HZ-31多孢木霉菌劑的初步研制及其對闊葉雜草的毒力作用

朱海霞，馬永強，郭青云

(青海省農林科學院/農業部西寧作物有害生物科學觀測實驗站/青海省農業有害生物綜合治理重點實驗室，青海 西寧 810016)

HZ-31多孢木霉菌劑的初步研制及其對闊葉雜草的毒力作用

朱海霞，馬永強，郭青云*

(青海省農林科學院/農業部西寧作物有害生物科學觀測實驗站/青海省農業有害生物綜合治理重點實驗室，青海 西寧 810016)

本研究選用具有高效除草活性的生防菌株多孢木霉(Trichodermapolysporum)HZ-31作為研究對象，進行菌劑的初步研制及其對闊葉雜草的毒力作用測定。通過載體和助劑的篩選，初步研制可濕性粉劑，并對其抗紫外作用、貨架壽命以及對藜、豬秧秧的防效進行測定。結果表明，HZ-31最適載體為高嶺土、幾丁質和聚乙烯醇，這3種載體對HZ-31均有較好的抗紫外保護作用，載體對延長HZ-31的儲存期效果較好，可明顯增加在常溫20 ℃條件下的貨架壽命，低溫保存效果更顯著。菌株HZ-31可濕性粉劑對豬秧秧和藜2種闊葉雜草的盆栽除草效果顯著高于單純的發酵液。通過高效菌株HZ-31菌劑的研制，有望協調運用其他環境友好型防治技術，構建田間雜草生物防治技術體系。

多孢木霉HZ-31；菌劑研制；除草效果

當今，農田雜草控制還是以化學除草劑為主體。隨著農業現代化水平的提高，全球范圍內的除草劑使用量將繼續增加，大量施用化學除草劑帶來了環境污染危機。長殘效除草劑的應用引起了殘毒藥害，導致下茬作物減產甚至土地退化，全世界已有100余種化學除草劑在30余個國家被禁用或取消登記。另外，全球已發現188種雜草的324個生物型對19類化學除草劑產生了抗藥性，使得藥效降低、用藥量增加、成本提高，也更加重了污染。因此，市場需求開始面向廣譜、高效、低毒的新型除草劑的研制，發展生物除草技術已逐漸成為全球的共識。HZ-31多孢木霉是本實驗室從患病大刺兒菜根部分離篩選出的生防菌株，前期研究結果顯示該菌株對藜、豬殃殃、野燕麥等雜草具有高效除草活性，對主栽作物作物春小麥、蠶豆、豌豆均無致病性，該菌株具有開發成為真菌除草劑的潛力。針對生防菌株儲存期短且不穩定的特點，本研究擬通過篩選出對活體菌株安全、對環境友好的載體，研制微生物除草劑劑型，同時對劑型抗紫外作用、貨架壽命及除草效果進行測定。研究開發出適宜田間防除藜、豬殃殃等主要雜草的微生物除草劑新劑型，以期協調運用其他環境友好型防治技術，構建田間雜草生物防治技術體系提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 供試載體和助劑

載體(高嶺土、硅藻土、拉開粉、磷酸鉀、幾丁質、殼聚糖)、穩定劑(膨潤土、輕質碳酸鈣)、潤濕劑(SDS)、分散劑(羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯醇)。

1.2 載體和助劑的篩選

將高嶺土、硅藻土、磷酸鉀、拉開粉、幾丁質、殼聚糖和羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、膨潤土、輕質碳酸鈣、聚乙烯醇等載體和助劑，分別按2 %的比例加入菌株HZ-31對應的最適培養基。分別以200 μl的菌液(稀釋106個/mL)涂平板，4～6 d之后觀察菌落生長狀況，確定其對菌株孢子萌發的影響。將8 mm的菌餅置于不同載體或助劑的培養基中，觀察不同載體助劑對菌株生長狀況的影響。

1.3 菌株HZ-31可濕性粉劑制備

將HZ-31菌粉與篩選出的適宜載體、助劑，按照50 %的載體、6 %的分散劑、1 %穩定劑和3 %的潤濕劑的比例混合，將樣品在研缽中初步磨細、混勻，然后于小型高速粉碎機中粉碎，制成可濕性粉劑。

1.4 載體抗紫外作用

將載體高嶺土、幾丁質和聚乙烯醇與菌粉混合后置于距紫外燈30 cm處照射，隔20 min取出，無菌水溶解后用移液槍取出200 μl涂平板。恒溫箱中培養后統計菌落數量，以不加載體的菌粉為對照，測定載體對菌種抗紫外線保護效率。

1.5 貨架壽命試驗

將載體高嶺土、幾丁質和聚乙烯醇與菌粉混合后裝入廣口瓶中，分別在常溫20和4 ℃條件下儲存。每1個月測定含活菌量。測定時菌劑加滅菌水溶解，利用稀釋平板法涂平板，以不加載體的菌粉為對照，記錄測定值，測定載體對菌儲存時間的影響。

