野生柑橘炭疽病鑒定

尹良芬，都勝芳，蔡明歷，羅朝喜

(1.華中農業大學植物科技學院，湖北 武漢 430070；2. 華中農業大學作物學實驗教學中心, 湖北 武漢 430070；3. 園藝植物生物學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070)

野生柑橘炭疽病鑒定

尹良芬1,2，都勝芳1,3，蔡明歷1,2，羅朝喜1,3

(1.華中農業大學植物科技學院，湖北 武漢 430070；2. 華中農業大學作物學實驗教學中心, 湖北 武漢 430070；3. 園藝植物生物學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070)

本研究對華中農業大學野生柑橘上的病害進行鑒定。運用形態學及ITS序列分析方法對病樣進行系統鑒定。結果表明，從發病的野生柑橘枝稍病樣上共分離到24個單孢菌株，這些菌株根據形態學及ITS序列分析方法分為3種真菌：①菌落粉紅色，長勢非常緩慢，孢子鐮刀形，ITS序列分析鑒定為磚紅鐮孢菌Fusariumlateritium；②菌落灰黑色，氣生菌絲多，孢子磚格狀，ITS序列分析為鏈格孢菌Alternariaalternata；③菌落灰白色，氣生菌絲較少，常產生橙色膠滴和黑色小粒點，分子孢子短桿狀，ITS序列分析為膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。利用健康柑橘枝條對此3種真菌進行回接實驗時，接種膠孢炭疽菌的枝條出現了跟采樣枝條相同的癥狀，而且從發病的枝條上又分離到同樣的炭疽菌；而接種鏈格孢及磚紅鐮孢的枝條不發病。該病害鑒定為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides感染引起的炭疽病。

野生柑橘病害；炭疽病；膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)

柑橘是世界第一大果樹品種,在全球百果中的種植面積和產量均居首位[1]。中國是柑橘生產大國，目前柑橘種植面積、產量均位居世界第一，是我國南方農業經濟的一大支柱產業。柑橘炭疽病是世界性分布的病害，在各柑橘產區都有分布。炭疽病主要為害新梢、葉片、花器、幼果、果梗、枝條及引起儲藏期蒂腐爛果[2]，條件適宜時，可造成田間90 %以上的損失甚至絕收[3]。前人研究結果表明，柑橘炭疽病病原菌為刺盤孢屬(炭疽菌屬)(Colletotrichum)的3個種，即膠孢刺盤孢(C.gloeosporioides)，尖孢刺盤孢 (C.acutatum)和平頭炭疽菌(C.truncatum)[2-7]。其中，膠孢刺盤孢(C.gloeosporioides)是我國的優勢種群，全國大部分柑橘產區都有分布[2,6-7]，尖孢刺盤孢 (C.acutatum)僅在云南、廣東的少部分地區有分布，而平頭炭疽菌(C.truncatum)目前只在云南的瑞麗有發現[2]。2014年12月在華中農業大學柑橘資源圃上的野生柑橘枝梢上發生一種危害較為嚴重的病害，需要對其進行鑒定，確定其病原物，為制定高效、安全的防治措施提供依據。通過對該病的癥狀進行觀察、描述，對其病原物進行分離、培養，然后利用形態學及ITS序列分析方法進行鑒定。

圖1 枝梢病樣Fig.1 Diseased shoot sample

1 材料與方法

1.1 樣本采集及癥狀觀察

病害樣本于2014年12月采集自華中農業大學校園柑橘園。枝條病樣表現為除下部尚有部分保持綠色外，其余部分呈褐色干枯狀(圖1)。

1.2 菌株分離純化

切取枝條病樣病健交界處組織，自來水沖洗后，用75 %消毒酒精浸泡1 min，重復1次；再用5 %次氯酸鈉消毒液浸泡1 min，重復1次; 之后用滅菌水沖洗3次。處理后的病樣組織于超凈工作臺吹干水分后，置于加有青霉素和鏈霉素的PDA平板(Φ = 90 mm)上，26 ℃培養箱中黑暗培養。

