棉花BZR基因家族的全基因組鑒定及表達分析

郭新磊，路普，王園園，蔡小彥，王星星，周忠麗，王玉紅，王春英，王坤波*，劉方*

棉花BZR基因家族的全基因組鑒定及表達分析

郭新磊1#，路普1#，王園園2，蔡小彥1，王星星1，周忠麗1，王玉紅1，王春英1，王坤波1*，劉方1*

（1.中國農業科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽455000；2.河南科技學院/現代生物育種河南省協同創新中心，河南新鄉453003）

【目的】油菜素唑抗性因子 （Brassinazole resistant transcription factor，BZR）是植物油菜素內酯（Brassinosteroid，BR）信號通路中的1類重要轉錄因子，通過調控相關基因的表達，參與植物生長發育過程。本研究旨在探索棉花中BZR基因的數量及其功能。【方法】利用生物信息學方法，對雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉中的BZR基因進行全基因組鑒定及表達模式分析。【結果】雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉中分別有7、7和14個BZR基因；通過序列特征分析和系統發育分析可將棉花BZR基因分為2組（a組和b組）。內含子/外顯子結構分析發現：大部分BZR基因具有2個外顯子，a組成員中均具有較長的內含子序列，b組成員的內含子序列較短，同組BZR成員具有相似的基因結構。基因復制分析表明：片段復制是棉花BZR基因家族擴增的主要方式，棉花BZR基因在進化過程中經歷了嚴格的純化選擇。轉錄組數據分析表明：14個GhBZR基因在陸地棉的7個組織中特異表達，大多數GhBZR基因在莖、葉、花瓣和雌蕊中高表達；許多GhBZR基因的表達受非生物脅迫誘導。【結論】推測GhBZR基因可能參與棉花抗逆及纖維發育。本研究結果可為棉花BZR基因的生物學功能研究提供信息。

棉花；BZR基因；系統發育分析；表達分析

Abstract:[Objective]Brassinazole resistant transcription factors(BZR)play important roles in Brassinosteroid(BR)signal transduction in plants.The BZR gene family isinvolved in plant developmental processes by regulating the expression of related genes.The aim of this study isto characterize the number,evolutionary characteristics,and biological function of BZR genes in cotton.[Method]We conducted genome-wide identification and expression analysis of the BZR gene family in Gossypium raimondii,G.arboreum,and G.hirsutum.[Result]In this study,seven,seven,and 14 BZR genes were identified from G.raimondii,G.arboreum,and G.hirsutum,respectively.These BZR genes were grouped into two groups,a and b,based on their amino acid sequences and phylogenetic analysis.Gene structure analysis showed that most BZR genes contain two exons.Additionally,BZR genes in"a"group had a longer intron than those in"b"group;within the same group,BZR genes had a similar gene structure.Analysis of gene duplication revealed that segmental duplications played crucial roles in BZR gene family expansion,with cotton BZR genes experiencing purifying selection during evolution.Transcriptome data analysis showed that 14 GhBZR s had differing expression patterns in different organs;most GhBZR s were highly expressed in stem,leaf,petal,and pistil tissue,and were induced or repressed by abiotic stress.[Conclusion]These results suggest that GhBZR genes may beinvolved in stressresistance and fiber development in cotton.Furthermore,they provide information for further analysis aimed at uncovering the biological functions of BZR genes in cotton.

Keywords:cotton;BZR genes;phylogenetic analysis;expression analysis

油菜素內酯（Brassinosteroid，BR）是植物中的1類多羥基類固醇，參與發育和多種生理過程，包括細胞伸長、細胞分裂、衰老、維管分化、繁殖和光形態建成[1-4]。此外，BR作為應激緩解劑廣泛分布于植物中，保護植物免受各種環境脅迫的傷害，包括熱激、低溫、干旱、鹽堿、除草劑藥害和病蟲害[5-8]。油菜素唑抗性因子（Brassinazole resistant transcription factor，BZR）是植物特有的轉錄因子，廣泛分布于植物各種組織中，如根、莖、葉和花[9]，此類轉錄因子通過調控響應BR基因的表達在BR信號通路中發揮重要作用[10-11]。

