廣西東南沿海生姜莖腐病病原菌鑒定

龍艷艷，劉增亮，汪 茜，龍 游，張金蓮，陳廷速*

(1.廣西農業科學院微生物研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西物寶農業微生物應用聯合實驗室，廣西 南寧 530007)

廣西東南沿海生姜莖腐病病原菌鑒定

龍艷艷1,2，劉增亮1,2，汪 茜1,2，龍 游1,2，張金蓮1,2，陳廷速1,2*

(1.廣西農業科學院微生物研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西物寶農業微生物應用聯合實驗室，廣西 南寧 530007)

莖腐病是生姜種植業最具破壞性的病害之一，具有發病時間短、病程進展快、病株致死率高的特點。本研究從廣西東南沿海生姜種植區采集到生姜莖腐病病株，經過分離純化得到多個腐霉菌株，通過形態學觀察、分子生物學和致病性鑒定，將病原菌鑒定為群結腐霉(Pythiummyriotylum)。該病原菌的鑒定，對控制廣西地區生姜莖腐病的發生和擴散具有重要的理論指導意義。

生姜；莖腐病；群結腐霉；致病性

生姜(ZingiberofficinaleRosc.)是一種高效高產的經濟作物，在我國大部分地區均有種植，廣西是主要產區之一。隨著生姜種植面積的不斷擴大和規模化生產的發展，生姜病害也日益嚴重，逐漸成為制約生姜產業健康發展的關鍵因素之一，病害的控制及防治也成為不可忽視的問題。生姜莖腐病又稱為生姜軟腐病、生姜腐霉軟腐病、生姜根腐病等，俗稱生姜爛脖子病、生姜黑腳病，是生姜生產中破壞力極強的一種卵菌病害，已成為姜瘟病之后又一個急需解決的災變病害，在國內外植保領域引起廣泛關注。通常情況下，由該病引起的生姜減產在5 %～30 %之間，病害嚴重甚至會導致絕收[1-2]。生姜莖基腐病在我國的首次報道出現在臺灣地區[3]，隨后，廣東及山東的生姜種植區也相繼報道了該病的普遍發生[4-5]。生姜莖基腐病在這些種植區發病時間短，傳播迅速，為害嚴重，且呈逐年加重的趨勢，部分地塊絕產絕收。因此，明確該病病原及發生規律，對控制廣西地區生姜莖腐病的發生和擴散具有重要意義。

關于引起生姜莖基腐病的病原菌，世界各地的報道不盡相同。由于地理環境和氣候條件的差異，不同國家及地區間的優勢致病菌種類會出現較大差異。多數國家以腐霉為主，包含的種類有瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、德里腐霉(P.deliense)、禾生腐霉(P.graminicola)、群結腐霉(P.myriotylum)、滿器腐霉(P.pleroticum)、刺腐霉(P.spinosum)、華麗腐霉(P.splendens)、終極腐霉(P.ultimum)、鐘器腐霉(P.vexans)和姜腐霉(P.zingiberis)等[6-8]。也有些研究者認為該病是由腐霉和鐮刀菌復合侵染引起[8]，還有少數學者認為該病是由鐮刀菌單獨侵染引起[9]。在我國，生姜莖腐病的病原菌研究相對滯后，臺灣地區和山東生姜產區報道了該病是由群結腐霉引起[3,5]。而廣州生姜產區的生姜根莖腐爛是由青枯細菌和腐霉單獨或共同侵染引起，主要致病腐霉為瓜果腐霉、群結腐霉、禾生腐霉和簡囊腐霉(P.monospermum)[4]。而廣西尚未發現有生姜莖腐病的報道。本研究對廣西省東南沿海地區生姜種植地塊進行調查，首次發現并采集出現典型癥狀的生姜莖基腐病的病株，對其進行病原菌分離、鑒定及致病性測定，明確了引起該病的病原菌種類。

1 材料與方法

1.1 病害癥狀描述及樣品采集

2016年8月，前往廣西北海、合浦、防城和欽州調查生姜莖腐病發病情況，描述病害癥狀，并采集病株。

1.2 病原菌的分離和純化

將采集到的生姜莖腐病病株的根莖用自來水輕輕沖洗數遍后，剪成2 cm左右的根段，用75 %酒精表面消毒5 min，無菌水沖洗3遍，再用95 %次氯酸鈉消毒2 min，無菌水再沖洗3遍，最后用消毒的解剖刀切掉兩端后，取0.2 cm內部小段病組織，移到玉米粉瓊脂培養基(Cornmeal agar, CMA)平板上，于25 ℃下培養。菌絲長出后隨即切取菌絲尖端轉入新的CMA平板中進行純化培養。

