靶向PIK3CA和AKT3基因RNA干擾對家兔SCs增殖的影響

王利娜,賈先波，陳仕毅，王 杰，賴松家

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種研究所，四川 成都 611130)

靶向PIK3CA和AKT3基因RNA干擾對家兔SCs增殖的影響

王利娜,賈先波，陳仕毅，王 杰，賴松家*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種研究所，四川 成都 611130)

PI3K與AKT組成的PI3K-AKT信號通路在細(xì)胞的增殖以及凋亡具有重要意義，本試驗旨在研究該信號通路在家兔SCs增殖過程中發(fā)揮的作用。采用siRNA介導(dǎo)的PIK3CA和AKT3基因進(jìn)行基因的沉默表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對處于對數(shù)生長期的細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-PIK3CA-03或si-AKT3-01后48 h，分別對靶基因和上下游基因PTEN和FoxO1進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，并采用CCK-8試劑盒通過酶標(biāo)儀檢測其在轉(zhuǎn)染si-PIK3CA-03或si-AKT3-01后對細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果表明：在轉(zhuǎn)染si-PIK3CA-03后，PIK3CA和AKT3基因的相對表達(dá)量均顯著下調(diào)，PTEN和FoxO1基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)；當(dāng)轉(zhuǎn)染了si-AKT3-01后，PTEN和FoxO1基因表達(dá)量均顯著上調(diào)。表明PTEN、FoxO1基因與PIK3CA、AKT3基因的相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。轉(zhuǎn)染實驗組OD值顯著低于空白對照組(P<0.05)，說明通過轉(zhuǎn)染實驗下調(diào)PIK3CA和AKT3基因表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力均有顯著的下降。由此說明，分別抑制表達(dá)PIK3CA、AKT3基因后，靶基因的表達(dá)量顯著下降，家兔SCs的增殖能力也顯著下降，說明PIK3CA、AKT3基因能夠正向調(diào)控肌細(xì)胞的增殖。

PIK3CA基因；AKT3基因；siRNA；SCs

作為原癌基因，3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide3-kinase， PI3K)家族成員參與多種信號通路[1]，在細(xì)胞的生長、分化和細(xì)胞凋亡途徑中起重要作用[2]，從而影響細(xì)胞的數(shù)量和體積大小。然而目前有關(guān)探究該通路相關(guān)基因?qū)趋兰∩L發(fā)育作用的研究仍罕有報道。PI3K激活后在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3與細(xì)胞內(nèi)信號蛋白AKT的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，磷酸化AKT蛋白的308位蘇氨酸，活化AKT蛋白。活化后的AKT通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白[3]，如Bad、Caspase-9、NF-κB、GSK-3、FKHR、p21Cip1，和p27Kip1等，進(jìn)而起到調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等作用。PI3K-AKT信號通路對癌癥細(xì)胞以及干細(xì)胞的存活和增殖具有顯著的影響，例如采用LY294002特異性阻斷PI3K信號通路后，會顯著抑制人肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)的增殖[4]。本試驗首先分離家兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，再針對PI3K-AKT信號通路上的PIK3CA和AKT3基因，采用介導(dǎo)的靶基因沉默表達(dá)的方式研究其對家兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(skeletal muscle satellite cells，SCs)增殖的影響。家兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離和siRNA介導(dǎo)的靶基因沉默。

1 材料與方法

1.1 主要材料s

試驗于2015 年3月至2016年2 月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種研究所進(jìn)行。

實驗動物：1日齡新生仔兔。

主要試劑：RNA提取試劑RNAiso plus(TaKaRa)，實時熒光定量試劑盒SYBR Premix ExTaqTMⅡ(TaKaRa)，HG-DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Gbico)，馬血清(Gbico)， Percoll(Sigma)等。Desmin一抗和SABC試劑盒均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

引物：定量引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，si-PIK3CA和si-AKT3序列由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計和合成。

1.2 兔SCs的培養(yǎng)

參照鄭素月[5]的研究采用組織塊培養(yǎng)法分離兔SCs細(xì)胞。取仔兔后腿肌肉組織，將其剪成1 mm3左右的碎塊，以一定的密度接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，放于37 ℃，5 % CO2的培養(yǎng)箱中，直到SCs從組織塊中游離出來并增殖到70 %～80 %后，進(jìn)行消化，重懸細(xì)胞并采用Percoll密度梯度離心[6]對細(xì)胞進(jìn)行純化。

