不同初加工滇龍膽HPLC指紋圖譜及其有效成分含量測(cè)定

左智天，王元忠，張 霽，趙艷麗，王家金 *

(1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650205；2. 云南省省級(jí)中藥原料質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)服務(wù)中心，云南 昆明 650200)

不同初加工滇龍膽HPLC指紋圖譜及其有效成分含量測(cè)定

左智天1,2，王元忠1,2，張 霽1,2，趙艷麗1,2，王家金1,2 *

(1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650205；2. 云南省省級(jí)中藥原料質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)服務(wù)中心，云南 昆明 650200)

建立不同初加工方法滇龍膽(Gentianarigescens)樣品的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜，并測(cè)定其中馬錢苷酸、獐芽菜苦苷、龍膽苦苷和當(dāng)藥苷4種有效成分含量，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)4種有效成分含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)，對(duì)9種初加工方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，樣品間相似度高于0.960。經(jīng)水洗凈后室內(nèi)通風(fēng)干燥處理的滇龍膽中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷含量最高，分別為(5.89±0.23)、(15.62±0.84)和(3.79±0.16)mg/g，微波帶皮處理的滇龍膽中馬錢苷酸含量最高，為(8.58±1.48)mg/g，4種有效成分總含量達(dá)到(27.67±6.09)mg/g。主成分分析結(jié)果顯示，前2個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為86.822 %，與4種有效成分的線性關(guān)系為F(PC1)=-0.003X1+0.409X2+0.31X3+0.398X4,F(PC2)=0.875X1-0.168X2+0.329X3-0.078X4；計(jì)算不同初加工滇龍膽的主成分綜合得分排名，帶皮水洗后室內(nèi)通風(fēng)干燥滇龍膽綜合得分最高。不同初加工處理對(duì)滇龍膽有效成分的含量會(huì)產(chǎn)生影響，其中帶皮水洗后通風(fēng)干燥的傳統(tǒng)初加工方法對(duì)滇龍膽品質(zhì)影響最小，是理想的初加工方法。

初加工；中藥指紋圖譜；主成分分析；滇龍膽

傳統(tǒng)中藥的加工炮制技術(shù)在不同程度上影響原材料中有效成分含量及相關(guān)生物代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化[1]，關(guān)系到臨床用藥的安全性及中成藥質(zhì)量的穩(wěn)定性[2-3]。對(duì)中藥材進(jìn)行初加工有利于后續(xù)干燥，方便其儲(chǔ)存與運(yùn)輸，從而達(dá)到防腐、防霉、防蟲蛀等目的，在整個(gè)炮制過程中具有重要作用[4]。近年來國內(nèi)用藥需求不斷增大，藥材的內(nèi)在品質(zhì)受到普遍關(guān)注，由于人為因素造成的藥材質(zhì)量不穩(wěn)定，尤其加工炮制的粗放導(dǎo)致藥品市場(chǎng)魚龍混雜，故對(duì)藥材加工炮制技術(shù)的規(guī)范和評(píng)價(jià)顯得尤為重要[5]。目前，國內(nèi)對(duì)不同加工炮制的傳統(tǒng)中藥一般多采用光譜法、色譜法測(cè)定其有效成分含量，或結(jié)合指紋圖譜法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[6]。