研究發現BZR蛋白質具有高度保守的N-末端結構域，該結構域在體外和體內均具有DNA結合活性[10-11]。BZR1的DNA結合結構域由BZR基因的第1個外顯子編碼，是BZR家族蛋白最保守的區域，因此命名為BZR結構域[11]。擬南芥中的BZR1和BZR2/BR不敏感蛋白1-MES抑制子 1（BR insensitive 1-EMS-suppressor 1，BES1）是BR信號途徑中研究比較透徹的2個轉錄因子。在BZR1和BES1的N末端均有1個非典型的螺旋 -環 -螺旋（Basic helix-loop-helix，bHLH）的DNA結合基序，它們分別能與E-box（CANNTG）和 BRRE（CGTGT/CG）元件結合[10-11]。這些蛋白質的中部含有22～24個氨基酸的糖原合成酶激酶3（Glycogen synthase kinase，GSK3）家族磷酸化位點。另外，部分BZR成員還含有富含脯氨酸（Proline，P）、谷氨酸（Glutamic acid，E）、絲氨 酸（Serine，S）和蘇氨酸（Threonine，T）的序列（PEST基序），該基序控制蛋白質的穩定性[10]。

BR信號通路中，BR結合并激活受體激酶BR 不敏感蛋白 1（BRinsensitive1，BRI1），激活的BRI1與BRI1相關受體激酶（BRI1-associated receptor kinase，BAK1）相互作用，激活 BR 信號[12-13]，而激活的BRI1又可磷酸化BR信號激酶（BR-signaling kinase1，BSK1）， 磷酸化的 BSK1激活磷酸酶 BRI1抑制子 （BRI1 suppressor 1，BSU1），進而使BR感應蛋白（Brassinosteroid-insensitive 2，BIN2）激酶脫磷酸化而失活。失活的BIN2對BZR1轉錄因子的抑制作用消失，BZR1轉錄因子在蛋白磷酸酶2A （Protein phosphatase 2A，PP2A）作用下去磷酸化（活化），并在核內富集[14-18]。活化的BZR1和BES1能夠與下游基因啟動子特定區域結合，激活轉錄，從而調節BR靶基因的表達[10-11]。在植物BR信號通路中，BZR1和BZR2/BES1調控不同性狀基因的表達，參與調控植物的生長發育。Jiang等[19]發現BZR基因通過調控MINISEED3和HAIKU2等基因的表達控制種子的大小和形狀。BZR轉錄因子通過與光敏色素相互作用因子（Phytochrome-interacting factor，PIF）家族基因及DELLA基因互作，參與植物細胞生長和光形態建成[20-22]。此外，異位表達擬南芥BZR1-1D基因可提高番茄中類胡蘿卜素、可溶性糖和抗壞血酸含量，從而提升番茄果實的品質[23]。

通過鑒定和研究BZR的目標基因，揭示了BR信號通路中BZR轉錄因子的調控機制和轉錄網絡[24-27]。許多轉錄因子家族除調控生長發育外，還參與脅迫應答。但目前有關BZR轉錄因子與抗逆性關系的研究還極少有報道。鑒于亞洲棉、雷蒙德氏棉和陸地棉基因組測序已完成[28-31]，本研究對棉花BZR基因家族成員進行了鑒定，對BZR轉錄因子的理化特性、相關基因結構、系統進化關系、基因復制方式進行了分析，并對陸地棉中BZR基因的表達模式進行了研究，為進一步克隆和研究棉花BZR基因奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 棉花BZR蛋白家族成員的鑒定與分類注釋

