基于代謝組學方法的姜黃素抗抑郁作用生物標志物初步篩查

馬致潔 張祎 董捷鳴 于小紅 趙小梅 浦仕彪

[摘要]該文運用代謝組學的技術手段尋找與姜黃素干預抑郁模型大鼠相關的潛在標志物，從而探究姜黃素用于抗抑郁的作用機制。選取健康雄性SD大鼠隨機分成4組，采用慢性不可預知溫和應激（CUMS）刺激造模，造模2周后灌胃姜黃素（200 mg·kg-1）、文拉法辛（40 mg·kg-1）、空白組和模型組同時灌等體積的1% CMCNa生理鹽水，每天1次，連續2周。采集大鼠血清并采用LC/MSITTOF方法對各組血清代謝差異進行表征，利用多元統計分析方法篩選出可能的潛在生物標志物并分析其可能的代謝通路。在分別給予姜黃素和文拉法辛后，CUMS模型組大鼠的抑郁各項指標均有顯著性改善（P<005），但姜黃素和文拉法辛組之間則無明顯差異；通過PCA和PLSDA分析，經姜黃素或文拉法辛干預后，CUMS模型組大鼠體內的小分子代謝物水平體現出恢復正常的趨勢，而且姜黃素組尤為明顯；通過代謝組學技術手段，從中篩選得到11個與姜黃素抗抑郁功效相關的生物標志物，同時涉及到7條代謝通路。研究表明姜黃素具有確切的抗抑郁作用，其在宏觀和微觀層面均有體現，可與陽性藥物文拉法辛相比；姜黃素在體內可能是通過影響甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯互變及醚脂類代謝等發揮抗抑郁功效，今后還需進一步探索。

[關鍵詞]姜黃素； 抗抑郁； 代謝組學； 生物標志物； CUMS模型

Preliminary screening of biomarkers for curcumin′s antidepressant

effect based on metabonomics method

MA Zhijie1，2， ZHANG Wei1， DONG Jieming2， YU Xiaohong2， ZHAO Xiaomei2， PU Shibiao1*

（1 College of Pharmaceutical Science， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China；

2. Beijing Friendship Hospital， Capital Medical， Beijing 100050， China）

[Abstract]To screen potential biomarkers of curcumin related to treating depression rats by using metabolomics means， so as to explore the antidepressant action mechanism of curcumin The healthy male SD rats were randomly divided into four groups Chronic unpredictable mild stress （CUMS） stimulation was conducted for modeling for 2 weeks， and then curcumin （200 mg·kg-1） or venlafaxine （40 mg·kg-1） was given by gavage administration The blank group and model group rats were given with the same volume of 1% CMCNa normal saline， once per day for two weeks The rats serum for each group was collected and LC/MSITTOF method was used to characterize the metabolic differences Also multivariate statistical analysis was used to screen possible potential biomarkers and analyze the possible metabolic pathways After administration of curcumin and venlafaxine respectively， the depression indexes of CUMS model rats were all improved significantly （P<005）， but there were no significant differences between curcumin and venlafaxine groups In PCA and PLSDA analysis after curcumin or venlafaxine intervention on CUMS model group rats， the small molecule metabolites level reflects a normal trend， and particularly for the curcumin group Through metabonomics technology， 11 biomarkers associated with curcumin antidepressant effect were screened， and at the same time seven metabolic pathways were involved The results showed that curcumin had antidepressant effects， which was evident in both macro and micro levels， comparable with positive drug of venlafaxine The antidepressant effect of curcumin may be associated with the glycerol phospholipid metabolism， linoleic acid metabolism， pentose and glucuronic acid ester and ether lipid metabolism， but still need further exploration in the future.endprint

[Key words]curcumin； antidepressant； metabonomics； biomarkers； CUMS model

姜黃為姜科植物姜黃Curcuma longa L的干燥根莖。主產于中國、印度、日本等國家，是臨床常用中藥。姜黃素（curcumin）則是從姜科植物姜黃屬姜黃、莪術、郁金等根莖中提取得到的1種天然黃色色素，為小分子植物酸性多酚，其分子式為C21H20O6，相對分子質量 36837。近年來大量的研究表明，姜黃素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗嘔吐、抗纖維化、抗人類免疫缺陷病毒保護神經系統等作用，其藥理藥效十分廣泛[1]。近年來，PubMed數據庫上收錄的有關姜黃素藥用價值的文獻數量也迅速增多，姜黃素成為醫療保健領域新的研究熱點之一，具有廣闊的開發與應用前景。

