調心方對APP/PS1雙轉基因AD小鼠空間學習記憶能力和海馬突觸傳遞長時程增強的影響

王曉雯++鄧海燕++王健++徐穎

摘要：目的 觀察調心方對APP/PS1雙轉基因阿爾茨海默病（AD）小鼠空間學習記憶能力和海馬突觸傳遞長時程增強（LTP）的影響，探討其作用機制。方法 將54只3月齡APP/PS1雙轉基因AD小鼠隨機分為模型組、調心方組和陽性藥組，以同月齡同性別18只C57BL/6J野生小鼠作為正常組，各給藥組給予相應藥物灌胃。給藥12周后，進行Morris水迷宮行為學檢測和離體電生理記錄。結果 Morris水迷宮測試結果顯示，定位航行實驗與模型組比較，調心方組逃避潛伏期時間明顯縮短（P<0.01）；空間探索實驗與模型組比較，調心方組小鼠穿越原平臺所在象限次數和在原平臺所在象限停留時間明顯增加（P<0.05，P<0.01）。在離體海馬電生理誘導中，與模型組比較，調心方組海馬興奮性突觸后電位斜率明顯增強（P<0.01），海馬雙脈沖易化無明顯差異（P>0.05）。結論 調心方可有效改善APP/PS1雙轉基因AD小鼠空間學習記憶能力和神經突觸可塑性，具有認知保護作用。

關鍵詞：調心方；Morris水迷宮；海馬突觸傳遞長時程增強；阿爾茨海默病；學習記憶能力；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.010

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）10-0040-04

Effects of Tiaoxin Formula on Spatial Learning and Memory Ability and LTP in Hippocampus of APP/PS1 Double Transgenic Mice with Alzheimer Disease WANG Xiao-wen， DENG Hai-yan， WANG Jian， XU Ying （Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Tiaoxin Formula on spatial learning and memory ability and long-term potentation （LTP） in the hippocampus of APP/PS1 transgenic mice with Alzheimer disease； To discuss its mechanism of action. Methods Totally 54 three-month-old APP/PS1 transgenic mice were randomly divided into model control group， Tiaoxin Formula group and positive control group， with 18 mice in each group. Another 18 three-month-old C57BL/6J wild mice were chosen as normal control group. All administration groups receive relevant medicine. 12 weeks later， Morris water maze test was used to test behavior and in vitro electrophysiology record. Results The Morris water maze test showed that in place navigation test， compared with the model control group， escape latency time in Tiaoxin Formula group was significantly reduced （P<0.01）. In the space experiments， compared with the model control group， the number of crossing the platform quadrant and the time staying at the platform quadrant in Tiaoxin Formula group were significantly increased （P<0.05， P<0.01）. In vitro hippocampal electrophysiological induction， compared with the model control group， fEPSP slope in the hippocampus in Tiaoxin Formula group were significantly increased （P<0.01）， the PPF had no significant difference （P>0.05）. Conclusion Tiaoxin Formula can improve the spatial learning and memory ability and LTP of APP/PS1 transgenic mice with Alzheimer disease， thus can realize cognitive protection effects.

Key words： Tiaoxin Formula； Morris water maze； LTP in hippocampus； Alzheimer disease； learning and memory ability； miceendprint

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是常見

基金項目：上海市自然科學基金（13ZR1439700）

通訊作者：王健，E-mail：wangjiantcm@126.com；徐穎，E-mail：ying6122003@aliyun.com

于老年人群的一種不可逆轉的中樞神經退行性疾病，是老年癡呆最常見的類型。AD早期癥狀主要有漸進性記憶的減退、認知功能下降等，后期常出現抑郁、焦慮、幻覺等異常精神癥狀，導致患者生活能力下降及社會參與度降低。AD屬中醫學“呆證”“癲證”“郁證”等范疇，臨床上，調心方對輕度AD患者療效較好，能有效改善輕中度AD患者的認知功能[1]。本實驗通過Morris水迷宮和海馬突觸傳遞長時程增強（long-term potentation，LTP）指標的變化，觀察調心方對APP/PS1雙轉基因AD小鼠學習記憶能力的影響。

1 實驗材料

1.1 動物

APP/PS1雙轉基因AD雄性小鼠54只，3月齡，體質量（25.22±1.71）g；C57BL/6J野生雄性小鼠18只，3月齡，體質量（30.49±1.59）g，南京大學模式動物研究所，品系編號D000268。飼養于上海中醫藥大學SPF級實驗動物中心。