雷 蒙 德 氏 棉 （Gossypium raimondii，D5，JGI_v2.1）、亞洲棉（G.arboreum，A2，BGI_v1.0）和陸地棉（G.hirsutum，AD1，NBI_v1.1）的基因組數據下載自Cottongen數據庫（https://www.cottongen.org/）。 從 Pfam 數據庫（http://pfam.sanger.ac.uk/）下載BZR蛋白保守結構域的隱馬爾科夫模型文件（PF05687.10）[32]，然后以 PF05687.10 為探針，利用HMMER 3.0軟件搜索這3個棉種蛋白數據庫，參數為默認值。同時，以擬南芥（Arabidopsis thaliana）[10]、水稻（Oryza sativa）[33]、蕪菁（Brassica rapa）[34]的BZR家族蛋白序列為探針，利用本地BLASTP程序，搜索這3個棉種蛋白數據庫（E值為10－2）。這2種方法所得蛋白序列即為候選的棉花BZR蛋白家族成員。將這些候選蛋白序列分別提交到在線軟件Pfam、SMART（http://smart.embl-heidelberg.de）[35]和 National Center for Biotechnology Information（NCBI）保守結構域數據庫（Conserved domain database，CDD）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）[36]，驗證是否具有BZR保守結構域，若存在BZR保守結構域則屬于BZR家族。目前BZR基因家族尚無系統的命名準則，本研究依據BZR家族基因成員所在的染色體以及在染色體上的位置進行命名。

1.2 序列分析與進化分析

根據BZR家族基因的gff注釋文件信息，利用基因結構顯示系統GSDS（http://gsds.cbi.pku.e-du.cn/）[37]分析基因結構特征，繪制基因結構圖。利用在線工具 ProtComp 9.0（http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc）預測BZR家族基因的亞細胞定位。利用在線工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質的相對分子質量（Mr）和等電點（pI）。 利用 DNAMAN 軟件對BZR家族蛋白進行多重序列比對，并展示保守位點。此外，利用在線程序MEME（http://meme.sdsc.edu/meme/）鑒定棉花BZR家族基因的保守基序。

采用ClustalW方法對擬南芥、蕪菁、水稻、雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉的BZR家族蛋白進行多重序列比對，利用MEGA 6.0軟件通過Neighbor-joining法構建系統進化樹。參數設置：模式采用 “Poisson correction”，數據缺失設置為“Pairwise deletion”， 校驗參數為 Bootstrap=1000。

1.3 染色體定位與基因復制分析

根據棉花基因組測序的基因注釋信息，利用MapChart 2.2軟件繪制棉花BZR基因的染色體定位圖，并確定其復制方式：在同一染色體上，如果2個同源BZR基因相鄰或間隔1個基因，可認為是通過串聯復制產生；利用MCScanX[38-39]軟件查找棉花基因組內染色體間的共線性區域（E值設為1×10－10），位于共線性區域的BZR基因看作是通過片段復制產生。使用在線工具PAL2NAL （http://www.bork.embl.de/pal2nal/，是基于PAML軟件中的codeml程序）[40]計算復制基因的堿基非同義替換率（Ka）和同義替換率（Ks）及Ka/Ks，若Ka/Ks＞1，則認為有正選擇效應；如果Ka/Ks=1，則認為存在中性選擇；如果 Ka/Ks＜1，則認為有純化選擇作用。 利用公式 T=Ks/r（r=7×10－9）估算復制事件發生的時間。

1.4 上游順式作用元件分析

根據雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉基因組數據，利用perl程序（由本實驗室編寫）提取各BZR基因序列轉錄起始位點ATG上游1500 bp序列，在PlantCARE數據庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）中檢索，從而鑒定基因上游區域可能存在的順式作用元件。

1.5 BZR家族基因的表達分析

從 NCBI的 Sequence Read Archive（SRA）數據庫下載陸地棉TM-1的轉錄組數據，登錄號為PRJNA248163（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA248163）[31]。采用有參基因組的轉錄組分析方法進行分析，利用公式log2(FPKM)標準化FPKM （Fragmentsper kilobase of transcript per million fragments mapped），導入軟件Mev 4.8繪制陸地棉BZR基因表達量熱圖。