研究顯示，姜黃素具有抗抑郁作用，但是抗抑郁的作用機制仍不清楚[2]。慢性溫和不可預知應激模型是1種經典抑郁癥動物模型，其理論依據與人類抑郁癥中慢性、低水平的應激源導致抑郁癥的發生并加速抑郁癥發展的機制更為接近[3]。代謝組學是研究機體代謝產物變化的1種新的系統生物學方法，其通過揭示新陳代謝動態進程中代謝產物的變化規律，較全面了解病理變化過程及機體內物質的代謝途徑，在實驗動物模型評價、病理機制研究及藥物療效評價中展現了其特色和優勢[46]。本研究擬在前期研究基礎上，采用慢性溫和不可預知應激模型評價姜黃素的抗抑郁作用，同時采用LC/MSITTOF方法表征姜黃素干預抑郁模型大鼠血清內源性代謝物的變化差異，通過主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別（PLSDA）分析，篩選姜黃素抗抑郁作用的內源性小分子生物標志物，并結合代謝通路數據庫，探討可能的作用機制和通路，為進一步闡明姜黃素抗抑郁作用機制提供參考。

1材料與方法

11儀器與試藥高效液相色譜離子阱飛行時間串聯質譜儀（LCMSITTOF，日本島津Shimadzu）；radient A10 MillQ超純水器（美國 Millipore 公司）；冷凍離心機（Sigma，德國）；微量分析天平（Mettler Toledo AL204 瑞士）；渦旋混勻器（HYQ 2121A）；自制曠場行為測試箱（長寬高為100 cm×100 cm×80 cm）、秒表、電擊儀、烘箱、冰水游泳桶等。色譜柱為Waters XBridgeC18（21 mm×150 mm，35 μm）離子源為ESI±；毛細管電壓為3 500 V；掃描范圍m/z 50～1 000；碰撞能為7 eV；錐孔能為5 eV；脫溶劑氣流量為60 L·min-1；脫溶劑氣溫度為180 ℃。

甲醇（色譜級，Fisher Scientific）、去離子水經（182 MΩ）Millipore MilliQ系統（Millipore Co，美國）超純水器凈化，其他試劑均為市售分析純。姜黃素購自美國Sigma公司，鹽酸文拉法辛膠囊（25 mg/粒）購自成都康弘藥業集團股份有限公司。

12動物分組與給藥SD大鼠32只，SPF級，體質量（180±20） g左右，雄性，購于軍事醫學科學院實驗動物中心（合格證號SCXK軍2014004）。大鼠飼養于屏障動物房，室溫（20±2） ℃，相對濕度60%～70%，通風良好、環境安靜，室內保持12 h照明，12 h黑暗，并定期消毒。將SD大鼠隨機分為4組，正常對照組、CUMS模型組、姜黃素（200 mg·kg-1）干預組，鹽酸文拉法辛（40 mg·kg-1）組，每組8只。除空白組外，所有動物前2周只造模不給藥，后2周邊造模邊給藥，給藥組分別灌胃相應的藥物，空白組和模型組灌胃等量1% CMCNa生理鹽水；其中按照給藥設定劑量，姜黃素和鹽酸文拉法辛藥物均采用相應體積的1% CMCNa生理鹽水進行溶解。

13造模方法慢性溫和不可預知應激（CUMS）程序進行抑郁造模，造模過程與參考文獻[79]的方法并加以改進。模型組和給藥組給予的刺激因素包括禁食、禁水、4 ℃冰水游泳、50 ℃熱應激、夾尾、電擊足底、潮濕墊料和鼠籠傾斜45 °、束縛應激、陌生物品、噪音刺激。每日隨機給予1種刺激，保證在整個造模過程中每種刺激累計使用2～3次，順序隨機，應激持續28 d。

