS1轉基因小鼠的凝膠電泳分析

所生雌性子代小鼠共29只,其中PCR產物長度為Tg(APP)377bp、Tg(PS1)608bp的APP/PS1雙轉基因陽性雌性小鼠17只作為本次實驗的研究對象,隨機分組為模型組(9只)和治療組(8只)。

2.2 各組小鼠額葉皮層及海馬區Aβ1-40表達的變化

各組小鼠海馬區和額葉皮層均可見棕黃色陽性表達,反應部位位于細胞胞漿和胞膜,細胞核呈陰性。與正常組比較,模型組小鼠額葉皮層及海馬區Aβ1-40表達陽性面積明顯增加,差異顯著(P＜0.01),總光密度值增高(P＜0.01);與模型組比較,艾灸治療后,治療組小鼠海馬區 Aβ1-40表達顯著下降(P＜0.01),額葉皮層Aβ1-40表達的陽性面積和總光密度值也明顯減少(P＜0.05,P＜0.01);與正常組比較;治療組小鼠腦內Aβ1-40表達水平無顯著性差異(P＞0.05),見圖2、圖3、圖4。

圖2 各組小鼠額葉皮層Aβ1-40表達的陽性面積和總光密度比較

圖3 各組小鼠海馬區Aβ1-40表達的陽性面積和總光密度比較

圖4 各組小鼠額葉皮層及海馬區Aβ1-40表達(免疫組化,×40,箭頭示Aβ1-40陽性細胞)

3 討論

β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)異常堆積形成的老年斑(senile plaque,SP)是AD的主要病理特征之一[25]。目前AD的病因及發病機制尚未完全闡明,Hardy JA等[26]提出的“淀粉樣蛋白級聯假說”是目前較為公認的AD發病機制學說。該學說認為Aβ的產生與清除失衡引起的Aβ沉積是AD病理改變過程的始發因素和中心環節,可以引起氧化應激、軸突損傷和突觸丟失等一系列級聯反應,最終造成神經元死亡,導致癡呆[27-29]。目前很多國內外研究都論證了這一學說,并證明 Aβ可以激活細胞炎癥因子引起神經炎癥反應,誘發tau蛋白磷酸化,誘導細胞凋亡,抑制海馬長時程增強,破壞突觸可塑性[30-31],因此減少或消除 Aβ的形成和沉積,增加 Aβ的清除,延緩或抑制細胞凋亡的發生是研究篩選防治AD的重要趨勢[32]。Aβ作為AD病理過程的一種觸發分子,它是由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)通過蛋白酶水解途徑裂解而來[33]。在病理情況下,APP在β分泌酶和γ分泌酶的先后作用下形成 Aβ,根據切割位點不同,可形成不同長度的Aβ,一般由39～43個氨基酸組成,其中最常見的類型是 Aβ1-40和 Aβ1-42[34]。Aβ1-42具有很強的聚集能力,神經毒性大,是老年斑的主要成份,但其本身并不能形成成熟的老年斑塊,只有在Aβ1-40聚集的作用下,才能形成成熟的具有神經毒性的老年斑[35]。Aβ1-40可經過血腦屏障轉運進入腦,促進 Aβ1-42的積聚,加速 Aβ引起的 AD病理過程[36]。大腦皮質和海馬的突觸損傷是AD腦內另一個突出的神經病理學改變,在AD早期即可出現。在AD腦中,突觸數量減少較神經元喪失更顯著,研究發現,不論是可溶性的Aβ1-40還是不可溶性的Aβ1-40與AD腦內的突觸損傷均有著很強的相關性,且引起突觸損傷的相關性要大于 Aβ1-42[37]。θ節律被認為是與學習記憶密切相關的腦電波,實驗研究表明,Aβ1-40隔閡內注射后,不僅可以引起膽堿能神經元及谷氨酸能神經元的大量丟失,抑制突觸之間的傳遞聯系,還可以引起海馬區θ節律的紊亂,從而造成學習記憶能力功能下降[38]。本研究所選用的5XFAD(familial Alzheimer's disease,FAD)轉基因小鼠可共表達β-APP Swedish突變(K670N,M671L)、Florida突變(I716V)、London突變(V717I)以及突變的早老素蛋白 1(Presinilinl,PS1)M146L、L286V 5個突變位點的基因突變,可全面、快速地模擬AD的病理過程和行為學特征[39]。5XFAD轉基因小鼠能夠在短期內產生APP、大量的Aβ沉積、神經膠質細胞增生,并隨年齡的增加逐漸加重,逐漸出現神經元死亡、行為學異常[40]。其中Tg6799模型鼠在1.5月齡時腦內已經開始出現 Aβ1-42的聚積,隨后逐漸發生Aβ1-40的顯著聚積,在2月齡時,開始出現明顯可見的淀粉樣蛋白沉積物和膠質細胞過度增生的神經炎性反應,另研究表明,在4～5月齡時,5XFAD轉基因小鼠開始表現出空間認知功能障礙[39,41]。因此,本研究選擇在5XFAD轉基因1.5月齡時介入麥粒灸治療,探討艾灸早期干預對AD病理過程進展的影響。

