三維細胞培養(yǎng)技術(shù)的研究與展望

郝永紅+王梓如+侯毅鞠

摘 要：單層細胞培養(yǎng)由于細胞是在改變的體外環(huán)境下增值生長，因此會喪失原有組織的性狀，不利于科學(xué)研究。而體外三維培養(yǎng)技術(shù)是將細胞、細胞基質(zhì)放到體外去培養(yǎng)，并且營造與體內(nèi)相似的內(nèi)環(huán)境，使細胞能夠表達合理的基因及性狀，有觀察直觀和條件可控的優(yōu)點。本文對三維細胞培養(yǎng)技術(shù)在諸多生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，以及對此技術(shù)的未來發(fā)展做一綜述。

關(guān)鍵詞：細胞培養(yǎng)；腫瘤治療；腫瘤血管形成；器官再造

中圖分類號：Q943.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-2064（2017）17-0203-02

單層細胞培養(yǎng)于1885年以來首次從雞胚中分離出細胞建立體外培養(yǎng)[1]，距今有百年歷史，在此期間單層細胞培養(yǎng)技術(shù)為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶了新的希望，但隨著科技的進步，人類對于健康不斷提出更高的要求，雖然人類越來越多的疾病可以被治愈，同時也存在許多有待解決難題，比如器官移植存在的排斥反應(yīng)、移植器官來源少等問題，在未來能很好解決這一問題的技術(shù)即三維細胞培養(yǎng)技術(shù)。這一技術(shù)的出現(xiàn)，給醫(yī)學(xué)界帶來了更大的進步和希望。

1 三維細胞培養(yǎng)技術(shù)

三維細胞培養(yǎng)技術(shù)（three-dimensional cell culture， TDCC）是指將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養(yǎng)，利用各種方法及材料，使細胞在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長，構(gòu)成三維的細胞-載體復(fù)合物。更接近于體內(nèi)生長模式，形成類似體內(nèi)組織的結(jié)構(gòu)，發(fā)揮其功能。[2，3]三維細胞培養(yǎng)技術(shù)在抗癌藥物的篩選、組織形成、血管發(fā)育等發(fā)育生物學(xué)的分支領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

2 三維細胞培養(yǎng)技術(shù)的分類

2.1 基于scaffold的培養(yǎng)體系和無scaffold的培養(yǎng)體系

Scaffold則又有天然成分和人工合成成分之分?；趕caffold的培養(yǎng)體系是沒有供細胞粘附、生長和擴散的支撐結(jié)構(gòu)，使培養(yǎng)基中的細胞聚集成為類似于組織的微組織球體（micro tissue spheroids）。無scaffold的培養(yǎng)體系可通過懸滴（hanging drops）讓細胞在重力的作用下通過自組裝形成微球體。這種方法的優(yōu)點是可以通過控制懸滴而精準(zhǔn)的控制微組織球，使其具有高一致性，為后續(xù)研究提供好的微組織材料。而且通過懸滴法可以實現(xiàn)對不同細胞類型的共培養(yǎng)，保證共培養(yǎng)細胞間的信息交流。無scaffold的培養(yǎng)體系天然ECM作為支持材料的3D培養(yǎng)，這種方法以天然ECM作為支持材料，根據(jù)培養(yǎng)細胞類型，優(yōu)化3D培養(yǎng)基質(zhì)配方，以滿足不同組織細胞的培養(yǎng)需求。但天然基質(zhì)材料存在一定病原風(fēng)險，且材料可能存在批次差別性等缺點。而人造基質(zhì)作為支持材料的3D培養(yǎng)方法，合成的人造基質(zhì)材料類型相當(dāng)多，可使體外細胞培養(yǎng)更接近體內(nèi)的生理特征，是基礎(chǔ)研究、藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的理想選擇。

2.2 靜止性三維細胞培養(yǎng)和動力性三維細胞培養(yǎng)

靜止性三維細胞培養(yǎng)是把細胞直接種植在三維載體上，體外不施加任何物理方法下進行的培養(yǎng)。采用靜止細胞培養(yǎng)方法不利于細胞向載體內(nèi)部生長，培養(yǎng)液很難擴散滲透到載體的中心，氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)擴散和代謝物排出受限，從而影響載體內(nèi)部細胞的代謝活性。因此，需要改善培養(yǎng)條件或細胞種植方法來解決細胞活性降低、數(shù)量不足和分布不均勻的問題。動力性三維細胞培養(yǎng)就是根據(jù)細胞在自然條件下生長受力情況，在培養(yǎng)過程中適當(dāng)應(yīng)用物理方法。動力性三維細胞培養(yǎng)不僅為細胞生長提供了適宜的生物性微環(huán)境和力學(xué)刺激，而且能更好地促進細胞功能的發(fā)揮。由上可見，當(dāng)前的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的完善，越來越趨向于模擬體內(nèi)正常的環(huán)境。