1.2 藥物

調心方（黨參2.25 g，桂枝0.42 g，石菖蒲0.83 g，遠志0.38 g，龍骨0.5 g，甘草0.83 g，白芍0.5 g），配方顆粒為江陰天江藥業有限公司生產，使用前用蒸餾水充分溶解、混勻；鹽酸多奈哌齊片，5 mg/片，江蘇豪森藥業股份有限公司，批號20150212，使用前粉碎，用蒸餾水溶解。

1.3 主要試劑和儀器

2.5%戊二醛、4%多聚甲醛、20%水合氯醛、人工腦脊液（ACSF），上海青陽生物科技有限公司；Morris視頻分析和跟蹤系統（Netherlands），冰凍切片機（Thermo scientific）。

2 實驗方法

2.1 分組和給藥

54只實驗小鼠隨機分為模型組、調心方組和陽性藥組，每組18只，同時以同月齡同性別18只C57BL/6J野生小鼠為正常組。調心方組給予1.485 g/kg調心方灌胃，陽性藥組給予0.083 mg/kg鹽酸多奈哌齊灌胃，正常組和模型組予等量生理鹽水灌胃。給藥體積為10 mL/kg，每日1次，連續12周。12周后各組小鼠進行Morris水迷宮行為學檢測和離體海馬電生理誘導。灌胃過程中死亡13只，其中模型組6只、調心方組3只、陽性藥組2只、正常組2只，余全部進行水迷宮行為學測試，每日均保持飲食正常。

2.2 Morris水迷宮行為學檢測

Morris水迷宮包括定位航行實驗和空間探索實驗。定位航行實驗：持續5 d，記錄每只小鼠60 s內找到平臺時間。第2象限中放入一個低于水面1 cm的平臺，小鼠面向池壁從2個落水點（第3、4象限）以半隨機的方式放入水池中，小鼠找到平臺并在平臺上保持5 s后終止，記錄為逃避潛伏期，未在60 s內找到平臺的，記錄為60 s。對未在60 s內找到平臺的小鼠，用小木棒引導小鼠找到平臺，并讓小鼠在平臺上待30 s。小鼠從水中取出后，用毛巾將其擦干，以防小鼠受涼，影響實驗結果。休息10 min后，進行另一個象限的訓練。每日1次，每次2個象限。空間探索實驗：定位實驗結束后開始，為期1 d。記錄每只小鼠60 s內第1次到達原平臺所在象限的時間和穿越原平臺所在象限的次數。空間探索實驗開始時，將原平臺撤掉，其余保持不變。每組小鼠從同一個入水點放入池中。休息10 min，再做另一個象限。

2.3 離體海馬突觸傳遞長時程增強電生理記錄

2.3.1 腦片制備 行為學測試結束后，各組隨機選取5只小鼠進行實驗，20%水合氯醛麻醉后快速斷頭，切開頭皮去除顱骨和硬腦膜，迅速取出全腦置于用95%O2和5%CO2混合氣飽和冰浴的ACSF中。切取一正方形的瓊脂塊固定于托盤上。分離左右腦半球后，置于另一預備好的氧飽和冰溫ACSF燒杯中。用腦膜剝離器分離出海馬組織。用膠水將海馬腦組織塊固定于瓊脂塊。用振動切片機橫向切取400 μm腦片，將腦片放在孵育槽中溫室（34 ℃）30 min，然后放在室溫（25±1）℃中2～8 h，其中不斷充以混合氣，保證ACSF混處于氧飽和狀態。

2.3.2 離體海馬突觸傳遞長時程增強誘導 用巴斯德吸管將腦片移入記錄槽中心，置于顯微鏡下，以3 mL/min的速度持續灌流氧飽和ACSF，鏡下確定海馬CA1區。刺激電極是一個雙極電極，用突觸700 B作為刺激器，ACSF充滿玻璃吸管，電阻1～5 MΩ。將刺激電極放在shaffer纖維，記錄電極放在CA1區的輻射層。測試刺激包括單相100-μs恒電流脈沖，刺激電極每隔30 s給1個刺激（頻率0.033 Hz，波寬100-μs。通過測量興奮性突觸后電位（fEPSP）斜率來決定突觸傳遞強度。每給1個刺激記錄1個fEPSP，刺激強度由小到大，觀察記錄fEPSP幅值。此時選用fEPSP最大值的25%剌激強度為實驗用刺激強度，記錄30 min fEPSP作為基線。然后予高頻串刺激（HFS，各50個脈沖刺激，100 Hz，間隔10 s，2串100 Hz）誘導LTP，高頻時刺激強度與基線記錄時相同，在強直刺激后0～60 min的平均值決定了LTP的水平。