菌株單孢分離則按照Luo等介紹的方法[8]。簡而言之：把PDA表面產生的孢子涂抹在新的PDA培養基表面，然后在改造過的COIC XSZ-4G顯微鏡下利用玻璃針挑取單個孢子放置到新的PDA表面，之后置于培養箱中26 ℃黑暗培養。單個孢子萌發后形成的菌絲移植到PDA斜面培養4到5 d后于4 ℃冰箱中保存備用。

按照上述方法本研究從枝條病樣上共分離到24個單孢菌株，編號分別為枝1-1，枝1-2，枝2-1，枝2-2等等。

1.3 菌株的活化

將保存的菌株從冰箱中取出轉接于PDA平板上，26 ℃黑暗培養4 d后用接種針挑取邊緣的新鮮菌絲轉接到新鮮的PDA平板上進行實驗。

1.4 菌落形態觀察

用打孔器(Φ = 6 mm)從新鮮的菌落邊緣打取菌絲塊轉接于PDA平板的中央，然后放置于培養箱中26 ℃黑暗培養。每個菌株移植3皿，重復1次。之后每天觀察并對菌落的直徑進行十字交叉測量直到菌絲長滿為止。菌落生長速率為每個菌株所移植的2次重復(每次3皿)的平均生長速率，用mm/d表示。

1.5 致病性測定

致病性測定：待接種用的柑橘健康枝條用自來水沖洗后，75 %酒精表面消毒3次，用無菌水沖洗3遍后置于超凈工作臺中吹干水分。本研究采用2種方法進行接種。①用分生孢子液進行接種：用滅菌毛筆及滅菌水刮洗培養4 d的菌落表面，之后用2層紗布進行過濾，將配制的孢子液(106個/mL)接種到表面劃傷過的柑橘枝條上。對照實驗則劃傷后接種滅菌水。②用菌絲塊進行接種：用滅菌打孔器(Φ = 6 mm)從培養4 d的菌落(PDA平板)邊緣打取新鮮菌絲塊置于表面劃傷過的柑橘枝條上(菌絲面朝下)。對照實驗則接種沒有菌絲的PDA瓊脂塊(枝條同樣進行表面劃傷)。接種后的枝條置于塑料盒中，盒子的底部放入潤濕的吸水紙以保證近100 %的培養濕度，并蓋上保鮮膜。之后把盒子置于26 ℃的人工氣候箱中，12 h光照/12 h黑暗交替培養。培養2 d后去掉保鮮膜，改為2層紗布覆蓋。

1.6 分生孢子形態學觀測

直接挑取PDA表面或者接種病斑表面的分生孢子制作玻片，在光學顯微鏡(Motic BA200，麥克奧迪公司，武漢)下觀察孢子形態及大小。

1.7 基因組DNA的提取

在PDA培養基表面鋪1片玻璃紙，接種菌株后置于26 ℃培養箱中黑暗培養數天后收集菌絲。基因組DNA的提取采用植物基因組DNA提取試劑盒進行。具體步驟參見試劑盒使用說明書(Easypure Plant Genomic DNA Extraction Kit ; TransGen Biotech, Beijing, China)，最后將提取的基因組DNA溶于100 μl ddH2O中，-20 ℃保存備用。

1.8 代表性菌株ITS序列分析

為了分析菌株間ITS序列的差異，以基因組DNA為模板，使用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增反應，特異性擴增出各個菌株的ITS1-5.8S-ITS2區域。實驗反應體系為50 μl，成分如下：1× PCR Buffer，200 mM dNTP，Primer ITS1 (0.16 μM)，Primer ITS4 (0.16 μM)，TaqDNA polymerase (1 U)，Genomic DNA (20ng)，ddH2O。

之后把上述混合物放入PCR儀中進行擴增反應。

擴增條件：94 ℃ 3 min；30循環，每個循環：94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min；72 ℃ 延伸10 min，之后4 ℃保存。