3 三維細胞培養(yǎng)技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1 三維細胞培養(yǎng)技術(shù)與腫瘤醫(yī)學(xué)

3.1.1 抗腫瘤治療

腫瘤是人類的一大頑疾，伴隨醫(yī)學(xué)研究技術(shù)的不斷進步，抗腫瘤藥物層出不窮，不斷更新，化療仍是治療腫瘤的重要手段，在抗癌藥物的研發(fā)過程中藥物篩選極其重要。而三維細胞可以高度模仿腫瘤細胞的生長狀態(tài)，可以提供腫瘤細胞與體內(nèi)相似的酸堿度、營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子等內(nèi)環(huán)境，還可以充分展示細胞-細胞、細胞-基質(zhì)間的相互作用，有利于抗癌藥物藥效的測定。Ong等[4]在觀察三維多細胞腫塊球形體藥透時，發(fā)現(xiàn)細胞外基質(zhì)蛋白可能是藥物滲透的屏障，該現(xiàn)象在體內(nèi)也常被發(fā)現(xiàn)，是腫瘤耐藥的較常見原因之一。Hkanson等[5]研究三維模型中環(huán)境參數(shù)對抗腫瘤藥物的影響時，發(fā)現(xiàn)細胞間連接、維度（dimensionality）、基質(zhì)組成的微環(huán)境均影響乳腺癌細胞MCF-7對抗腫瘤藥紫杉醇的反應(yīng)，尤其在纖維蛋白為基質(zhì)培養(yǎng)生長的細胞，藥物敏感明顯降低，與體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，纖維蛋白表達上調(diào)會增強乳腺腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移相一致。三維細胞培養(yǎng)技術(shù)在抗腫瘤治療領(lǐng)域，較好的彌補了單純二維培養(yǎng)的不足，成為抗腫瘤治療的關(guān)鍵。

3.1.2 腫瘤耐藥機制研究

腫瘤細胞對抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥，是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的常見因素。已有研究表明，乳腺癌干細胞會對乳腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生較大影響。通過模擬腫瘤微環(huán)境，可更好地對乳腺癌干細胞增殖與分化情況進行分析。陳峻崧等[6]將普通二維養(yǎng)與卵巢癌腫瘤干細胞維比，探討符合體內(nèi)環(huán)境的三維培養(yǎng)條件，研究腫瘤生長、耐藥等影響因素及機制。結(jié)果表明，與二維培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)卵巢癌HO8910細胞系中CD44+CD117+CSCs表現(xiàn)出明顯的耐藥性，表明BME基質(zhì)膠三維培養(yǎng)模型可作為靶向治療腫瘤與細胞藥物篩選的理想體外模型。

3.1.3 腫瘤血管形成

腫瘤的生長利于血管新生，利用腫瘤血管生成的研究可以觀察腫瘤組織內(nèi)微血管的形態(tài)與功能，闡明腫瘤誘發(fā)血管新生的機制及血管生成與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。已經(jīng)研究證實血管組織再生需要細胞、細胞外基質(zhì)、信號系統(tǒng)共同參與完成。三維細胞培養(yǎng)技術(shù)可使細胞立體生長，在接近體內(nèi)微環(huán)境中，更好的模擬了體內(nèi)細胞三維的生長環(huán)境，并在生長因子的作用下內(nèi)皮細胞的遷移、增殖、分化，最后出芽形成新的血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[7]三維腫瘤模型更好地體現(xiàn)了體內(nèi)腫瘤的生物學(xué)特性，并可通過特定的成像系統(tǒng)實現(xiàn)其可透見性，動態(tài)追蹤細胞的生長乃至發(fā)展形成腫瘤的整個過程，因而可對腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移過程進行長期動態(tài)觀察。