2 結果與分析

2.1 棉花BZR家族基因的鑒定與命名

通過BLASTP和HMMER搜索獲得的候選氨基酸序列，用Pfam、SMART、CDD工具預測保守結構域，剔除不含完整BZR結構域的冗余序列，從雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉中分別鑒定出7、7和14個候選基因。目前該基因家族沒有標準的命名準則，本研究依據各基因所在的染色體 （從第1號染色體到第13號染色體再到scaffold）及在染色體上的位置進行命名 （表1），即GrBZR1～GrBZR7，GaBZR1～GaBZR7 和 Gh-BZR1～GhBZR14。亞細胞定位預測發現：雷蒙德氏棉和亞洲棉中的BZR基因均定位于細胞核，

而陸地棉中BZR基因都定位于細胞質和細胞核。

表1 棉花BZR 基因家族信息Table 1 The information of BZR gene family in cotton

蛋白質理化性質分析結果表明：棉花BZR基因編碼蛋白質長度為313～349個氨基酸，相對分子質量為33 980.0～37 711.2，理論等電點為7.60～9.12，為堿性。

2.2 序列分析與進化分析

根據棉花BZR基因系統發育分析，棉花BZR基因可分為2組，即a組和b組，分別包含16和12個成員，且各組內成員間具有相似的基因結構，編碼相似的結構域（圖1）。利用GSDS軟件對BZR基因的結構分析發現，絕大多數BZR基因具有2個外顯子，僅4個成員具有3個外顯子，且a組成員的內含子序列較b組的長。

利用在線工具MEME鑒定棉花BZR家族的保守基序，結果表明：棉花BZR家族中存在10個 motif，所有成員都包含 motif 1、2、7（圖 1 和圖2）。此外，a組成員還具有 motif 3、5、6，部分成員具有motif 10，部分具有motif 8；b組成員均具有motif 4、9、10。 其中，motif 1 是 N 端的 bHLH 結構，motif 2和motif 7是C端結構，motif 6是絲氨酸磷酸化位點，motif 8是PEST基序，motif 4則包含了絲氨酸磷酸化位點和PEST基序。

利用擬南芥、水稻、蕪菁、雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉中的BZR蛋白構建系統進化樹 （圖3），可將BZR家族分為2組，與上面系統發育分析的分組一致，推測這2組成員的不同結構可能賦予了它們不同的功能。其中，第1組中棉花具有16個成員，擬南芥僅有2個成員，在第2組中棉花含有12個成員，擬南芥有4個成員，與擬南芥相比，第1組BZR的編碼基因在棉花中發生了倍增。在進化樹中，水稻BZR與其他物種BZR親緣關系較遠，同為十字花科的擬南芥和蕪菁聚類，3個棉種 （雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉）聚類，表明BZR在近緣物種中相似度更高，并可能具有相似的功能。

2.3 基因定位與基因復制

雷蒙德氏棉的7個GrBZR基因分布在6條染色體上；亞洲棉的7個GaBZR基因分布在7條染色體上；陸地棉的14個GhBZR基因，有13個和1個基因分別定位于11條染色體和scaffold1329_A06上。串聯復制和片段復制是基因家族擴增的主要方式[41]，利用MCScanX對雷蒙德氏棉和亞洲棉基因組中的基因復制事件進行檢測表明：雷蒙德氏棉和亞洲棉中分別至少有5個和4個BZR基因經歷了片段復制，且這2個棉種均不存在BZR基因的串聯復制，表明片段復制是棉花BZR基因家族擴增的主要方式。經分析發現所有Ka/Ks均小于1，最大僅為0.154 8（表2），表明棉花BZR基因在進化過程中經歷了嚴格的純化選擇作用，暗示復制基因在進化中較為保守，結構比較穩定，功能具有一致性。

2.4 BZR基因上游順式元件分析

對雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉BZR基因轉錄起始位點上游區域1500 bp序列的順式作用元件分析結果顯示，棉花BZR基因上游存在許多植物激素響應元件、環境脅迫響應元件和植物生長發育相關元件（附表1，印刷版省略，參見本刊網站）。BZR基因上游發現的植物激素響應元件包括 ABRE、TGA、ERE、GARE、TATC、P-box、TCA、TGACG 和 CGTCA。 其 中 ，ABRE、TGA、ERE和TCA分別響應脫落酸、生長素、乙烯和水楊酸。GARE、TATC和P-box是赤霉素響應元件，TGACG和CGTCA均響應茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）。環境脅迫響應元件有7 種，包括 HSE、LTR、MBS、ARE、TC-rich repeats、Box-W1和GCmotif。HSE、LTR和MBS分別是熱、低溫和干旱響應元件，ARE和GCmotif是水淹或缺氧響應元件，Box-W1是真菌響應元件，TC-rich repeats是防御和脅迫響應元件。生長發育相關元件有：Skn-1_motif、circadian、GCN4_motif、CAT-box和CCGTCC-box，它們和植物的胚乳發育、分生組織發育及生物節律有關。