1.3 病原菌致病性測定

根據柯赫法則，選取6個致病腐霉，采用盆栽接種測定方法測定它們的致病性。用PDA培養基活化病原菌，待菌落長滿整個培養皿后，用打孔器制成小菌餅，接種到經過針扎處理的健康生姜苗的莖基部傷口附近，隨后覆蓋上無菌沙土。以未接病原菌的健康生姜苗為對照，每個處理設置3個重復，每天早上澆水保濕。觀察和記錄發病情況，且進行病原菌再分離，鑒定是否與原接種菌株相同。

1.4 菌株鑒定

形態鑒定：在CMA平板上觀察菌株培養形態。觀測孢子囊、藏卵器和卵孢子的大小、形狀等指標。主要根據van der Plaats-Niterink(1981)的腐霉專著進行形態鑒定[10]。

分子鑒定：將純化好的病原菌移植到PDA平板培養基上，在25 ℃的培養箱中培養4～7 d，待長滿濃密的氣生菌絲后，置于5 ℃冰箱中備用。配制PCR擴增體系，將適量菌絲直接加入體系中進行PCR擴增。25 μl PCR體系成分如下: 2×EasyTaqPCR SuperMix(北京全式金生物技術有限公司) 12.5 μl、引物ITS5和ITS4各1 μl、ddH2O 10.5 μl、病原菌菌絲適量。熱循環反應程序設置如下：95 ℃下初始變性3 min，接下來為94 ℃下變性40 s，54 ℃下引物退火50 s，72 ℃下延伸60 s，35個循環結束后，在72 ℃下延伸10 min。反應結束以后，再次以1 μl第一次PCR的產物為模板，用相同的PCR體系及熱循環反應程序進行第2次PCR。擴增中利用水代替DNA模板為空白對照。用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR反應結果，吸取4 μl PCR產物加入0.8 %(W/V)瓊脂糖凝膠，凝膠置于1 × TAE緩沖液(0.4 M Tris, 50 mM NaOAc, 10 mM EDTA, pH 7.8)中，在75 V下電泳40 min，最后在紫外燈下拍照檢測。檢測出明顯亮條帶的樣品送到北京諾賽基因組研究中心有限公司用相同的引物在ABI 3730-XL DNA測序儀進行雙向測序。拿到測序結果后，在 NCBI(National Center for Biotechnology Information)中進行 Blast 同源性搜索，初步確定病原菌的分類地位。使用Clustal-X(1.83)軟件對所測得的生姜莖腐病病原菌及其近緣種的ITS基因序列(表1)進行多重序列比對分析，所有的位點都作無序、不加權處理，堿基缺失被看做數據缺失。比對好的文件將其保存為Neux文件格式以備后續分析使用。系統發育樹的構建是通過 PAUP*4.0b10 軟件完成的，采用最大簡約法(Maximum parsimony, MP)，在分析過程中采用啟發式搜索算法，應用二分樹重聯法(tree-bisection-reconnection, TBR)來進行分枝交換，每次搜索重復1000次隨機序列添加，并保留每次重復得到的所有的樹，樹的內部分枝的強度用相同的設定進行1000次自展檢驗。

2 結果與分析

2.1 癥狀表現

成株期染病，先在姜苗莖基部形成黃褐色水漬狀病斑，接著下部葉片先從葉尖、葉緣處黃化并向葉背卷曲，之后逐漸往上部葉片擴展直至嫩芽，最后因莖基部縊縮倒伏導致全株黃化枯死(圖1，A)。

2.2 病原菌的分離和致病性測定

從病株上分離純化到一批菌落形態一致的腐霉菌株，挑選了6個代表菌株進行致病性測定。盆栽結果顯示，6個菌株均能使帶有傷口的姜苗發病(圖1，C)，而對照組的姜苗正常生長(圖1，B)。該病發病過程短，發病進程快，接種后第2天陸續開始出現田間典型病害癥狀，8 d以后陸續出現全株枯死，半個月后基本全部枯死。通過對發病植株體內病原菌的重新分離與形態鑒定，發現重新分離得到的病原菌與原接種病原菌為相同的物種，表明該批菌株為生姜莖腐病的致病菌。