1.6 HZ-31可濕性粉劑對藜和豬秧秧的防除效果

將農科院試驗田間生長4～5葉期，葉色正常的藜、豬殃殃移栽于Φ=15 cm花盆中，于實驗室內培養；將制備的HZ-31的可濕性粉劑溶解，分別將溶解后的可濕性粉劑和HZ-31菌株發酵液進行接種試驗，用小噴壺噴霧接種到移栽的健康雜草植株上，至莖葉上流滴為度。以接種清水的植株作為空白對照。每處理設置3次重復。7 d后調查雜草發病程度，稱鮮重，計算發病率、鮮重效、病情指數。

2 結果與分析

2.1 載體篩選

將所有載體按照2 %的比例分別加入對應最適培養基，取200 μl的菌種稀釋液均勻涂平板，同時將8 mm直徑的菌餅置于平板培養，測菌落直徑。菌株HZ-31在含不同載體的培養基上，菌落數量及直徑測量結果如表1。

表1 HZ-31在不同載體上菌落數量及直徑記錄

圖1 載體對HZ-31的抗紫外保護作用Fig.1 uv protection of carrier to HZ-31

由表1看出，高嶺土、幾丁質和聚乙烯醇載體處理后，菌落萌發數量多且菌落生長較快，故選作HZ-31的載體。

2.2 菌株HZ-31可濕性粉劑制備

以高嶺土、幾丁質作為載體，聚乙烯醇作為分散劑，結合適量的膨潤土作為穩定劑，SDS作為潤濕劑，進行可濕性粉劑的制備。雖然SDS對菌落生長沒有起到明顯的促進作用(表1)，但在農藥可濕性粉劑配制過程中，它不僅可以保證產品遇水時能夠被快速潤濕，而且能協助分散劑與原藥粒子迅速結合，因此，本試驗中選用SDS作為潤濕劑。

將HZ-31菌粉與篩選出的適宜載體、助劑按照50 %的載體、6 %的分散劑、1 %穩定劑和3 %的潤濕劑的比例混合，粉碎，再混合，制成可濕性粉劑。

2.3 載體抗紫外作用

合適的載體可以優化菌體生存的微環境，在自然狀態下也可以吸收部分陽光紫外輻射，對菌體起到一定的保護作用。青海地處高原，室外紫外線強度大，菌劑使用時必須要有較強的抗紫外能力，所以篩選出可以增強菌種抗紫外能力的載體具有重要意義。

從圖1可以看出，對照處理的活菌量在波長312 nm的紫外照射20 min 后急劇下降，而在紫外照射40 min 內，高嶺土、幾丁質和聚乙烯醇對HZ-31的保護效率在70 %以上。60 min后保護效率下降直至趨于平緩。在80 min后各載體對菌的保護效率均下降至60 %左右。篩選出的高嶺土、幾丁質和聚乙烯醇對HZ-31均有較好的抗紫外保護作用。

圖2 載體對HZ-31顆粒劑架壽命的影響Fig.2 Effect of carriers on shelf life of HZ-31 granules

2.4 貨架壽命

生防菌劑要應用到實際生產中，要求必須在長時間貯存后仍保存較高的活菌量和菌活性，而適宜載體助劑可以延長菌劑的儲存，故載體助劑對菌劑的貯存能力的延長是判斷載體品質的一項重要指標。將載體高嶺土、幾丁質和聚乙烯醇與菌粉混合后加滅菌水溶解，取106倍稀釋液涂平板，以不加載體的顆粒劑為對照，測定載體對菌儲存時間的影響。

從圖2可以看出，在4 ℃保存條件下，加入載體后的活菌量一直高于對照。在20 ℃保存條件下，對照活菌量在4個月后迅速下降，后又趨于平穩，但載體處理下降趨勢緩慢，儲存5個月時，對照活菌量為1.53×103個/g，載體的活菌量3.94×105個/g。證明載體處理可明顯增加HZ-31在常溫20 ℃條件下的貨架壽命。

2.5 HZ-31可濕性粉劑對藜和豬秧秧的防除效果

表2結果顯示，接種后7 d，HZ-31可濕性粉劑對豬秧秧的發病率、鮮重效和病情指數分別是86.5、88.6、82.3，對藜的發病率、鮮重效和病情指數分別是73.0、64.7、68.4。菌株發酵液對豬秧秧和藜的發病率、鮮重效和病情指數分別是59.3、57.7、61.3和51.8、43.2、54.4。菌株HZ-31可濕性粉劑對豬秧秧和藜2種闊葉雜草的盆栽防效顯著高于發酵液。

3 結 論

表2 HZ-31可濕性粉劑和發酵液對藜和豬秧秧的致病力比較

本研究以具有較強致病活性的生防菌株HZ-31作為研究對象，通過培養基皿內試驗篩選法篩選出了HZ-31適合的載體為高嶺土、幾丁質和聚乙烯醇，這3種載體對HZ-31均有較好的抗紫外保護作用，且對延長HZ-31的儲存期效果較好，可明顯增加在常溫20 ℃條件下的貨架壽命，低溫保存效果更顯著。