中藥指紋圖譜技術(shù)(Traditional chinese medicine fingerprints，TCMF)出現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，該技術(shù)可針對(duì)中藥成分的復(fù)雜性從整體上表征中藥的內(nèi)在品質(zhì)，滿足國際社會(huì)對(duì)于藥品“安全、有效、可控、穩(wěn)定”的基本要求，是國際公認(rèn)的中成藥質(zhì)量控制方法[7]。美國食品藥品管理局(FDA)、德國藥用植物學(xué)會(huì)、英國草藥典、印度草藥典、加拿大藥用及芳香植物學(xué)會(huì)等接受指紋圖譜技術(shù)并將其納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一部分，該技術(shù)的國際地位得到顯著提高[8]。作為一種綜合的、可量化的中藥質(zhì)量控制手段，中藥指紋圖譜的唯一性、全息性能夠?qū)χ兴幉牡恼鎮(zhèn)巍?yōu)劣、產(chǎn)地、藥用部位進(jìn)行有效鑒別，中藥指紋圖譜技術(shù)已成為中國傳統(tǒng)中藥走向現(xiàn)代化、國際化不可或缺的重要因素[9-10]。化學(xué)計(jì)量學(xué)(Chemometrics)是在化學(xué)測(cè)量過程中所使用的某種特定數(shù)學(xué)方法或統(tǒng)計(jì)學(xué)方法與數(shù)據(jù)交互關(guān)系的科學(xué)，常用的分析方法有主成分分析(Principal component analysis, PCA)、平行因子分析(Parallel factor analysis, PARAFAC)、秩消因子分析(Rank annihilation factor analysis, RAFA)、漸進(jìn)因子分析(Evolving factor analysis, EFA)、偏最小二乘判別分析(Partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)等[11]。相較于單一指標(biāo)含量的測(cè)定，化學(xué)計(jì)量學(xué)可對(duì)量化和整合后的色譜或光譜數(shù)據(jù)做出多元統(tǒng)計(jì)分析，評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量更具代表性[12-13]。以化學(xué)計(jì)量學(xué)為“紐帶”，用中藥指紋圖譜技術(shù)與含量測(cè)定相結(jié)合的方法對(duì)藥物進(jìn)行評(píng)價(jià)可更加全面闡釋其品質(zhì)好壞[14-15]。

滇龍膽(Gentianarigescens)為龍膽科(Gentianaceae)龍膽屬(Gentiana)多年生草本植物，性寒，味苦，歸肝、膽經(jīng)，清熱燥濕，瀉肝膽火[16-17]，其主要有效成分為龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、當(dāng)藥苷等[18]。滇龍膽作為云南地區(qū)的道地藥材，其內(nèi)在品質(zhì)受到關(guān)注，但藥典或有關(guān)論著對(duì)其具體炮制加工方法的描述或記載報(bào)道較少[19]。本研究旨在建立不同初加工滇龍膽樣品的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜，測(cè)定馬錢苷酸、龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和當(dāng)藥苷4種主要有效成分含量，采用主成分分析處理含量測(cè)定結(jié)果，對(duì)滇龍膽的初加工技術(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 藥材

供試樣品采收自云南省云縣，經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所金航研究員鑒定為龍膽科(Gentianaceae)植物滇龍膽草(GentianarigescensFranch.)，憑證標(biāo)本保存在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所標(biāo)本室。樣品經(jīng)不同方式初加工后粉碎過60目篩，置自封袋內(nèi)備用。

1.2 儀器

HPLC-10高效液相色譜儀(日本島津公司，含HPLC-10ATVP泵，7725i手動(dòng)進(jìn)樣器， SPD-M10A VP二級(jí)管陣列檢測(cè)器，190～800 nm)，SY3200-T型超聲波清洗儀(上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司)，萬分之一電子分析天平(美國奧豪斯公司)，F(xiàn)W-100型高速萬能粉碎機(jī)(天津市華鑫儀器廠)，CS101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(浙江余姚溫度儀表四廠)。

1.3 試劑

對(duì)照品馬錢苷酸、龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、當(dāng)藥苷均購自中國食品藥品檢定研究院(批號(hào)分別為111865-201403，110770-201313，10785-201203，1117 42-201101)。實(shí)驗(yàn)使用乙腈、甲醇為色譜純(美國Fisher試劑公司)，甲酸為分析純(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑三廠)，水為自制超純水。

1.4 方法

1.4.1 初加工方法及干燥條件 對(duì)每批樣品采用9種不同初加工方法，見表1。

1.4.2 有效成分含量的測(cè)定 (1) 色譜條件。C18島津液相色譜柱(Shim-pack VP-ODS，150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相A為0.1 %甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫(0～2.5 min，7 %～10 % B；2.5～20 min，10 %～26 % B；20～29 min，26 %～58.3 % B；29～30 min，58.3 %～90 % B)，流速1.00 mL/min，檢測(cè)波長241 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μl，理論板數(shù)按歐前胡素峰計(jì)算不低于3000。