將配好的60 %和20 %密度梯度的Percoll液按從下到上的順序依次緩慢輕盈的轉(zhuǎn)入15 mL的離心管內(nèi)，每層3 mL，已重懸好的細(xì)胞懸液輕輕注入最上層，500 r/min 離心25 min。收集60 %和20 % Percoll液之間的液體，離心重懸后培養(yǎng)。

1.3 免疫化學(xué)鑒定SCs

將細(xì)胞接種于10 mm×35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，待密度占據(jù)培養(yǎng)皿面積的80 %左右時，倒掉培養(yǎng)液，PBS洗2次；按照武漢博士德公司SABC試劑盒的操作說明進(jìn)行SCs細(xì)胞Desmin抗體的免疫組化染色。陰性對照用PBS代替一抗。DAB顯色2～10 min，自來水沖洗；顯微鏡下觀察照相。

1.4 誘導(dǎo)分化和HE染色

將細(xì)胞懸液接種在3.5 cm的培養(yǎng)皿中，加入生長培養(yǎng)基培養(yǎng)，增殖至鋪滿皿底70 %～80 %時，換用分化培養(yǎng)基。對不同分化階段細(xì)胞采用HE染色。

倒掉培養(yǎng)基，PBS清洗兩次；4 %多聚甲醛固定細(xì)胞30 min， PBS沖洗2次；0.5 %的鹽酸乙醇分化液分化30 s；蘇木精染液染色5 min，自來水清洗30 s；伊紅染色20 s；增色液沖洗1～2次；用自來水沖洗，停止染色并去掉多余染料，顯微鏡下拍照。

1.5 siRNA合成及轉(zhuǎn)染細(xì)胞

根據(jù)GeneBank中兔PIK3CA和AKT3基因全長cDNA序列，由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計并合成特異性siRNA，引物序列：si-PIK3CA上游引物-5’ GCUAUUGCGUUGCAACUUU dTdT 3’，下游引物-3’ dTdT CGAUAACGCAACGUUGAAA 5’；si-AKT3上游引物-5’ GGCAAGAUGUAUAUGAUAA dTdT 3’，下游引物-3’ dTdT CCGUUCUACAUAUACUAUU 5’。

選擇對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗，選取合適密度后接種在12孔板里，按照廣州銳博公司的siRNA產(chǎn)品使用說明利用LipofectamineTM2000將濃度為50 nM的siRNA分別轉(zhuǎn)染到SCs中。每個處理設(shè)3個對照，另外設(shè)置空白對照和siRNA陰性對照。

1.6 CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞的增殖

按照劉愛旗[7]的方法，采用CCK-8試劑盒在450 nm波長下，檢測經(jīng)過特異siRNA轉(zhuǎn)染處理后SCs的增殖能力變化。將細(xì)胞接種96孔板，每個處理48孔。第2小時起每隔24 h計數(shù)細(xì)胞1次，每次計數(shù)6個復(fù)孔取平均值，連續(xù)8 d。根據(jù)結(jié)果繪制生長曲線。

1.7 熒光定量檢測相關(guān)靶基因的相對表達(dá)量

應(yīng)用實時定量PCR 技術(shù)，以GAPDH為內(nèi)參，檢測siRNA處理后靶基因和上下游相關(guān)基因的表達(dá)情況。數(shù)值采用2-ΔΔCt法定量分析，每個處理設(shè)3個對照，計算平均值。引物參數(shù)詳見表1。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 兔SCs免疫化學(xué)鑒定

利用Desmin抗體對收集并培養(yǎng)2 d的細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示Desmin呈陽性表達(dá)(圖1)，且陽性率高達(dá)90 %以上。細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色排列，細(xì)胞核被蘇木素復(fù)染成淡藍(lán)色；陰性對照組細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)沒被染色，而僅有細(xì)胞核被染成藍(lán)色。

2.2 兔SCs分化過程中的形態(tài)學(xué)變化

經(jīng)顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)剛分離獲得的SCs的折光性強(圖2)，未貼壁時為圓形的亮點(圖2A)，隨著培養(yǎng)時間的增加，細(xì)胞逐漸貼壁， SCs貼壁呈長梭形或紡錘形(圖2B)。更換為含2 % HS的分化培養(yǎng)基后，細(xì)胞平行方向生長的趨勢明顯，分化第2天細(xì)胞開始出現(xiàn)融合(圖2C)。分化第4天可觀察到圓柱狀的肌管。經(jīng)HE染色后，胞質(zhì)被染成紅色，細(xì)胞核被染成淡藍(lán)色(圖2D)。