反應結束后，PCR產物用1 %的瓊脂糖膠(AGAROSE G-10, GENE COMPANY, Hong Kong)在0.5倍的TBE緩沖液中電泳1 h(100 v)。經EB染色后，在凝膠成像系統中(Alpha Innotech, Santa Clara, CA，USA)檢測目標條帶。PCR擴增的ITS片段直接送華大基因進行測序(BGI; 深圳，中國) 。

2 結果與分析

2.1 菌落形態、生長速率及分生孢子等形態學觀察

枝梢病樣分離菌株根據其菌落及分生孢子形態特征分為3種真菌: ①菌落淡粉紅色，氣生菌絲白色濃密，生長緩慢 (7.4 mm/d)，常產生粉紅色色素；分生孢子鐮刀形。代表性菌株為枝1-2 (圖2A)。② 菌落灰褐色，氣生菌絲濃密，生長較快(10.1 mm/d)；分生孢子磚格狀。代表性菌株為枝2-2 (圖2B)。③菌落灰白色，常產生橙色露珠狀液滴使之呈紅色，氣生菌絲灰白色，稀疏，生長最快 (13.5 mm/d)；分生孢子短桿狀。代表性菌株為枝11-2 (圖2C)。

2.2 病原菌的分子生物學鑒定

枝梢病樣上分離到的真菌，每種挑取2～4個單孢菌株，提取其DNA進行ITS序列分析。 BLAST比對的結果表明，枝1-2等菌株的ITS序列跟來自云南的磚紅鐮刀菌(Fusariumlateritium)(登記號FJ459977)完全一致；枝2-2等菌株則跟鏈格孢菌(Alternariaalternata)ITS序列(登記號KM268870，KR864893，KR094462等)100 %一致；枝11-2及枝15-2等菌株ITS序列跟炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides) (登記號LC052319，KF177688，GU066652等)完全相同。這些分子鑒定結果與觀察到的生物學特性相吻合。

A.枝1-2；B.枝2-2；C.枝11-2A.stem 1-2; B.stem 2-2; C.stem 11-2圖2 枝梢病樣分離菌株的菌落及分生孢子形態 Fig.2 Colony and conidia morphology of isolates from shoot samples

A.枝11-2；B.枝1-2；C.枝2-2；CK:無菌水A.stem 11-2; B.stem 1-2; C.stem 2-2; CK, sterile water圖3 枝梢病樣分離菌分生孢子液接種實驗Fig.3 Pathogenicity test using conidia suspension

A.枝11-2；B.枝1-2；C.枝2-2；CK:PDAA.stem 11-2; B.stem 1-2; C.stem 2-2; CK, PDA plug圖4 枝梢病樣分離菌菌絲塊接種實驗Fig.4 Pathogenicity test using mycelial plugs

2.3 致病性測定

從枝梢病樣上共分離到3種真菌，利用分離菌株分生孢子液進行致病性接種，結果表明，接種炭疽菌枝11-2的枝條出現田間病樣類似的癥狀(圖3A)，并且從發病的接種枝條上又分離到同樣的炭疽菌。而接種磚紅鐮刀菌(枝1-2)(圖3B)及鏈格孢菌(枝2-2)(圖3C)則不發病。利用這些菌株的菌絲塊進行接種也得到同樣的結果(圖4A，B，C)。這些結果表明，本研究所采集的柑橘病樣為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides感染引起的柑橘炭疽病。

3 討 論

本研究從采集到的柑橘枝梢病樣上共分離到3種真菌，分別為：磚紅鐮刀菌(F.lateritium)， 鏈格孢菌(A.alternata)及炭疽菌(C.gloeosporioides)。鐮刀菌Fusarium是一類世界性分布的病原真菌，屬于半知菌類, 能侵染多種植物的根、莖、葉及果實而引發腐爛病。而鏈格孢菌Alternaria是一種常見的半知菌類真菌，包括500多個種，大多數種類兼性寄生于植物上，引起包括黑斑病在內的多種植物病害[9]。張國珍，尹良芬曾報道鏈格孢菌Alternariapanax引起人參黑斑病[10]。本研究致病性回接實驗發現野生柑橘枝條病樣上出現的干枯癥狀及黑色斑點并非鐮刀菌及鏈格孢菌引起的枝干腐爛及黑斑病。