(2) 供試品溶液制備。取樣品粉末50.0 mg于35 mL試管中，加入80 %甲醇溶液2.5 mL，超聲處理30 min，冷卻到室溫，用80 %甲醇溶液補(bǔ)足減失提取試劑，靜置3 min，提取溶液過0.45 μm微孔濾膜得供試品溶液。

(3)對(duì)照品溶液制備。精密稱取馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷對(duì)照品各10.0 mg，用適量甲醇將其溶解，用100 mL容量瓶定容，搖勻，避光4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精密吸取(3)項(xiàng)下的備用對(duì)照溶液4 mL，用甲醇定容到10 mL容量瓶中，連續(xù)等梯度稀釋0.5倍7次，得不同濃度對(duì)照溶液。注入5 μl不同濃度對(duì)照品溶液于高效液相色譜儀，依據(jù)(1)色譜條件測(cè)定其峰面積，分別以對(duì)照溶液為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程，見表2。

表1 9種不同初加工方法

(5)精密度試驗(yàn)。取1份供試品溶液，按(1)項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和當(dāng)藥苷相對(duì)峰面積的RSD分別為0.91 %，0.97 %，1.31 %和0.87 %，結(jié)果顯示方法精密度良好。

(6)重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取同一份樣品6份，按(2)項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按(1)項(xiàng)下色譜條件測(cè)得馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和當(dāng)藥苷相對(duì)峰面積的RSD分別為1.85 %，2.54 %，2.09 %和1.36 %，結(jié)果顯示方法重現(xiàn)性良好。

(7)穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取同一供試品溶液，按上述色譜條件，依次在0，2，6，12，18，24 h 進(jìn)樣，測(cè)得馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和當(dāng)藥苷相對(duì)峰面積的RSD分別為2.63 %，1.34 %，2.86 %和1.49 %，結(jié)果顯示方法穩(wěn)定性良好。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2004A版對(duì)不同初加工滇龍膽HPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度分析。采用IBM SPSS Statistics 20軟件對(duì)4種有效成分含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行主成分分析和方差分析，4種有效成分含量測(cè)定結(jié)果的三維主成分得分圖用SIMCA-P+11.5軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇龍膽環(huán)烯醚萜苷類成分指紋圖譜建立及相似度分析

依照(1)色譜條件對(duì)9種初加工方法處理過的樣品進(jìn)行測(cè)定，將9批樣品HPLC圖譜信號(hào)數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件(2004A 版)，設(shè)定S1為參照?qǐng)D譜，選取“時(shí)間窗寬度”為0.1 min，對(duì)照?qǐng)D譜的生成方法為“平均數(shù)”，選定9個(gè)特征峰(8、9、13、15、17、18、25、40、41)進(jìn)行多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配生成對(duì)照指紋圖譜(圖1B)，確定42個(gè)共有峰。通過與混合對(duì)照品色譜峰進(jìn)行對(duì)照，指認(rèn)共有峰：9號(hào)為馬錢苷酸、15號(hào)為獐牙菜苦苷、17號(hào)為龍膽苦苷、18號(hào)為當(dāng)藥苷。通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》計(jì)算不同初加工方法處理的滇龍膽HPLC指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度(表3)，結(jié)果顯示各樣品圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度大部分高于0.960，其中僅S20、S25相似度相對(duì)較低，分別為0.948、0.955。

表2 馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和當(dāng)藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

A：4種有效成分混合對(duì)照品溶液色譜圖；B：滇龍膽樣品對(duì)照指紋圖譜；C：9種初加工方法處理的滇龍膽指紋圖譜A: HPLC Chromatograms of mixed standards of 4 effective constituents; B: Fingerprint of reference sample of Gentiana rigescens; C: Fingerprints of different samples processed by 9 preliminary processing methods圖1 滇龍膽有效成分指紋圖譜建立Fig.1 The HPLC fingerprints of index components of Gentiana rigescens