3.2 三維細胞培養(yǎng)與骨及軟骨的創(chuàng)造

不同來源的骨細胞與不同材料的三維立體結(jié)構(gòu)載體在體外共同培養(yǎng)，構(gòu)成骨細胞載體復(fù)合物的三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。[8]以此三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)再生出軟骨、骨、半月板等骨組織。該系統(tǒng)常在細胞外基質(zhì)領(lǐng)域運用干細胞研究干細胞發(fā)育潛力；在聚合物生長支架領(lǐng)域運用軟骨細胞研究細胞分化；在復(fù)合組織培育領(lǐng)域運用軟骨細胞和上皮細胞研究組織間相互作用；在模擬生物支架領(lǐng)域運用成骨細胞研究生物材料研究；在氧氣供應(yīng)領(lǐng)域利用成骨細胞和內(nèi)皮細胞研究骨血管化。[9]這一發(fā)現(xiàn)為各個領(lǐng)域在體外培養(yǎng)骨及軟骨提供依據(jù)。

3.3 三維細胞培養(yǎng)與肝臟修復(fù)

在一定的培養(yǎng)條件下，肝細胞在基質(zhì)孔隙中重組形成許多有功能的聚集體，這些聚集體中可能具有接近的細胞-細胞接觸[10]，為肝細胞的體外培養(yǎng)提供類似于體內(nèi)環(huán)境的結(jié)構(gòu)，可以表現(xiàn)出比單層貼壁培養(yǎng)的肝細胞更好的生理功能。Schmelzer利用具有獨立中空纖維膜系統(tǒng)三維多室生物反應(yīng)器，培養(yǎng)人原代肝實質(zhì)和非實質(zhì)細胞[11]該系統(tǒng)擁有的培養(yǎng)液循環(huán)系統(tǒng)可以增加細胞團中心細胞攝入營養(yǎng)和氧氣，幫助其排除代謝廢物和二氧化碳。結(jié)果顯示所培養(yǎng)的實質(zhì)細胞團塊內(nèi)可見復(fù)雜的膽管網(wǎng)絡(luò)和祖細胞樣的細胞集落，并檢測到血管樣結(jié)節(jié)部位的分裂細胞中含肝細胞生長因子[12]，這一發(fā)現(xiàn)為臨床上體外培養(yǎng)肝細胞，用于肝臟修復(fù)及移植提供依據(jù)。

3.4 三維細胞培養(yǎng)與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

三維細胞培養(yǎng)技術(shù)在神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域也有涉及，近來有實驗培植單一神經(jīng)元成為多細胞聚集體、海馬體活標(biāo)本切片后測試神經(jīng)元電勢、神經(jīng)干細胞培養(yǎng)治療老年癡呆癥、帕金森病等。在藥物測試中運用神經(jīng)元細胞聚集體進行毒理實驗；在和生物材料的接觸效應(yīng)中運用神經(jīng)元研究生物材料的體內(nèi)可降解性；在生長支架中運用神經(jīng)元和基質(zhì)研究再生過程；在信號識別中運用神經(jīng)干細胞研究組織整合；在微質(zhì)量培養(yǎng)中運用干細胞研究干細胞分化潛力。[13]這一發(fā)現(xiàn)為治療精神疾病及神經(jīng)系統(tǒng)研究提供寶貴依據(jù)。

4 展望

客觀來說三維細胞培養(yǎng)技術(shù)的誕生是令人矚目的，在器官再造、器官修復(fù)、抗腫瘤藥物的篩選等諸多領(lǐng)域取得里廣泛的應(yīng)用，除了這些醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，它也可在植物細胞領(lǐng)域中有所發(fā)展，以此研發(fā)出各種稀有中草藥。三維相對于二維細胞培養(yǎng)的優(yōu)勢非常明顯，更接近細胞的體內(nèi)狀態(tài)；能夠提高細胞因子、抗體及其他生物分子等的產(chǎn)量；能夠改進細胞培養(yǎng)效率，細胞在三維環(huán)境中比在二維環(huán)境中生長更健康；實驗數(shù)據(jù)更可靠。但三維細胞培養(yǎng)技術(shù)與此同時也存在著許多問題需要改進，例如三維細胞培養(yǎng)的細胞不能永生化，同時分化能力也受到限制，使細胞處于亞佳狀態(tài)。對于相對復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，單靠三維細胞培養(yǎng)技術(shù)是不足夠的。因此三維細胞培養(yǎng)技術(shù)需要不斷完善不斷進步，與細胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、分子免疫學(xué)、生物材料學(xué)等領(lǐng)域相結(jié)合，奠定好組織工程學(xué)的基礎(chǔ)，使其更好的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

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