3 統計學方法

采用SPSS21.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，Morris水迷宮逃避潛伏期采用多組重復測量設計資料的方差分析。空間探索實驗和海馬fEPSP斜率和雙脈沖（PPF）比值變化數據采用方差分析，組間比較采用LSD法。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果endprint

4.1 調心方對APP/PS1雙轉基因小鼠空間學習記憶能力的影響

Morris水迷宮測試結果：定位航行實驗模型組小鼠逃避潛伏期時間較正常組明顯延長（P<0.01），與模型組比較，調心方組和陽性藥組小鼠逃避潛伏期時間明顯縮短（P<0.01），見表1。在空間探索實驗中，從第3象限入水點的模型組小鼠穿越原平臺所在象限的次數和在原平臺所在象限停留的時間較正常組明顯減少（P<0.01），與模型組比較，調心方組和陽性藥組小鼠穿越原平臺所在象限的次數和在原平臺所在象限停留的時間明顯增加（P<0.05，P<0.01），見表2。在空間探索實驗游泳軌跡圖中，第2象限黑點為原平臺所在位置。與正常組比較，模型組小鼠繞著池壁打轉，且經過原平臺所在象限的次數減少；與模型組比較，調心方組小鼠繞著池心來回游動，與原平臺所在的位置更近，且經過原平臺所在象限的次數明顯增加，見圖1。

4.2 調心方對APP/PS1雙轉基因小鼠海馬突觸傳遞長時程增強的影響

用離體海馬腦片誘導分別記錄各組海馬CA1區錐體細胞層LTP的改變。前30 min基本刺激條件下，其基礎fEPSP曲線保持穩定。各組高頻強直刺激后，LTP誘發成功并持續記錄60 min，在50～60 min LTP斜率趨于穩定。在后10 min內模型組fEPSP曲線增強幅度明顯低于正常組，調心方組fEPSP曲線增強幅度明顯高于模型組。與正常組比較，模型組小鼠fEPSP斜率明顯減少（P<0.01）；與模型組比較，調心方組和陽性藥組小鼠fEPSP斜率顯著增強（P<0.01），見表3。在離體腦片電生理誘導中測試PPF指標，用雙脈沖比值（PPR）表示突觸反應變化的方向和大小，PPR>1為雙脈沖易化。在刺激間隔50、100、200、250 ms時，各組小鼠PPR均無明顯差異（P>0.05），說明各組小鼠PPF易化無明顯差異。刺激間隔250 ms時，模型組小鼠PPR與正常組比較無明顯差異（P>0.05），調心方組小鼠PPR與模型組比較無明顯差異（P>0.05），見表4。

5 討論

認知功能包括對外在刺激的接受能力、學習與記憶能力、信息反饋處理能力、表達能力及各種心理活動。AD患者認知功能障礙最明顯的表現是記憶力減退，早期主要為近記憶減退，逐漸出現遠記憶障礙。《素問·靈蘭秘典論篇》有“心者，君主之官也，神明出焉”。中醫學認為，心為五臟六腑之大主，心氣不足，氣不生神。AD患者神情呆滯、表情淡漠、反應遲鈍、少言懶動等是心氣不足、痰滯瘀阻而致神明失司、機竅不利，故用調心方調心益氣、振奮心陽、化痰開竅。調心方由黨參、桂枝、石菖蒲、遠志等組成，黨參補元氣，桂枝通血脈，石菖蒲安神，遠志豁痰。

Morris水迷宮是評估動物模型學習記憶能力的一種重要且公認的方法[2]。有研究報道，Morris水迷宮行為學測試顯示，3月齡APP/PS1雙轉基因AD小鼠空間搜索實驗結果與同月齡正常小鼠有差異[3]。本研究Morris水迷宮實驗結果顯示，模型組與正常組比較，其逃避潛伏期時間延長、穿越原平臺次數減少及在原平臺停留時間縮短，與文獻結果一致。通過調心方治療后，APP/PS1雙轉基因小鼠定位航行實驗逃避潛伏期時間明顯縮短、穿越原平臺所在象限次數增加及在原平臺所在象限停留時間增加。表明訓練后學習記憶能力明顯提高，進一步證實調心方能效改善APP/PS1雙轉基因AD小鼠的認知能力。