2.2 不同初加工方法對(duì)滇龍膽中有效成分含量的影響

按(1)項(xiàng)色譜條件測(cè)定27批樣品中4種有效成分含量。從表4可知，滇龍膽中龍膽苦苷含量在4種有效成分中含量最高，占總含量的49.17 %～70.91 %。通過(4)建立的滇龍膽中4種有效成分標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出不同初加工方法處理的滇龍膽樣品中馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷含量的差異顯著(P<0.05)。經(jīng)微波處理(WBDP)的滇龍膽樣品中馬錢苷酸含量最高，為(8.58±1.48)mg/g；經(jīng)沸水燙皮處理(FSDP)含量最低，為(1.45±0.20)mg/g；經(jīng)水洗處理(SXDP)的滇龍膽樣品中獐牙菜苦苷含量最高，為(5.89±0.23)mg/g；經(jīng)微波處理(WBDP)含量最低，為(1.79±0.78)mg/g；經(jīng)水洗處理(SXDP)的滇龍膽樣品中龍膽苦苷含量最高，為(15.62±0.84)mg/g；經(jīng)烘箱處理(HXDP)含量最低，為(8.91±0.88)mg/g；經(jīng)水洗處理(SXDP)的滇龍膽樣品中當(dāng)藥苷含量最高，為(3.79±0.16)mg/g；未經(jīng)水洗處理(BXDP)含量最低，為(0.72±0.51)mg/g。

表3 不同初加工方法處理的滇龍膽HPLC指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

表4 采用9種初加工方法處理的滇龍膽中4種有效成分含量

2.3 主成分分析

對(duì)9種初加工方式處理的27批(n=3)滇龍膽樣品中馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷含量數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)其進(jìn)行主成分分析。由表5可知，以特征值大于1為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到2個(gè)主成分。主成分1(PC1)的特征值為2.372，其貢獻(xiàn)率最大，占總方差貢獻(xiàn)率59.301 %，包含信息最多，由成分的載荷矩陣(表6)可知，獐牙菜苦苷在主成分1上的載荷值最高，對(duì)主成分1貢獻(xiàn)較大。主成分2(PC2)的特征值為1.101，其貢獻(xiàn)率占總方差貢獻(xiàn)率的27.521 %，馬錢苷酸在這一主成分中載荷值較大。前2個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到86.822 %(≥85 %)，表達(dá)全部信息的86.822 %。通過SPSS軟件處理后得出主成分得分系數(shù)(表7)，第一主成分貢獻(xiàn)最大，而第一主成分中系數(shù)最大的為獐牙菜苦苷，說明獐牙菜苦苷在滇龍膽的質(zhì)量控制中起著重要作用[33]。根據(jù)主成分計(jì)算公式和主成分得分相關(guān)系數(shù)可以得到前2個(gè)主成分與4種有效成分的線性組合為：

F1=-0.003X1+0.409X2+0.31X3+0.398X4

F2=0.875X1-0.168X2+0.329X3-0.078X4

根據(jù)F=0.59301F1+0.27521F2計(jì)算主成分綜合得分及排序(表8)。對(duì)含量測(cè)定結(jié)果做主成分分析，計(jì)算主成分綜合得分可評(píng)價(jià)樣品質(zhì)量[33-34]。滇龍膽經(jīng)沖洗瀝干后于通風(fēng)處晾干的處理方法(SXDP)綜合得分最高，為17.11299；蒸鍋處理后于室內(nèi)通風(fēng)處晾干的處理方法(ZQDP)綜合得分最低，為9.78906。

用SIMAC-P 11.5軟件對(duì)9種初加工的27批滇龍膽樣品繪制主成分分析的三維得分圖(圖2)。依圖可見，帶皮水洗處理(DPSX)、沸水帶皮處理(FSDP)、微波帶皮處理(WBDP)的滇龍膽明顯區(qū)別于其它初加工處理的滇龍膽，這3種加工方式中帶皮水洗(DPSX)滇龍膽的獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和當(dāng)藥苷含量及4種有效成分總含量最高，微波處理(WBDP)滇龍膽中馬錢苷酸含量最高。其它初加工滇龍膽也存在一定差別，但無法明顯區(qū)分。

