溫度對(duì)鯉CYP2E1同工酶活性的影響

李在建， 操繼躍

(1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252000；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

溫度對(duì)鯉CYP2E1同工酶活性的影響

李在建1， 操繼躍2

(1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252000；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

為了探究溫度對(duì)鯉CYP2E1同工酶活性的影響，本試驗(yàn)以氯唑沙宗(CZX)為探針?biāo)幬锾骄坎煌疁?5、10、15、20、25、30 ℃)對(duì)鯉CYP2E1同工酶活性的影響。結(jié)果表明，CYP2E1同工酶的Km值(以CZX作為探針)在反應(yīng)溫度為25 ℃時(shí)相對(duì)較低，其Vmax(以CZX作為探針)在該溫度時(shí)相對(duì)較高；反應(yīng)溫度對(duì)CYP450酶活性的影響能夠間接反映水溫對(duì)魚(yú)類體內(nèi)藥物代謝的影響;可以推斷魚(yú)類在不同水溫條件下藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的差異主要是由于其CYP450酶在不同溫度下的活性差異所造成的。

溫度；CYP450；鯉；CYP2E1同工酶

CYP450的體外研究方法排除了動(dòng)物內(nèi)部因素的干擾，探究CYP450對(duì)某種特異性底物的代謝，為動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的代謝提供了重要的理論依據(jù)。大部分藥物的代謝都是由CYP450酶介導(dǎo)的，CYP450酶含量相對(duì)較多的器官是肝臟，目前CYP450酶體外研究方法主要圍繞肝臟展開(kāi)。常用的方法有肝組織切片法、肝微粒體體外孵育法、肝臟亞細(xì)胞成分研究法、肝臟離體灌流法和重組代謝酶研究系統(tǒng)等。其中最常用的是肝微粒體體外孵育法[1]。外孵育法主要是讓肝微粒體在體外條件下模擬動(dòng)物機(jī)體生理反應(yīng)， NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，三氯乙酸終止反應(yīng)，測(cè)定孵育液中原型藥物和代謝產(chǎn)物的濃度，并對(duì)代謝產(chǎn)物的特征進(jìn)行鑒定。目前醫(yī)藥工作者主要采用此方法研究藥物代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和藥物的代謝途徑，以及測(cè)定藥物的酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Km和Vmax)，進(jìn)而來(lái)預(yù)測(cè)藥物之間的代謝差異。有研究者利用此方法來(lái)研究海洋藥物971和911對(duì)CYP2E1的影響[2]。余露山等采用此法來(lái)研究依普黃酮的體外代謝情況[3]。此方法具有制備簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，因此，此法是研究藥物代謝最常用的方法。然而此法僅用于體內(nèi)代謝的預(yù)測(cè)，因?yàn)轶w內(nèi)和體外代謝存在一定的差異。本試驗(yàn)以CZX作為探針探究不同水溫(5、10、15、20、25、30 ℃)對(duì)鯉CYP2E1同工酶活性的影響。本試驗(yàn)?zāi)康脑谟跒樗a(chǎn)動(dòng)物CYP450酶系的進(jìn)一步研究以及指導(dǎo)水產(chǎn)動(dòng)物合理用藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用體重為(250±30) g的健康鯉，飼喂不添加抗菌藥物的鯉魚(yú)全價(jià)配合飼料并采用循環(huán)水養(yǎng)殖，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑

NADPH， Roche公司產(chǎn)；CZX(含量98 %，批號(hào)：2289502500)， Acros organics公司產(chǎn)；CZX 標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：100364-200301)，中國(guó)藥品監(jiān)察所產(chǎn)；一氧化碳(CO)，購(gòu)于京華工業(yè)氣體有限公司；其余試劑為國(guó)產(chǎn)化學(xué)試劑，分析純AR。

1.3 主要儀器和設(shè)備

美國(guó)Agilent1100型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；低溫高速離心機(jī)、低溫超速離心機(jī)，Beckman公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；ALC-21002型電子天平，上海市精密科學(xué)儀器有限公司。

1.4 探針?biāo)幬颒PLC檢測(cè)方法的建立

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-草酸銨(20 mmol/L)(35∶25∶40，v/v/v)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm； 流速：1.0 mL/min； 柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