將HZ-31菌粉與篩選出的適宜載體、助劑按照一定比例混合，初步制備了HZ-31可濕性粉劑，并進行盆栽除草試驗。可濕性粉劑對豬秧秧和藜2種闊葉雜草的盆栽防效顯著高于發酵液，說明載體可明顯提高菌株除草效果。

4 討 論

微生物除草劑的開發應用比化學農藥的開發存在更大的難度，其藥效受外界環境影響很大，選擇合適的劑型及載體助劑保持菌劑的穩定性和侵染活力至關重要，是生物農藥開發成功與否的關鍵[7-10]。通過高效菌株HZ-31菌劑的研制，有望協調運用其他環境友好型防治技術，構建田間雜草生物防治技術體系，從而有效替代部分高毒化學農藥，緩解和減輕農業生產中長期和大量依賴化學除草劑施用所造成的能源和環境問題。

雜草生防菌應具備對靶標雜草強致病力的同時，又得保證其穩定性。由于微生物細胞本身的生理特性，不能有效解決生物細胞長期常溫保存的技術瓶頸，使得發酵基質的固體劑型不能像化學除草劑一樣長期貯藏，與化學除草劑相比處于劣勢。因此，未來還需探索出一種具有更長貨架期的劑型，延長其貨架壽命，提高對不良環境的抵抗力，為該菌株大田應用奠定更堅實的基礎。同時還需在加強不同微生物、微生物菌劑與減量除草劑復配，開發新型除草劑方面加大力度。

[1]強 勝，陳世國. 生物除草劑研發現狀及其面臨的機遇與挑戰[J]. 雜草科學，2011，29(1):1- 6．

[2]Ingvar S, Mark S. Regulating biocontrol agents: a historical perspective and a critical examination comparing microbial and macrobial agents[J]. BioControl, 2013, 58:575-593.

[3]程 亮，朱海霞，郭青云. 野燕麥生防菌株HZ-31的分離與致病性研究[J]. 西北農業學報，2012,21(6):167-173.

[4]吳學民，馮建國，馬 超. 農藥制劑加工實驗第二版[M]. 北京：化學工業出版社，2014.

[5]薛澤程. 50 %農用鏈霉素·諾爾霉素可濕性粉劑的研制[D]. 西南大學, 2007:25-41.

[6]劉振華. 多粘類芽孢桿菌和海洋芽抱桿菌可濕性粉劑的研制及其加工工藝的優化與放大[D]. 上海華東理工大學，2011:22-86.

[7]Dayan F E，Duke S O，Grossmann K. Herbicides as probes in plant biology[J].Weed Science，2010，58: 340-350．

[8]Chen S，Yin C，Qiang S，et al. Chloroplastic oxidative burst induced by tenuazonic acid，a natural photosynthesis inhibitor，triggers cell necrosis inEupatoriumadenophorumSpreng[J]. Biochim Biophys Acta-Bioenergetics, 2010, 1797:391- 405.

[9]Duke S O. Herbicide and pharmaceutical relationships[J]. Weed Science，2010，58: 334-339．

[10]Palmer W A，Heard T A，Sheppard A W. A review of Australian classical biological control of weeds programs and research activities over the past 12 years[J]. Biological Control，2010，52:271-287．

(責任編輯 李山云)

DevelopmentofBiocontrolAgentofTrichodermapolysporumHZ-31andItsEffectonVirulenceofBroadleafWeeds

ZHU Hai-xia, MA Yong-qiang, GUO Qing-yun*

(Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pest in Xining in Ministry of Agriculture/Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management in Qinghai Province, Xining Qinghai 810016，China)

TrichodermapolysporumHZ-31 was selected as a high pathogenicity strain to weeds, the development of biocontrol agents ofTrichodermapolysporumHZ-31 and its effect on virulence of broadleaf weeds were studied.Proper carrier and auxiliary were screened, and wettable powder was developed as biological herbicide dosage forms. Their resistance to ultraviolet, shelf life and control effect on seedlings ofChenopodiumalbumandGaliumaparinewere also determined. The result showed that the optimal vectors of HZ-31 were identified as kaolin, chitin and the polyving alcohol, these 3 kinds of carriers showed good resistance to ultraviolet, carriers obviously extended the shelf-life of HZ-31 under the condition of 20℃, and the effect of low temperature preservation was more significant. The control effects of wettable powder of strain HZ-31 toChenopodiumalbumandGaliumaparinewere significantly higher than that of the pure fermented liquid.The development of biocontrol agent HZ-31 was expected to coordinate with environmental friendly control technology and set up a system of weeds biological control in the field.

TrichodermapolysporumHZ-31; Development of dosage forms; Control effect to weeds

1001-4829(2017)3-0606-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.3.022

S476

A

2016-07-20

國家自然科學基金(31560518)；中國科學院“西部之光”人才培養計劃

朱海霞(1985-)，女，青海西寧人，副研究員，主要從事雜草生物防治研究，E-mail：zhuhaixia0101@163.com，*為通訊作者，郭青云，女，研究員，主要從事農田雜草治理研究，E-mail：guoqingyunqh@163.com。