2.5 陸地棉BZR基因的表達分析

對GhBZR基因在棉花根、莖、葉、花瓣、雌蕊、雄蕊和副萼中的表達模式分析表明，14個GhBZR基因在這7個組織中都能夠特異性表達（圖5-A）。其中，GhBZR3和GhBZR9具有相似的表達特征，在7個組織中都高表達，暗示這2個基因可能具有相似的功能。相反，GhBZR4和GhBZR10在這些組織表達水平較低。GhBZR11、GhBZR12、GhBZR2、GhBZR5、GhBZR8 和 GhBZR14具有明顯的組織特異性表達特征，它們在莖、葉和雌蕊中高水平表達，而在其他組織中低水平表達。此外，大多數BZR基因在莖、葉、花瓣和雌蕊中都高表達，暗示了BZR基因可能參與棉花莖、葉和雌蕊的發育。

圖1 棉花BZR 家族基因的結構與編碼的結構域Fig. 1 The gene structures and encoding domains of BZR genes in cotton

圖2 雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉（TM-1）BZR蛋白的多序列比對分析Fig.2 Alignment of amino acid sequences of BZR proteins in G.raimondii,G.arboreum and G.hirsutum

圖3 棉花BZR與其他植物BZR的系統進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of BZRs in cotton and other plants

圖4 BZR家族基因在棉花染色體上的分布及復制分析Fig.4 Chromosomal distribution and duplication analysis of BZR genes in cotton

表2 雷蒙德氏棉和亞洲棉中發生復制的BZR基因的堿基替換率Table 2 Synonymous and nonsynonymous substitution rates for the duplication events in GaBZR and GrBZR genes

BZR是1類植物特有的轉錄因子，在BR信號通路中發揮了重要作用，但有關棉花BZR轉錄因子抗逆性的研究未見報道。因此，本研究對陸地棉BZR基因在PEG-6000、鹽、低溫和高溫處理下的表達情況進行了研究（圖5-B）。PEG和鹽處理后BZR基因表現相似的表達特征，一半左右的BZR基因在處理1 h后上調表達，這部分基因全都是a組基因；而另一半基因則在處理6 h后上調，該部分基因主要是b組基因。在高溫處理下，大部分基因在處理6 h后上調表達；而在低溫下，大部分基因在處理3 h后呈現下調表達。

圖5 14個陸地棉BZR家族基因表達模式Fig.5 Expression patterns of 14 GhBZR genes

3 討論

BZR家族作為BR信號通路中的1類重要轉錄因子[10-11]，其家族基因成員的鑒定對棉花BZR基因的生物學功能分析及BR信號通路的研究具有重要意義。亞洲棉、雷蒙德氏棉和陸地棉基因組測序的完成，為棉花BZR基因家族的預測和分析提供了便利。擬南芥和蕪菁分別有6個和15個BZR基因[10,34]。本研究分別從雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉中鑒定出7、7和14個BZR轉錄因子。棉花BZR基因在二倍體棉中數目相等，結構相似（如GrBZR1和GaBZR2），表明BZR基因在雷蒙德氏棉和亞洲棉間高度保守。通過系統發育分析及基因結構分析發現：棉花BZR基因可分為2組，同組基因具有相似的基因結構，且外顯子數目幾乎一致；a組基因內含子序列較b組的長。結構域分析及序列比對發現，組內BZR基因編碼的蛋白具有高度保守的結構域，2組基因編碼的蛋白具有不同的保守結構域，推測這2組基因可能具有不同的功能。