1.4.2 肝微粒體樣品的處理 吸取200 μl肝微粒體孵育于15 mL離心管中，加入4 mL提取液渦旋振蕩1 min，以5000 r/min離心5 min，取上層3 mL于另一15 mL離心管，在60 ℃水浴鍋中氮?dú)獯蹈伞４蹈珊蟮臍堅(jiān)?20 μl甲醇溶解，6000 r/min離心，上清液過(guò)帶注射器的微孔濾膜，取濾液20 μl進(jìn)樣。

1.4.3 孵育液中CZX標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 向8支離心管中分別加入200 μl的空白體孵育液，然后依次加入適量的CZX，使CZX的濃度分別為0.5、1、2、5、10、50、100 和 200 μM。參照肝微粒體樣品處理方法處理后，進(jìn)樣。以肝微粒體中CZX的峰面積(A)為橫坐標(biāo)，CZX在肝微粒體中的濃度(C)為縱坐標(biāo)，制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 肝微粒體體外孵育系統(tǒng)的建立

1.5.1 蛋白濃度的優(yōu)化 50 μl肝微粒體、50 μl NADPH、50 μl Tris-HCl緩沖液，固定反應(yīng)溫度，加入50 μl CZX溶液(20 μM), 反應(yīng)15 min加入冰冷的三氯乙酸(15 %)終止反應(yīng)，取200 μl上清液處理樣品。本次反應(yīng)中鯉肝微粒體蛋白的濃度依次為0.025、0.05、0.1、0.3、0.4、0.5和1 mg/L，將CZX峰面積帶入所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出對(duì)應(yīng)濃度，將蛋白濃度為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物濃度為縱坐標(biāo)繪圖，確定出最佳反應(yīng)濃度。

1.5.2 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 50 μl肝微粒體、50 μl NADPH、50 μl Tris-HCl孵育緩沖液，固定反應(yīng)溫度，加入50 μl CZX溶液(20 μM)并啟動(dòng)反應(yīng)，分別在5、10、15、 20、30、40、60和 90 min加入冰冷的三氯乙酸(15 %)，終止反應(yīng)。將CZX峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出濃度，確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.5.3 利用酶促動(dòng)力學(xué)原理求Vmax和Km值 在50 μl肝微粒體、50 μl NADPH、50 μl Tris-HCl孵育緩沖液分別加入0.625、1.25、2.5、5、10、20、30、40、60、80、100、120、150和200 μM的CZX分別在5、10、15、20、25、30 ℃啟動(dòng)反應(yīng)，15 min后加入冰冷的三氯乙酸，終止反應(yīng)，取200 μl上清液處理樣品，每組3個(gè)重復(fù)。計(jì)算出不同底物濃度下CZX的反應(yīng)速度并帶入下面的方程。

繪制出此反應(yīng)的Michaelies-Meten圖與Eadie-Hosfetee圖并計(jì)算Vmax和Km。酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)均采用Sigma Plot Enzyme Kinetics 1.10分析軟件計(jì)算，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 11.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝微粒體代謝體系的建立

由圖1可知，在0.05～0.500 mg/mL肝微粒體濃度范圍內(nèi)，CZX的減少濃度與蛋白濃度具有良好的線性關(guān)系(Y=-13.865x+7.394,r=0.9979)，在此范圍內(nèi)CZX的反應(yīng)速度基本恒定，參照CYP450體外研究的指導(dǎo)原則[4-5]，選定蛋白濃度為0.2 mg/mL。

由圖2可知，在5～30 min反應(yīng)時(shí)間范圍內(nèi)，CZX的減少濃度與反應(yīng)時(shí)間具有良好的線性關(guān)系(Y=-0.2481x+8.372,r=0.9991)，在此范圍內(nèi)CZX的反應(yīng)速度基本恒定，參照CYP450體外研究的指導(dǎo)原則[4-5]，選定體外反應(yīng)時(shí)間為15 min。

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)CYP2E1活性的影響

表1反映了不同底物濃度在不同溫度條件下的反應(yīng)速度，通過(guò)擬合可以看出CYP2E1同工酶在25 ℃條件下具較小的Km值和較大的Vmax(表2，圖3)，該酶在不同溫度下的差異見(jiàn)圖4～5。

圖1 不同蛋白濃度對(duì)CZX代謝的影響Fig.1 The influence of different carp liver microsomes protein concentration on the metabolism of CZX.