14體質量和糖水偏愛試驗造模第0，7，14，21，28天分別測定大鼠體質量；糖水偏愛試驗方法參考文獻[10]，在動物造模前1周對其進行糖水偏愛訓練，造模第0，7，14，21，28天分別測定純水和糖水消耗量，以糖水偏愛率為評價指標，糖水偏愛率=糖水消耗量/總液體消耗量×100%。

15曠場試驗分別在造模開始前1天和開始后第14，28天將單只大鼠放在自制的曠場

箱（長寬各80 cm，高40 cm）中央，敞箱底分為16個方格，用黑漆涂滿內壁，記錄大鼠5 min內的活動：觀察指標包括中央格停留時間（自大鼠被放入中央格至大鼠3只爪子跨離開該格的時間，用s計）、水平格數（以穿越底面方格數為其水平得分，穿越1個格子計為1分）、垂直運動（兩前腿離地或爬墻壁計為1次）、理毛時間和糞便。并在徹底清潔敞箱后進行下只動物的測定[11]。

16樣品采集與處理于末次給藥后，眼眶靜脈取血，分離血清后置于-80 ℃冰箱，檢測前將大鼠血清于-80 ℃冰箱中取出，復融，取250 μL加入到15 mL EP管中，再加入750 μL的甲醇溶液，混勻，靜置，4 ℃下冷凍離心，1萬 r·min-1，10 min，取上清，并用022 μm微孔濾膜濾過，進樣。

17數據處理與分析數據以±s表示。運用SPSS 180軟件進行單因素方差分析（ANOVA）統計處理，兩兩比較采用LSD檢驗，以P<005作為差異存在統計學意義的界限。代謝組學質譜數據采用Mzmine 25軟件進行色譜峰識別，再將數據導入SIMCAP11軟件，標準化后進行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別（PLSDA）分析。接著運用variable influence in the projection（VIP）方法來預測各個數據對模型的貢獻值，VIP>1說明具有明顯的貢獻，有統計學意義，為可能的潛在標志物。再采用Oneway ANOVA的方法，根據P<005的原則，排除沒有顯著性差異的數據。通過這一系列步驟之后，將具有統計學意義的數據在Human Metabolome Database（HMDB）、KEGG數據庫中進行匹配，篩選潛在的生物標志物；最后在Metabo Analyst 30數據庫中分析可能的代謝通路變化。endprint

2結果

21行為學實驗以體質量、糖水偏愛率和曠場行為作為CUMS造模的行為學評價指標，本研究中，與正常對照組相比，第28天數據顯示：模型組大鼠體質量增長緩慢、糖水偏愛率低、穿格數和直立次數明顯偏少（P<005或P<001），表明造模過程中慢性溫和不可預知的刺激造成大鼠的食欲下降、快感缺乏、運動和探索能力下降，造模成功。連續給予姜黃素干預后，與模型組相比，大鼠體質量、糖水偏愛、穿格和直立次數均增高（P<005），但與鹽酸文拉法辛組相比較，各項指標則無明顯差異（表1）。

22血清PCA分析通過PCA主成分分析，結果顯示第28天時各組大鼠分布在不同的區域中，正常對照組和模型組分別分布于對立的2個象限中，而鹽酸文拉法辛組和姜黃素大鼠則分布在上述2組之間的中心區域內（圖1）。由此可見，在實驗過程中，隨著造模措施的持續進行，模型組大鼠體內的小分子代謝物水平出現了顯著性的變化，而通過分別給予鹽酸文拉法辛和姜黃素的干預措施后，體內的小分子代謝物則體現出向正常水平恢復的趨勢。再者，姜黃素組相比于文拉法辛組，要更接近于正常組一些。

23血清PLSDA分析PLSDA方法是在PCA分析的基礎上，增加了有監督性的分級干預，旨在放大組間差異，以便于尋找潛在的生物標志物。其中ScorePlot圖中也分別展現出了各組大鼠在第28天時的分布區域，與PCA分布圖大體相似；loadingplot則進一步展現出了擬合模型中的各個小分子代謝物在各組間的分布水平；模型驗證圖則可以驗證PLSDA模型的擬合準確度與預測率（圖2～4）。