表5 主成分的特征根及貢獻(xiàn)率

表6 成分載荷矩陣

表7 成分得分系數(shù)矩陣

表8 主成分綜合得分

圖2 27批滇龍膽樣品主成分分析3D得分Fig.2 PCA analysis 3D score of 27 different batch samples

3 討 論

HPLC指紋圖譜是中草藥鑒別及評(píng)價(jià)的有效、簡(jiǎn)便和可靠的方法，從整體上顯示出研究對(duì)象之間的相似性。本實(shí)驗(yàn)建立了不同初加工方法處理的滇龍膽HPLC指紋圖譜，相似度結(jié)果顯示，樣品間整體相似度比較接近，而主成分分析三維得分圖顯示不同初加工滇龍膽樣品存在一定差別。不同初加工滇龍膽中化學(xué)成分種類相似，成分含量和構(gòu)成比例存在差異。

本試驗(yàn)選用的9種初加工方式按加工性質(zhì)可分為兩大類：其中XSGR、SXDP、BXSR、BXDP屬于傳統(tǒng)加工方法，即不借用加工設(shè)備(如蒸鍋、微波爐、炒鍋、烘箱等)，僅用清水進(jìn)行清洗或不清洗后直接對(duì)其進(jìn)行干燥。FSDP、WBDP、ZQDP、GCDP、HXDP屬于輔助加工方法，即借用加工設(shè)備進(jìn)行相關(guān)處理后再對(duì)其進(jìn)行干燥。傳統(tǒng)加工滇龍膽中4種有效成分含量與主成分分析綜合得分均高于輔助加工滇龍膽，表明傳統(tǒng)加工方法更有利于滇龍膽品質(zhì)的保護(hù)。而傳統(tǒng)加工方法的缺點(diǎn)是操作耗時(shí)長、成本高、效率低，故部分藥材加工廠為提高生產(chǎn)效率和利潤而選擇后者。

4種傳統(tǒng)加工方式按是否去皮可分為兩大類：其中BXDP、SXDP為不去皮處理，BXSR、XSGR為去皮處理。不去皮處理的滇龍膽中4種有效成分總含量高于去皮處理，主成分分析結(jié)果不去皮處理的綜合得分排名也高于去皮處理，表明滇龍膽表皮的存在對(duì)滇龍膽質(zhì)量有一定影響。經(jīng)不同初加工處理后馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷含量變化存在差異，滇龍膽最佳初加工方式為帶皮水洗后于室內(nèi)通風(fēng)干燥。

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(責(zé)任編輯 王家銀)

StudyonHPLCFingerprintsofGentianaRigescenswithDifferentPreliminaryProcessingandDeterminationofIndexComponents

ZUO Zhi-tian1,2, WANG Yuan-zhong1,2, ZHANG Ji1,2, ZHAO Yan-li1,2, WANG Jia-jin1,2 *

(1.Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Kunming 650205, China; 2.Yunnan Technical Center for Quality of Chinese Material Medica, Yunnan Kunming 650200, China)

HPLC fingerprints of different preliminary processingGentianarigescenswere established, and 4 index contents as loganic acid, swertimarin, gentiopicroside and swerosidefour were determined. Principal component analysis (PCA) was employed to evaluate nine preliminary processing methods. The results showed relatively high similarity among samples. The contents of swertimarin, gentiopicroside and sweroside were the highest inGentianarigescenssamples which were cleaned by rinsing and indoor seasoning, and reached(5.89±0.23),(15.62±0.84),(3.79±0.16)mg/g, respectively. While the sample which was treated by microwave had the highest content of loganic acid, was(8.58±1.48)mg/g. The total content of the 4 effective components was(27.67±6.09)mg/g. The results of principal component analysis revealed that cumulativerate of contribution of PCA1 and PCA2 reached 86.822 %, and formed linearrelation with four effective constituents:F(PC1)=-0.003X1+0.409X2+0.31X3+0.398X4,F(PC2)=0.875X1-0.168X2+0.329X3-0.078X4; The results showed that the samples with the skin dried indoor after washing got the highest score in PCA. Analysis results revealed cleaning by rinsing and indoor seasoning was more optimizing processing method than others.

Preliminary processing; Traditional Chinese medicine fingerprints; Principal component analysis;Gentianarigescens

1001-4829(2017)3-0535-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.3.009

S567

A

2015-10-08

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260608)；云南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014FD068，2013FZ150，2013FD066)

左智天(1984-)，女，助理研究員，主要從事天然藥物化學(xué)與活性方面研究，E-mail：yaaszztian@126.com，*為通訊作者，E-mail：2354665275@qq.com。