圖2 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)CZX代謝的影響Fig.2 The influence of different reaction time on the metabolism of CZX

3 討 論

鯉CYP2E1的Km值在溫度為25 ℃時(shí)相對(duì)較低，其Vmax在25 ℃時(shí)相對(duì)較高。有學(xué)者曾經(jīng)報(bào)道魚(yú)類的消化酶受外界環(huán)境溫度的影響差異顯著[6]。丁方科(2006)在兩種水溫條件下研究二氟沙星在鯽魚(yú)體內(nèi)的代謝，其結(jié)果表明該藥在鯽體內(nèi)的CLb在冬季和夏季分別為0.015和0.056 L/(h·kg)[7]；祝艷蕾(2009)報(bào)道了2種水溫條件下麻保沙星在鯽魚(yú)體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)及殘留，研究結(jié)果表明麻保沙星在鯽體內(nèi)的CLb在冬季和夏季條件下分別為0.03和0.05 L/(h·kg)[8]。這些研究結(jié)果都表明魚(yú)類在夏季體內(nèi)藥物代謝速率較冬季快，這與本結(jié)果相一致。

圖3 CYP2E1同工酶在不同溫度下的雙倒數(shù)曲線Fig.3 The CYP2E1-like isoform Lineweaver-Burk maps at different temperature

表1 CZX 在不同濃度下的反應(yīng)速度 (Mean±S.D., n=3)

表2 CYP2E1同工酶在不同反應(yīng)溫度下的酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)

圖4 Km 在不同反應(yīng)溫度下的比較Fig.4 The comparison of the Km value at different temperature

圖5 Vmax 在不同反應(yīng)溫度下的比較Fig.5 The comparison of the Vmax at different temperature

4 結(jié) 論

體外反應(yīng)溫度對(duì)CYP450酶活性的影響能夠間接反映不同季節(jié)水溫對(duì)魚(yú)類體內(nèi)藥物代謝的影響。由此可推斷出魚(yú)類在不同水溫條件下藥物代謝的差異主要是由于其肝臟內(nèi)CYP450酶在不同反應(yīng)溫度下活性的差異所造成的。大量的研究表明酶分子骨架對(duì)酶的活性起著重要的作用[9-12]。反應(yīng)溫度有可能改變了魚(yú)類肝臟CYP450酶的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致不同反應(yīng)水溫條件下CYP450酶活性的差異。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

EffectofTemperatureonCarpCYP2E1-likeIsoformActivity

LI Zai-jian1, CAO Ji-yue2

(1.College of Agriculture, Liaocheng University, Shandong Liaocheng 252000, China; 2. College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Hubei Wuhan 430070, China)

To study the effect of temperature on carp CYP2E1， the influence of reaction temperature(5, 10, 15, 20, 25, 30 ℃) on the CYP2E1-like isoform activity was determined with Chorzoxazone (CZX) as substrate; The results revealed that the Michaelis constant (Km) value of CYP2E1-like isoform(with CZX as probe) was minimal and the maximum reaction velocity (Vmax) was maximal at 25 ℃ compared with those at other temperatures. The influence of reaction temperature on CYP450 activity could reflect the influence of water temperature on drug metabolism in fish indirectly; So the variations of fish pharmacokinetic parameters at different water temperatures could be due to the variation of CYP450 activity at different temperatures.

Temperature; CYP450; Carp; CYP2E1-like isoform

1001-4829(2017)3-0707-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.3.040

S859.7

A

2016-04-26

山東省自然科學(xué)基金(2016ZRB019RS)；聊城大學(xué)博士啟動(dòng)基金(318051314)

李在建(1986-)，男，山東青州人，博士，講師，研究方向?yàn)楂F醫(yī)藥理與毒理學(xué)，E-mail:lizj8603@163.com。