24生物標志物篩查通過偏最小二乘判別分析方法（PLSDA）進行分析，選擇VIP>1的潛在標志物在HMDB，metlin，KEGG數據庫中鑒別。其中，共初步篩選出11個潛在的生物標志物（表2）。在篩選得到的潛在生物標志物中，1和7為溶血磷脂酰乙醇胺類物質，2為磷酯類物質，3為神經節苷脂類物質，4，5，6，8，11為溶血卵磷脂類物質，9為磷脂酰絲氨酸類物質，10為脫氧膽酸類物質。其中，治療藥物姜黃素和鹽酸文拉法辛通過上調或下調CUMS大鼠體內生理水平出現異常的生物標志物，使之恢復至正常水平或處于向正常水平的恢復過程中。

25生物通路分析將所篩選得到的潛在的生物標志物輸入至Metabo Analyst 30數據庫中進行通路分析，結果顯示這些潛在的生物標志物共涉及到7條通路，分別是甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、α亞油酸代謝、醚脂類代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯互變、淀粉和蔗糖代謝和花生四烯酸代謝（圖5）。

3討論

抑郁癥是1種情志障礙性疾病，嚴重危害身體健康。究其發病機制目前尚未十分明確，臨床中針對于抑郁癥的診斷也存在一定的困難[12]。現代科學研究中有使用代謝組學的技術手段探討抑郁癥的發病機理以及治療靶點，通過分析抑郁癥機體內的小分子代謝物含量水平的變化，篩選出具有一定診斷價值的生物標志物，進而作為臨床中用于診斷抑郁癥的潛在金標準[13]。而姜黃素作為經典方劑逍遙散中獨特味藥姜黃的主要作用成分之一，目前已有大量的研究文獻針對其抗抑郁功效進行了報道，然而其確切的發生作用機制也未十分明確，尤其是姜黃素發揮抗抑郁作用過程中單個靶點或多個靶點，以及通過影響何種代謝通路發揮功效等焦點，需要我們進一步的研究證實[14]。因此，本文以陽性藥物文拉法辛作為對照藥，觀察姜黃素作用于CUMS模型抑郁癥大鼠中的作用，并篩選與姜黃素產生作用相關的潛在生物標志物，進而分析這些生物標志物所涉及到的一系列代謝通路。

通過PCA和PLSDS的代謝組學數據分析手段，分析結果顯示：姜黃素組與文拉法辛組均表現出向正常大鼠恢復中的趨勢，而且姜黃素組大鼠尤為明顯。結合兩組在抑郁癥相關指標的變化水平，可以認為姜黃素和文拉法辛均具有一定的抗抑郁功效，且在某種程度中，姜黃素的作用水平稍強于文拉法辛，這在PCA和PLSDA的分布圖中可以清晰地展現出來。當然這種現象也會受到不同藥物的給藥濃度設定以及給藥時間周期所限，但不可否定的是，姜黃素的抗抑郁作用不弱于陽性藥物文拉法辛。

再者，通過結合多元統計VIP值和單因素方差分析的統計學指標，選擇VIP>1以及P<005的變量作為潛在的生物標志物在相關數據庫中進行鑒定。最終篩選出11個生物標志物，這些標志物與姜黃素發揮抗抑郁功效的過程密切相關。其中，涉及到磷脂類、脂質類、膽酸類以及神經節苷脂類等，這些物質作為體內的小分子代謝物，在細胞合成、膽酸代謝以及神經因子調節方面發揮著重要的作用[15]。

同時，在這些已鑒定生物標志物的基礎上，應用Metabo Analyst 30開放性數據庫進行代謝通路分析，結果顯示按照相關性排序，甘油磷脂代謝和亞油酸代謝排在前面；按照影響程度排序，戊糖和葡萄糖醛酸酯互變、醚脂類代謝和甘油磷脂代謝排在前面。在中醫上[16]，歷代醫家多認為抑郁癥之病因在于情志不舒、氣機郁滯，導致氣血不和、陰虛火旺和心神失養；現代醫學者對于抑郁癥的認識也日益深入，可能涉及到腦、肝、膽、心、脾、腎等體內多個器官和系統，不能一概而論。因此，姜黃素發揮抗抑郁的功效很有可能是通過作用于體內多條生理通道而實現，并不是單一的靶點，但限于當前技術手段以及科學認知水平，后續的深入探索需要有志者攜手實現。

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[責任編輯張燕]endprint