表1 熒光定量PCR引物信息

圖1 SCs細(xì)胞Desmin抗體免疫鑒定(400×)Fig.1 Identification of SCs by Desmin antibody

圖2 SCs的分化過程變化Fig.2 The differentiation process of SCs

2.3 轉(zhuǎn)染si-PIK3CA和si-AKT3對靶基因的影響

分別轉(zhuǎn)染濃度為50 nM的PIK3CA和AKT3基因siRNA進(jìn)入SCs。與對照組相比，si-PIK3CA下調(diào)了細(xì)胞內(nèi)PIK3CA基因的mRNA表達(dá)水平的85.16 %。si-AKT3下調(diào)了細(xì)胞內(nèi)AKT3基因的mRNA表達(dá)水平的83.93 %。因此，合成的siRNA均可用于后續(xù)試驗。

2.4 SCs生長曲線繪制

接種純化兔SCs對數(shù)生長期細(xì)胞，進(jìn)行為期8 d的CCK-8生長曲線測定試驗(圖3)。SCs純化細(xì)胞在接種24 h后就開始進(jìn)入對數(shù)生長期，之后細(xì)胞生長逐漸進(jìn)入停滯期，群體倍增時間約為48 h。

圖3 新生仔兔原代純化SCs生長曲線Fig.3 The growth diagram of purified SCs

2.5 轉(zhuǎn)染siRNA后SCs的增殖能力檢測結(jié)果

對處于對數(shù)期的細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后48 h，對SCs細(xì)胞進(jìn)行增殖能力檢測。與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染試劑組對細(xì)胞的OD值無顯著影響；轉(zhuǎn)染組OD值顯著低于空白對照組(P<0.05)(圖4)，說明轉(zhuǎn)染si-PIK3CA和 si-AKT3后，細(xì)胞增殖能力均顯著下降。表明PIK3CA和AKT3被抑制表達(dá)后，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖能力會受到顯著的抑制。

2.6 轉(zhuǎn)染siRNA后上下游相關(guān)基因的相對表達(dá)量

在轉(zhuǎn)染si-PIK3CA-03后(圖5A)，PIK3CA和AKT3基因的相對表達(dá)量均顯著下調(diào)，PTEN和FoxO1基因的表達(dá)量均表現(xiàn)出顯著上調(diào)；而當(dāng)轉(zhuǎn)染了si-AKT3-01后(圖5B)， 除了PTEN和FoxO1基因表達(dá)量顯著提高外，為了激活更多AKT3的表達(dá)，PIK3CA基因的相對表達(dá)量也顯著上調(diào)。

3 討 論

Desmin是SCs細(xì)胞的一種特異性標(biāo)記蛋白，可以用于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒別[8]。本試驗采用免疫組化鑒定的方法鑒定經(jīng)純化的家兔SCs細(xì)胞中的Desmin蛋白。在顯微鏡下觀察到細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色排列，細(xì)胞核被蘇木素復(fù)染成淡藍(lán)色，Desmin呈陽性表達(dá)。陰性對照組細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)沒被染色，而僅有細(xì)胞核被染成藍(lán)色，表明試驗所獲得的細(xì)胞是純度較高的SCs。

PTEN和FoxO1分別是PI3K-AKT信號通路最重要的上下游調(diào)控因子。PTEN是重要的腫瘤抑制基因，可調(diào)控PI3K-AKT信號通路及其下游靶標(biāo)[9]。FoxO1是PTEN/AKT信號通路下游最重要的靶基因[10]，參與了大量的生理進(jìn)程，包括細(xì)胞分化、增殖、凋亡、遷徙及抗應(yīng)激等。周詩瓊和熊兵紅[11-12]均發(fā)現(xiàn)PI3K與AKT蛋白陽性表達(dá)之間呈正相關(guān)(r=0.645，P<0.05)，PTEN與PI3K蛋白陽性表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.354，P<0.05)，PTEN與AKT蛋白陽性表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.365，P<0.05)。本試驗中也發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染si-PIK3CA-03后，隨著PIK3CA和AKT3基因的相對表達(dá)量的均顯著下調(diào)，PTEN基因的表達(dá)量表現(xiàn)出顯著上調(diào)，而當(dāng)轉(zhuǎn)染了si-AKT3-01后，PTEN基因的表達(dá)量也表現(xiàn)出顯著的提高，說明PTEN的表達(dá)與PI3K-AKT信號通路的激活負(fù)相關(guān)，F(xiàn)oxO1基因的相對表達(dá)量均表現(xiàn)出上調(diào)，與PTEN基因的表達(dá)量趨勢相一致。呂艷蓉[13]的研究也證明了細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白水平下降會導(dǎo)致PI3K-AKT被過度激活，進(jìn)而促進(jìn)了下游FoxO家族分子的磷酸化，使其降解增加。說明FoxO1的表達(dá)可以受到PIK3CA、AKT3基因的負(fù)向調(diào)控[14]，而與PTEN的表達(dá)量呈正相關(guān)[15]。