神經突觸是中樞神經系統學習和記憶的基礎。LTP一直被認為是學習與記憶的神經基礎之一，是研究學習記憶的理想電生理模型[4]。而海馬是神經系統參與學習記憶的重要腦區，大量樹突棘缺失現象發生在尸檢后AD患者腦內和各種轉基因AD小鼠腦內[5-6]。LTP受抑制的原因是由于大量樹突棘的缺失，導致突觸之間的信息傳遞受到阻礙，學習記憶能力下降。研究發現，LTP得到改善后，其認知和記憶功能均得到恢復[7-8]。

在離體腦片實驗中，各組小鼠在HFS前30 min內給予刺激時未影響基礎fEPSP，但當給予HFS后，模型組海馬fEPSP斜率明顯受到抑制。調心方組APP/PS1雙轉基因AD小鼠海馬fEPSP斜率明顯增加，表明經調心方治療能提高APP/PS1雙轉基因小鼠LTP水平，改善其突觸可塑性，小鼠學習和記憶的功能得到改善。實驗測試PPF的目的是用PPF改變來觀察突觸前神經遞質釋放的改變，釋放的神經遞質活性高，學習記憶能力也會提高。本研究結果顯示，模型組小鼠fEPSP斜率明顯降低，調心方組小鼠fEPSP斜率明顯升高，進一步證實調心方能有效改善APP/PS1雙轉基因AD小鼠的LTP水平。模型組小鼠PPR與正常組比較無明顯差異，提示APP/PS1雙轉基因AD小鼠海馬LTP的損傷與突觸前神經遞質釋放無關。

Morris水迷宮和海馬LTP記錄都是研究動物學習記憶能力的經典手段，有研究發現二者的實驗研究結果有很好的一致性[9]。本實驗通過Morris水迷宮行為學結合離體場電位記錄，發現同一動物空間學習記憶能力的改變與突觸可塑性變化的結果基本一致，表明其學習記憶能力損害程度與LTP抑制程度可能是一致的。在本研究結果中，調心方治療后，小鼠在定位航行實驗中逃避潛伏期時間明顯縮短；在空間探索實驗中，穿越原平臺位置次數及在原平臺位置停留時間增加，從行為學角度表明調心方可有效改善APP/PS1雙轉基因AD小鼠的認知能力。通過調心方治療后，小鼠海馬fEPSP斜率升高，從電生理的角度闡明了調心方可改善APP/PS1雙轉基因AD小鼠的認知能力。

參考文獻：

[1] 俞璐，林水淼，周如倩，等.中醫辨證治療輕中度阿爾茨海默病的隨機對照試驗[J].中西醫結合學報，2012，10（7）：766-776.

[2] CHARLES V， MICHAEL T. Morris water maze：procedures for accessing spatial and related forms of learning and memory[J]. J Neurol， 2006，253：1542-1551.endprint

[3] 宗園媛，王曉映，王海林，等.APP/PS1雙轉基因阿爾茨海默病小鼠模型的老年斑及行為學動態分析[J].中國比較醫學雜志，2008，18（9）：8-12.

[4] KORTE M， HERRMANH U， ZHANG X， et al. The role of APP and APLP for synaptic transmission， plasticity and network function：lessons from genetic mouse models[J]. Exp Brain Res，2012，217（3/4）：435-440.

[5] TAKASHIMA S， IESHIMA A. Dementia and the down syndrome[J]. Brain Develop，1989，11：131-133.

[6] MOOLMAN D L， VITOLO O V. Dendrite and dendritic spine alterations in Alzheimer models[J]. J Neurocytol，2004，33：377-387.

[7] GONG B. Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory[J]. Cell， 2006，126：775-788.

[8] DONNA L， SMIT H. Reversal of long-term dendritic spine alteration in Alzheimer disease models[J]. PNAS，2009，39：16877-16882.

[9] SCHMID A W， LYNCH M A， HERRON C E. The effects of IL-1 receptor antagonist on beta amyloid mediated depression of LTP in the rat CA1 in vivo[J]. Hippocampus，2009，19（7）：670-676.

（收稿日期：2016-12-19）

（修回日期：2017-02-15；編輯：華強）endprint