棉花BZR基因上游存在環境脅迫響應元件，包括LTR低溫響應元件、MBS干旱響應元件等，以適應環境變化。通過構建系統進化樹，得到蕪菁BZR基因與雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉BZR基因的進化關系，有助于推測BZR基因在棉花中的功能。蕪菁的2個自交系Chiifu和Kenshin經冷害、凍害脅迫后，BrBZR1-1、BrBES1-3、BrBEH4、BrBEH6、BrBEH7 和 BrBEH8的表達量發生顯著變化，經冷害處理的耐低溫自交系Chiifu中BrBZR1-1和BrBES1-3的表達量要比凍害處理高，而自交系Kenshin中BrBEH8在2種脅迫下表達量均較高[42]，蕪菁的BZR基因家族中BrBEH基因在冷害或凍害下的誘導性比BrBZR1、BrBES1更強[43]。蕪菁的BrBEH基因與本研究的棉花a組GhBZR基因同源性較高，暗示a組GhBZR基因可能在棉花抵御冷害、凍害脅迫中起重要作用。Sun采用ChIP-chip的方法鑒定出許多BZR的靶標基因，其中包括參與抗旱耐鹽的基因RD26、ERD14和STZ以及耐冷相關基因CBF2[25]，暗示BZR可能在植物抗旱耐鹽等過程具有重要作用。本研究中，GhBZR6、GhBZR1和GhBZR7在PEG及鹽處理后的1、3和6 h均上調表達，它們可能參與棉花抗逆過程。

前人研究發現BZR轉錄因子參與細胞伸長和植物的光形態建成[20-22]。研究發現，無BR信號時，磷酸化的BZR1和14-3-3蛋白結合而滯留在細胞質內，當有BR信號時，BZR1去磷酸化，與14-3-3蛋白分離，進入細胞核中聚集，從而調控植物的生長發育[10,44-45]。目前已從陸地棉中得到8個14-3-3基因，有6個在棉花纖維中優勢表達，其中5個的編碼產物與BZR蛋白存在互作[46]。周穎等從陸地棉中鑒定出1個BZR轉錄因子，該轉錄因子通過保守基序與14-3-3蛋白相互作用，參與棉纖維細胞的伸長發育[45]。本研究發現大多數GhBZR基因在莖、葉、花瓣和雌蕊中都高表達，由此推測BZR轉錄因子在棉花纖維發育中發揮重要作用。

4 結論

以二倍體雷蒙德氏棉、亞洲棉和四倍體陸地棉為研究對象，分別鑒定得到7、7和14個BZR基因，分析了其位置、結構及編碼產物的等電點、相對分子質量和結構域，并通過系統進化分析將棉花BZR家族基因分為2組。一些GhBZR基因的表達具有組織特異性并響應非生物脅迫，推測GhBZR基因可能參與棉花抗逆及纖維發育。棉花BZR基因的全基因組鑒定及表達分析，為挖掘棉花BZR基因潛在的功能奠定了基礎。

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Genome-Wide Identification and Expression Analysis of the Gene Family Encoding Brassinazole Resistant Transcription Factors in Cotton

Guo Xinlei1#,Lu Pu1#,Wang Yuanyuan2,Cai Xiaoyan1,Wang Xingxing1,Zhou Zhongli1,Wang Yuhong1,Wang Chunying1,Wang Kunbo1*,Liu Fang1*
(1.Institute of Cotton Research of the Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology,Anyang,Henan 455000,China;2.Henan Institute of Science and Technology/Collaborative Innovation Center of Modern Biological Breeding,Henan Province,Xinxiang,Henan 453003,China)

S562.01

A

1002-7807（2017）05-415-13

10.11963/1002-7807.gxllf.20170830

2016-12-29 第一作者簡介：郭新磊（1989―），男，碩士，guoxlcaas@163.com；路普（1992―），男，碩士研究生，lupu1992@163.com；#同等貢獻。*通信作者：劉方，liufcri@163.com；王坤波，wkbcri@163.com

國家自然科學基金（31671745）；國家重點研發計劃（2016YFD0101401，2016YFD0100203）