炭疽菌屬Colletotrichum真菌也屬于半知菌類，常常寄生或者腐生，是一類重要的植物病原真菌，引發多種植物炭疽病。本研究經過致病性回接實驗證明，華中農業大學校園野生柑橘枝梢病害是膠孢刺盤孢感染(C.gloeosporioides)引起的炭疽病，而分離到的另外兩種真菌鏈格孢菌及鐮刀菌只是柑橘感染炭疽病后腐生上去的雜菌。

柑橘炭疽病是柑橘生產上最為常見的病害，它具有危害時間長和危害范圍廣的特點，國內大部分柑橘產區都有發生。炭疽菌屬(Colletotrichum)的3個種，即膠孢刺盤孢(C.gloeosporioides)，尖孢刺盤孢 (C.acutatum)和平頭炭疽菌(C.truncatum)都能侵染柑橘導致發病[3-8]。其中，膠孢刺盤孢(C.gloeosporioides)是我國的優勢種群，全國大部分柑橘產區均有分布[3,7-8]，尖孢刺盤孢 (C.acutatum)僅在云南、廣東的少部分地區有分布，而平頭炭疽菌(C.truncatum)目前只在云南的瑞麗有發現[3]。本研究所鑒定的炭疽菌屬于我國的優勢種群膠孢刺盤孢(C.gloeosporioides)。

本研究所報道的柑橘炭疽病在癥狀上與前人的研究存在差異，如陳國慶等人報道的柑橘枝梢炭疽病癥狀為枝梢枯死呈深褐色或黑色，潮濕時表面產生橘紅色粘質物[2]，而本研究的枝枯表現為灰白色干枯，帶有黑色斑點，樣本保濕培養3 d后表面也不產生橘紅色粘質物。造成這種癥狀不一致的原因大概有如下幾種：第一，品種不一樣。前人研究針對栽培柑橘，大多是在柑橘掛果季節炭疽病大爆發時采的病樣，其癥狀主要表現在果實、葉片或者嫩梢上，而本研究的對象是野生柑橘，沒有掛果，而且葉片上也不表現癥狀。2007-2009年，云南馬關塘坊鎮的柑橘發生大面積落葉落果及引起儲藏期果實腐爛，張玉潔等人經過鑒定發現該病是由膠孢刺盤孢(C.gloeosporioides)引起的柑橘炭疽病[7]。其次，研究的季節不一樣。其他報道的研究對象是春夏季節感病不久的病樣，此時病害還比較單一，因其它雜菌造成的復合侵染還比較少；而本研究的對象是冬天的枝梢，由于炭疽病感染造成樹勢減弱，其它雜菌如鏈格孢、鐮刀菌等滋生造成復雜的復合侵染癥狀。第三，膠孢刺盤孢(C.gloeosporioides)是我國的優勢種群，全國大部分的柑橘產區都有分布。但此種群其實并非一個單一種群，劉開啟等人的研究表明膠孢刺盤孢具有復合種(Complex species)和種群集合(Species group)的特點，其種內遺傳分化多樣[11]；陳希芹等人的研究也發現，膠孢炭疽菌在形態特征、致病性、分子遺傳水平、營養體親和群等方面都存在較大的變異[12]；而最新的研究表明，我國的膠孢炭疽菌其實是由C.gloeosporioides及C.fructicola組成的復合種群[13]。隨著分類方法的進步，也許還能細分為更多的種群。膠孢炭疽菌的復合種群在不同地區，不同寄主上其種群結構是有差異的，因而侵染后所造成的癥狀也不一致。

4 結 論

本研究針對華中農業大學校園資源品的野生柑橘病害進行鑒定，結果為膠孢炭疽病感染引起的柑橘炭疽病。該研究結果對保護我國野生柑橘資源具有重要意義。同時，該研究對柑橘炭疽病菌種類有了進一步的認識，使防治對象明確化從而能夠積極有效地開展防治工作。

[1]何 勁，祁春節. 中外柑橘產業發展模式比較與借鑒[J]. 浙江柑橘, 2009，26(4): 2-9.

