熟三七飲片的HPLC指紋圖譜研究

連艷，黃鳳，蔣桂華

·品種品質·

熟三七飲片的HPLC指紋圖譜研究

連艷，黃鳳，蔣桂華*

目的：建立熟三七飲片的HPLC指紋圖譜，為其鑒別及質量控制提供依據。方法：采用HPLC方法，XAqua C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μ)色譜柱，流動相：乙腈-水（梯度洗脫），流速：1.0 mL．min-1，檢測波長203 nm，柱溫25 ℃。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件對圖譜進行處理。結果：建立了熟三七飲片的指紋圖譜，確定了16個共有峰，各熟三七樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜相似度均在0.9以上。結論：該方法具有重復性好、特征性強、方法簡便等特點，可用于熟三七飲片的品質評價。

熟三七；高效液相色譜；皂苷；指紋圖譜

三七為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根，始載于《本草綱目》，主產于我國云南、廣西等地，功效散瘀止血，消腫定痛。根據三七的不同炮制方法，炮制后的三七分“生三七”和“熟三七”。傳統中醫及民間對三七均有“生消熟補”之說，即生三七主要用于活血化瘀、止血止痛，熟三七主要用于補血和血，以滋補見長。現代研究表明，三七的主要活性成分為達瑪烷型四環三萜皂苷[1]。文獻報道[2-6]，生三七和熟三七的皂苷構成做HPLC分析，結果有明顯的差異，蒸制過程中皂苷類成分發生轉化。本文采用HPLC法建立熟三七飲片的指紋圖譜，為解決生、熟三七品質評價提供科學的方法。

1 儀器與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀；DAD紫外檢測器； BT25S型1/10萬電子分析天平，北京賽多利科學儀器有限公司。人參皂苷Rg1對照品(批號：110703-201128，中國藥品生物制品檢定所)；人參皂苷Rbl對照品(批號：110704-201424，中國藥品生物制品檢定所)；人參皂苷Rh4對照品(批號：14072505，成都普瑞法科技開發有限公司)；人參皂苷20(S)-Rg3對照品(批號：14030604，成都普瑞法科技開發有限公司)；人參皂苷20(R)-Rg3對照品(批號：14052908，成都普瑞法科技開發有限公司)；三七皂苷R1對照品(批號：110745-201318，中國藥品生物制品檢定所)；熟三七飲片，實驗室自制樣品（批號：161101）；乙腈為色譜級，Fisher Scienti fi c公司；其他試劑均為分析純（成都市科龍化工試劑）。

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜方法學考察

2.1.1 色譜條件 XAqua C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μ)；乙腈(A)-水(B) 為流動相；檢測波長203 nm；柱溫25 ℃；流速：1.0 mL．min-1；進樣量10 μL。梯度洗脫條件見表1，色譜圖見圖1.

表1 梯度洗脫程序

圖1 方法專屬性HPLC圖譜

2.1.2 參照物的選擇 三七的主要活性成分為皂苷類，蒸制過程中，生三七中的主要皂苷成分人參皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd和三七皂苷R1逐漸減少，同時有新的皂苷成分生成[2-5]，分別是人參皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5。本文結合藥效成分，同時兼顧生、熟三七中含有的成分，選擇三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3作為參照物，對熟三七飲片指紋圖譜進行定位。

2.1.3 參照物溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷20(S)-Rg3、人參皂苷20(S)-Rg3、人參皂苷Rh4及三七皂苷R1對照品適量，加甲醇制成每l mL 含三七皂苷R10.3 mg、人參皂苷 Rg11.0 mg、人參皂苷Rb11.0 mg、人參皂苷Rh40.2 mg、人參皂苷20(S)-Rg30.1 mg、人參皂苷20(R)-Rg30.06 mg的混合溶液，即得。

2.1.4 供試品溶液的制備 精密稱取熟三七粉末1.0 g，精密加入50 mL甲醇，稱定重量，超聲30 min，放至室溫，用甲醇補足失重，搖勻，過濾，取續濾液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得。

2.1.5 精密度試驗 取同一份熟三七飲片的供試品溶液連續進樣6次，記錄色譜圖并積分，圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版處理，得到各次進樣的相似度。結果表明，6次進樣所得指紋圖譜的相似度均高于0.96，符合指紋圖譜測定要求，精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 取同一份熟三七飲片按供試品溶液制備方法處理，分別在0，2，4，6，8，24 h進樣測定，記錄色譜圖并積分，計算24 h內進樣所得指紋圖譜的相似度。結果表明，24 h內進樣所得指紋圖譜的相似度均高于0.96，符合指紋圖譜測定要求，穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗 取同一批熟三七飲片6份，按供試品溶制備方法處理，分別進樣，記錄色譜圖并積分，計算6份藥材所得指紋圖譜的相似度。結果表明，6 份樣品所得指紋圖譜的相似度均高于0.97，符合指紋圖譜測定要求，重復性良好。

2.2 指紋圖譜的建立

精密吸取“2.1.3”項下的對照品溶液及“2.1.4”項下制備的供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄HPLC圖譜，生成10批次生三七及炮制品熟三七指紋圖譜，結果見圖2、3。通過與對照品的比較，確認1號峰為三七皂苷R1，2號峰為人參皂苷Rg1，5號峰為人參皂苷Rb1，12號峰為人參皂苷Rh4，13號峰為人參皂苷20(S)-Rg3，14號峰為人參皂苷20(R)-Rg3，其中5號峰人參皂苷Rb1在色譜圖中處在中間位置，且較穩定有助于色譜峰的辨認，故選擇此峰為參照峰，得到熟三七飲片對照指紋圖譜見圖4。以 5號峰人參皂苷Rb1為參照，去除溶劑峰后確定16個共有峰為構成熟三七飲片指紋圖譜的特征峰，樣品共有峰的相對保留時間及相對峰面積分別列于表2、3。10批熟三七飲片與對照指紋圖譜相似度計算結果分別為1.000，0.952，0.982，0.990，0.956，0.978，0.978，0.945，0.955，0.982。