表1 構建系統發育樹的腐霉物種名單

A.田間發病癥狀；B.致病性測定——對照；C.致病性測定——回接發病癥狀A.Symptoms in field; B.CK in pathogenicity tests; C.Symptoms in pathogenicity tests圖1 病害癥狀Fig.1 Symptoms of soft rot

2.3 病原菌的鑒定

形態描述：菌落在PDA培養基上白色，放射狀，氣生菌絲密集。菌落在CMA培養基上半透明狀，呈樹枝狀向外延伸，未長滿平皿時菌落邊緣不整齊，菌絲基內生。附著孢瘤狀突起，常成簇著生。孢子囊為膨大或不膨大的絲狀結構，膨大部分指狀或香腸狀。球形菌絲膨大體常見。藏卵器球形或近球形，偶爾囊袋形，直徑23.1～38.2(av. 29.9)μm，頂生或間生，偶爾2個串生。雄器大多數異絲生，雄器柄分枝或不分枝，常或多或少松散包裹著藏卵器；雄器細胞曲頸狀或棍棒狀，通過頂端與藏卵器接觸。卵孢子球形，偶爾橢圓形，直徑17.0～29.7(av. 24.6)μm，不滿器，偶爾滿器，每個藏卵器有1個卵孢子(圖2)。

該菌株的形態特征與van der Plaats-Niterink(1981)描述的群結腐霉基本一致，只是本研究中分離到的菌株出現的球形菌絲膨大體未見van der Plaats-Niterink(1981)進行描述[10]。

在NCBI中用BLAST 搜索相似序列結果顯示，與菌株的ITS序列(已經提交GenBank，收錄號LT634147)相似度最高的物種為群結腐霉。根據Lévesque和de Cock(2004)對腐霉屬進化枝的劃分標準，本研究中分離到的腐霉菌株被歸入進化枝B(clade B)[13]。因此，從GenBank 中下載歸屬于腐霉進化枝B的目前已知物種的代表菌株的ITS 序列用于系統發育分析，以瓜果腐霉P.aphanidermatum(屬于進化枝A)為外群。

在分子系統演化分析中共包括41條序列，序列比對數據集由842個堿基位點組成，其中591(70.2 %)個為保守位點，190(22.6 %)個為信息位點。簡約法分析得到12個等價的最大簡約樹(tree length =613, CI=0.5889, RI=0.8143, RC=0.4795, HI=0.4111)。在分子系統發育樹上，本研究中分離到的生姜莖腐病病原菌和群結腐霉P.myriotylum的模式菌株CBS695.79聚在同一個分枝中(圖3)。

A.附著孢；B～C.孢子囊；D.球形菌絲膨大體；E～H.藏卵器、雄器和卵孢子。標尺= 10 μmA.appressoria; B-C.sporangia; D.globose hyphal swellings; E-H.oogonia, antheridia and oospores.Bars = 10 μm圖2 群結腐霉形態Fig.2 Morphology of P. myriotylum

每個分枝節點上的數字代表1000次重復自展檢驗的支持率(50 %以下未顯示)。標尺代表每位點有10個期望變異The numbers at each branch point represented percentage bootstrap support calculated from 1,000 replicates (less than 50 % were not shown). Bar indicates 10 expected changes per site圖3 基于ITS的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences

因此，從形態和分子方面都證明該病原菌為群結腐霉。

3 討 論

研究結果表明，生姜莖腐病對生姜的為害很嚴重，具有發病時間短、病程進展快、病株致死率高的特點。生姜莖腐病和姜瘟病是生姜種植過程中的兩大災變病害，都會給生姜生產帶來毀滅性打擊。兩種病害發病癥狀相似，易于混淆。但是前者的病原物屬于卵菌，后者的病原物屬于細菌。所以在濕度較大的環境下，生姜莖腐病病株莖基部出現白色霉層，植株容易倒伏，不會發臭；而姜瘟病的病株基部或根莖部的維管束變褐色，用手擠壓，可見污白色菌膿從維管束溢出，還會散發臭味。姜子德等報道了生姜根莖腐爛由腐霉和細菌共同侵染引起，在人工接種情況下，青枯細菌表現典型的“青枯型”癥狀，腐霉則呈典型的“黃腐型”癥狀，兩類病原菌混合表現為“黃枯型”癥狀[4]。從作者的癥狀描述可以判斷由青枯細菌引起的姜根莖腐爛屬于姜瘟病，而腐霉類引起的屬于生姜莖腐病。兩大病害可以同時發生在一個植株上，使得發病更加嚴重。因此，今后開展相關病害的研究時，應該綜合考慮這兩類病原菌的為害。

在廣西東南沿海地區引起該病的病原菌為管毛生物界(Stramenopila，藻物界為其同物異名)腐霉屬的群結腐霉。群結腐霉于1930年在美國的番茄上首次被發現并被作為新物種發表[10]。該物種主要出現在溫度較高的地區，但有時在溫帶地區的溫室作物上也能分離到。它的寄主范圍很廣，世界各地廣泛分布，在高溫條件下可以引起包括生姜在內的多種植物的組織腐爛病[9]。

姜腐霉與群結腐霉是兩個親緣關系很近的物種，卵菌的DNA條形碼ITS和COI兩個分子片段都無法區分開[11, 14]，本研究中分離到的菌株的ITS序列與姜腐霉的代表菌株(CBS 216.82)之間的相似度高達99.6 %，但是在形態上與姜腐霉的原始描述有差異[15]，表現在本文中菌株雄器以頂端小面積接觸藏卵器為主，而姜腐霉的雄器常以側面大面積接觸并纏繞藏卵器為主，此外，本文中菌株的卵孢子以不滿器為主，而姜腐霉的卵孢子以滿器為主。因此，從形態上來看，本文分離到的菌株不能鑒定為姜腐霉。至于群結腐霉和姜腐霉形態上的差異是屬于種內變異還是種間變異，需要分類學家們的進一步研究。

根據現有文獻報道，生姜莖腐病的病原可以歸結為兩大類：腐霉類和鐮刀菌類(真菌類)，它們單獨侵染或復合侵染。由于生態條件和耕作習慣的差異，不同區域的致病菌種類會出現較大差異。國內報道的生姜莖腐病的致病菌以群結腐霉單獨侵染為主[3-5]，只有廣東地區報道了姜根莖腐爛腐是由腐霉類和細菌類共同侵染，其中腐霉類的除了群結腐霉外，還出現了瓜果腐霉、禾生腐霉和簡囊腐霉[4]。本研究只針對廣西東南沿海地區的小范圍樣地進行初步調查，得到的結論與廣東的報道有較大差異。廣西比鄰廣東，地理環境和氣候條件極為相似，引起生姜莖腐病的病原菌種類是否存在相同規律值得進一步研究。

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(責任編輯 王冠玉)

IdentificationofPathogenofStemRotDiseaseonGinger(Zingiberofficinale)inSoutheasternGuangxi

LONG Yan-yan1,2, LIU Zeng-liang1,2, WANG Qian1,2, LONG You1,2, ZHANG Jin-lian1,2, CHEN Ting-su1,2*

(1.Microbiology Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007, China; 2.Microbial Lab of Guangxi Wubao Agricultural Technology, Guangxi Nanning 530007, China)

Stem rot of ginger is one of the most destructive disease in ginger planting industry, with a short incubation period, rapid disease progress and a high lethality rate. Ginger rhizomes suffered with stem rot disease were sampled from ginger planting areas in Southeastern Guangxi. SeveralPythiumstrains were isolated and identified to bePythiummyriotylum. the pathogen of ginger, by morphological observation, molecular characteristics and pathogenicity test. So the identification of the pathogen of stem rot disease on ginger is of great importance to study the theory of disease control in Guangxi.

Ginger; Soft rot;Pythiummyriotylum; Pathogenicity

1001-4829(2017)3-0584-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.3.018

S435.661

A

2016-11-07

廣西科技計劃項目(桂科AD16380054)

龍艷艷(1984-)，女，博士研究生，主要從事土壤微生物資源的利用與開發研究，E-mail：longyanyan2014@foxmail.com,*為通訊作者，E-mail：chen20409@hotmail.com。