[2]陳國慶. 中國炭疽病病原種類及種群遺傳多樣性研究[D]. 杭州：浙江大學農業與生物技術學院，2010.

[3]段志坤. 柑橘炭疽病及其防治對策[J]. 果農之友，2009(6)：29-30.

[4]孫 思，王 軍，王勝坤，等. 柑橘炭疽病病原菌分子鑒定的研究進展[J]. 仲愷農業工程學報，2012, 25(1):62-66.

[5]楊友聯，劉永翔，劉作易. 炭疽菌屬真菌分類學研究進展[J]. 貴州農業科學，2011，39(1)： 152-157.

[6]王 震，楊 媚，楊迎青，等. 廣東省柑橘炭疽病病原菌的形態與分子鑒定[J].菌物學報，2010，29(4)：488-493.

[7]張玉潔，張志信，李紅超. 柑橘炭疽病的病原鑒定和綜合防治措施[J]. 北方園藝，2011(2)：156-159.

[8]Luo C X, Hanamura H, Sezaki H, et al. Relationship between avirulence genes of the same family in rice blast fungus Magnaporthe grisea[J]. Journal of General Plant Pathology, 2002, 68: 300-306.

[9]王洪凱，張天宇，張 猛. 鏈格孢屬真菌分類研究進展[J]. 山東農業大學學報，2001, 32(3)：406-410.

[10]張國珍，尹良芬. 人參黑斑病產孢條件的試驗研究[J]. 山東農業大學學報，1999, 30：105-108.

[11]劉開啟，郭 濼. 果樹膠孢炭疽菌的RAPD分析[J]. 仲愷農業技術學院學報，2002,15(4)：1-7.

[12]陳希芹. 膠孢炭疽菌的遺傳多樣性[D]. 成都：四川農業大學，2004.

[13]Huang F, Chen G Q, Hou X, et al. Colletotrichum species associated with cultivated citrus in China[J]. Fungal Diversity, 2013, 61(1): 61-74.

(責任編輯 李 潔)

IdentificationofAnthracnoseonWildCitrus

YIN Liang-fen1,2, DU Sheng-fang1,3, CAI Ming-li1,2, LUO Chao-xi1,3

(1．College of Plant Science and Technology，Huazhong Agricultural University, Hubei Wuhan 430070, China； 2．Experimental and Teaching Center of Crop Science，Hubei Wuhan 430070, China；3. Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education, Hubei Wuhan 430070，China)

This study was carried out to identify the disease on wild citrus in the campus of Huazhong Agricultural University. The samples were collected and pathogens were identified based on the morphology and ITS sequence analysis. In total, 24 single spore isolates were obtained from the diseased shoot samples, and they showed three kinds of morphology and identified as different fungi by ITS analysis. (i)The colony appeared pink and grew slowly, produced falculate conidia, ITS sequence analysis identified it asFusariumlateritium; (ii)The colony appeared grey to black with much aerial mycelia, produced muriform conidia, ITS sequence analysis confirmed it asAlternariaalternata; (iii)The colony appeared grey, less aerial mycelia, often produced orange sticky droplets and small black spots, ITS analysis revealed it asColletotrichumgloeosporioides. Pathogenicity was confirmed by inoculating these three kinds of fungi on healthy citrus stems, as a result, same symptoms as that of original diseased stem samples appeared by inoculatingC.gloeosporioidesbut notF.lateritiumandA.alternata, andC.gloeosporioideswas re-isolated from the inoculated shoot. Therefore, morphology and ITS sequence analysis indicated that the stem disease was citrus anthracnose caused byC.gloeosporioides.

Wild citrus disease；Citrus anthracnose；Colletotrichumgloeosporioides

1001-4829(2017)3-0590-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.3.019

S666

A

2016-04-30

華中農業大學教改項目(201602)

尹良芬(1974-)，女，云南羅平人，博士，主要從事核果類果樹褐腐病研究及作物病害鑒定工作，E-mail: yh@mail.hzau.edu.cn。