圖2 10批生三七樣品匹配圖譜

圖3 10批熟三七樣品匹配圖譜

表2 10批熟三七飲片共有峰的相對保留時間

表3 10批熟三七飲片共有峰的相對峰面積

未知 0.519 0.412 0.438 0.387 0.398 0.387 0.433 0.421 0.394 0.412 9未知 0.264 0.166 0.180 0.203 0.136 0.151 0.188 0.131 0.153 0.170 10 未知 0.502 0.355 0.382 0.369 0.251 0.288 0.399 0.236 0.320 0.309 11 人參皂苷Rk3 1.559 0.689 0.687 0.876 0.623 0.686 0.774 0.655 0.662 0.723 12 人參皂苷Rh4 2.523 1.089 1.078 1.413 0.978 1.080 1.225 1.013 1.026 1.155 13 人參皂苷20(S)-Rg3 0.592 0.207 0.213 0.294 0.193 0.217 0.253 0.205 0.198 0.240 14 人參皂苷20(R)-Rg3 0.309 0.104 0.120 0.159 0.083 0.102 0.110 0.081 0.073 0.116 15 未知 1.037 0.370 0.389267 0.531 0.339 0.382 0.422 0.353 0.334 0.421 16 未知 1.376 0.478 0.506 0.708 0．429 0．493 0．543 0．442 0．416 0．549 8

3 討論

3.1 熟三七飲片HPLC指紋圖譜色譜條件考察，熟三七中皂苷類成分在反相HPLC上的分離規律：(1)有6個參照峰，按出峰順序依次為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd；(2)三七皂苷R1的分離度最好、最穩定；(3)人參皂苷Rg1與人參皂苷Re基本不受其他成分干擾，但是兩峰之間的分離則較為困難，文獻報道[7]人參皂苷Rg1與人參皂苷Re兩成分獲基線分離的變量“窗口”相當窄，絕大多數時候表現為完全重疊的單一色譜峰，本實驗在0～30 min保持等度洗脫，且以18.9%的乙腈梯度分離效果較好。

3.2 以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rh4、人參皂苷20(S)-Rg3、人參皂苷20(S)-Rg3為對照峰確定了熟三七飲片的16個共有峰，并通過相似度計算軟件得到10批熟三七飲片的對照圖譜及各批樣品與對照圖譜之間的相似度，結果均大于0.9，表明檢測方法穩定，重現性好，HPLC指紋圖譜可作為熟三七飲片的品質評價方法。

3.3 在數百年臨床應用中，三七被認定為“外傷科之圣藥、止血之神藥、理血之妙品”，可治一切血證，得到了極高評價[8]，經考證，三七補益功效有文字記載的最早時間是清朝，《本草綱目拾遺》首次記載了三七補益作用：“三七大如拳者治打傷，有起死回生之功，價與黃金等”，“三七頗類人參，人參補氣第一，三七補血第一，味同功亦等，故人并稱曰人參、三七為藥品中之最珍貴者”。指出了三七具有補益的功效，既能補血，又能補氣。此后，無論是醫家及民間對三七均有“生消熟補”之說[9]。曲媛等通過相關實驗證明人參皂苷Rh4的主要作用為抑制腫瘤[10]，人參皂苷Rg3為參一膠囊的主要成分，功效培元固本，補益氣血。三七炮制后人參皂苷Rg1、Rb1含量略有下降，但人參皂苷Rh4、人參皂苷20(S)-Rg3、人參皂苷20(S)-Rg3含量大幅增加，見圖1，進而熟三七表現出“補益”作用，初步研究可知，三七生、熟異治可能因為成分組成變化及配比變化而導致，具體作用機制尚待深入探討。

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（責任編輯：何瑤）

HPLC fi ngerprint analysis of processed Sanqi decoction/

LIAN Yan, HUANG Feng, JIANG Gui-hua//(School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: To establish the HPLC fingerprint chromatograms of processed Sanqi decoction, and provide evidence for the identi fi cation and quality control of processed Sanqi decoction.Method:The HPLC procedure was performed on XAqua C18chromatographic column. The mobile phase was acetonitrile and water in gradient elution with the fl ow rate of 1.0 mL．min-1. The detection wavelength was set at 203 nm and the column temperature was 25℃. The chromatograms was analyzed by “similarity evaluation system for chromatographic fi ngerprint of Traditional Chinese Medicine”.Result:Sixteen common peaks were selected as the fi ngerprint peaks of processed Sanqi decoction, and the similarities of the chromatograms were all larger than 0.9.Conclusion:The method of the HPLC fi ngerprint chromatogram is simple, accurate and stable, which is suitable for quality control of processed Sanqi decoction.

Processed Sanqi; HPLC; saponins; fi ngerprinting chromatogram

R 282

A

1674-926X(2017)02-008-04

成都中醫藥大學藥學院，中藥材標準化重點實驗室，中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

連艷(1990- )，女，助理實驗師，主要從事中藥品種與質量的研究工作Tel:18030415334 Email:715844015@qq.com

蔣桂華( 1970- )，女，碩士生導師，教授，主要從事中藥品種與質量的研究工作Tel:18980923782 Email:11469413@qq.com

2017-01-29