阿爾茨海默病屬中醫學“癡呆”“愚癡”“善忘”“郁證”等范疇[42-44],中醫學認為“心主神明”“腦為元神之府”,《素問·靈蘭秘典論》：“腎者,作強之官,伎巧出焉?！惫手嗅t學認為癡呆的發病與心、腦、腎關系密切,腎精不足、髓?？仗撌瞧涑Ｒ姴∫騕45-47],治療上常以培補腎元、填精益髓、健脾養心、補虛扶正為主[48]。艾灸作為傳統特色療法,已有數千年歷史。在身體尚未出現病癥之前或者還處于初發病階段,采用艾灸療法,可通過艾葉辛溫之性,激發人體經絡之氣,溫陽補虛,以達到補益人體正氣,防病保健“治未病”的目的[49]?，F代醫學研究表明,艾絨燃燒過程中輻射的近紅外線可穿透機體組織,誘導局部肌肉產生熱休克蛋白,激活機體的免疫系統,達到治病強身健體的作用[50]。此外,有研究表明,艾灸可以阻止海馬線粒體膜電位的耗散,抑制神經元凋亡,抑制氧化應激,改善腦能量的代謝障礙[51]。因此本研究選用心俞、腎俞進行麥粒灸法早期干預,利用艾灸灸火熱力對機體的溫熱刺激結合兩穴調節臟腑功能的作用以期達到養心安神、填精益髓之功。

隨著疾病醫學向健康醫學的轉變,醫學發展的方向也逐漸轉向預防為主,醫學的重點將是“防患于未然”“防微杜漸”,傳承了中醫學“治未病”的重要思想?！爸挝床　彼枷氡粴v代醫家奉為行醫治病的最佳境界,包含著未病先防、既病防變及瘥后防復三種觀念。在疾病發生之前,看見疾病征兆,提前介入中醫傳統治療,可預防疾病的進一步傳變[52]。本研究在5XFAD轉基因小鼠1.5月齡時腦內剛開始發生Aβ聚集的AD病理過程早期介入麥粒灸治療,通過艾灸治療后,與模型組比較,治療組小鼠額葉皮層和海馬區Aβ1-40的表達明顯減少。研究結果表明,艾灸治療AD的機制可能是通過早期抑制Aβ1-40的產生,進一步影響Aβ積聚形成成熟的具有神經毒性的產物,從而延緩 AD病理過程進展,達到“既病防變”的目的。

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Effect of Early Moxibustion Intervention on the Expression of Amyloid β-protein1-40in 5XFAD Transgenic Mice

YU Jing1,BAO Y e-hua1,ZHANG Y ong-sheng2,CHU Jia-mei1.1.Hangzhou Hosp ital o f T raditional Chinese Medicine,Hangzhou310007,China; 2.Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou310053,China

ObjectiveTo explore effect of early moxibustion intervention on cerebral Aβ1-40in a mouse model of Alzheimer disease (AD) and the mechanism of action of moxibusion in preventing and treating AD. Method Gene phenotype in transgenic AD passage mice was identified using PCR. One and a half-month-old female Tg6799 transgenic mice were randomly allocated, including nine mice to a model group and eight mice to a treatment group.Nine C57BL/6J wild type female mice of the same age and background constituted a normal control group.Wheat-grain-sized moxa cone moxibustion on bilateral points Xinshu(BL15) and Shenshu(BL23) was given to the treatment group. After the completion of treatment, Aβ1-40expression in mouse frontal cortex and hippocampal region was determined using the immunohistochemical method.ResultAβ1-40expression in mouse frontal cortex and hippocampal region decreased significantly in the treatment group compared with the model group (P＜0.01,P＜ 0.05).ConclusionEarly moxibustion intervention can decrease cerebral Aβ1-40expression and delay AD pathological process in a mouse model of AD.

Alzheimer disease; 5XFAD transgenic mice; Wheat-grain-sized moxa cone moxibustion; Early intervention; Amyloid β-protein1-40

R2-03

A

2017-03-12

1005-0957(2017)10-1253-07

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.10.1253

浙江省自然科學基金項目(LY13H270002)

余靜(1989—),女,醫師,碩士,Email：zegnajing@163.com

包燁華(1972—),女,主任醫師,碩士,研究方向為針灸治療腦功能障礙性疾病的基礎與臨床研究,Email：13336101400@163.com