圖4 不同處理組細(xì)胞OD值Fig.4 The OD values in black control and transfections

近年來，越來越多的研究表明了PI3K-AKT信號通路在細(xì)胞增殖、分化中的重要作用[16-18]。PI3K-AKT信號通路可以參與hMSCs增殖和分化過程[19]，以WM(PI3K-AKT通路特異性抑制劑)阻斷PI3K信號通路能延遲豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞肌管的形成，并降低成肌分化標(biāo)志基因MyoD、MyoG和MyHC的表達(dá)[20]。劉蘇健[21]成功構(gòu)建了2條兔AKT1 shRNA真核表達(dá)載體，研究靶向AKT1基因RNA干擾對胸主動脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響，有效地抑制了平滑肌細(xì)胞增殖。筆者對處于對數(shù)期的家兔SCs轉(zhuǎn)染相應(yīng)PIK3CA、AKT3基因特異性siRNA后，發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，陰性對照組對細(xì)胞的OD值無顯著影響；轉(zhuǎn)染組OD值顯著低于空白對照組(P<0.05)。說明通過轉(zhuǎn)染si-PIK3CA-03和 si-AKT3-01，下調(diào)PIK3CA和AKT3基因表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力均有顯著的下降。說明PIK3CA和AKT3在SCs的增殖過程中起到重要的作用，能夠正向調(diào)控肌細(xì)胞的發(fā)育。

圖5 轉(zhuǎn)染siRNA后基因相對表達(dá)量Fig.5 The relative mRNA expression after transfection of siRNA

4 結(jié) 論

分別抑制表達(dá)PIK3CA、AKT3基因后，靶基因的表達(dá)量顯著下降，家兔SCs的增殖能力也顯著下降，說明PIK3CA、AKT3基因會促進(jìn)家兔SCs的增殖過程。從分子水平上闡釋了PIK3CA和AKT3基因影響家兔生長過程的作用機理。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

EffectofsiRNA-mediatedSilencingofPIK3CAandAKT3GenesonProliferationofRabbitSCs

WANG Li-na, JIA Xian-bo, CHEN Shi-yi, WANG Jie, LAI Song-jia*
(Institute of Animal Genetics and Breeding, Sichuan Agricultural University, Sichuan Chengdu 611130, China)

PI3K-AKT signaling pathway plays an important role in cell growth and survival in a variety of tissues. In the present study，the effect of siRNA-mediated silencing ofPIK3CAandAKT3 genes on cell proliferation in rabbit SCs were detected. Transfecting the SCs with either si-PIK3CA-03 or si-AKT3-01, then did the qRT-PCR reaction 48 h later to detect the relative expression level ofPIK3CA,AKT3, PTENandFoxO1. Then detect the OD level of SCs in microplate reader with CCK-8 knit after transfection. The results showed that the expression level ofPIK3CAandAKT3 were significantly lower after transfection while the expression level of PTEN and FoxO1 were significantly higher compared with the black group. It indicated that there were negative correlation between the expression level ofPIK3CA/AKT3 andPTEN/FoxO1. The OD of the experimental group was significantly lower than the black group (P<0.05). It explained that，with the reduction ofPIK3CAandAKT3， the proliferation rate of SCs declined as well. SoPIK3CAandAKT3 genes could play an key role in proliferation of SCs.

PIK3CA；AKT3； siRNA； SCs

1001-4829(2017)3-0702-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.3.039

S829.1

A

2016-04-20

國家兔產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)( CARS-44-A-2)

王利娜，女，河南濟源人，碩士研究生，E-mail:lenasmiling@hotmail.com， *為通訊作者：賴松家，教授，生物技術(shù)與兔遺傳育種，E-mail: laisj5794@gmail.com。