北美H3N8亞型犬流感病毒雙重RT-PCR檢測方法的建立

宋晶偉 ， 王晨曦 ， 張谞霄 ， 孫洪磊 ， 彭金山 ， 蒲 娟

(1. 中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 北京市農業局 ， 北京 西城 100029)

北美H3N8亞型犬流感病毒雙重RT-PCR檢測方法的建立

宋晶偉1， 王晨曦1， 張谞霄1， 孫洪磊1， 彭金山2， 蒲 娟1

(1. 中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 北京市農業局 ， 北京 西城 100029)

H3N8亞型犬流感病毒在北美地區廣泛流行，并引發犬的呼吸道疾病，但目前中國尚未有犬感染H3N8亞型犬流感病毒的報道。隨著近幾年寵物貿易的繁盛，犬流感流行區域可能逐漸擴大，增加北美H3N8亞型犬流感病毒傳入中國的可能。因此，需要建立一種針對北美H3N8亞型犬流感病毒的快速檢測方法。本研究中，我們建立了針對北美H3N8亞型犬流感病毒的HA和NA基因片段的雙重RT-PCR檢測方法。該方法可特異性地檢出北美H3N8亞型犬流感病毒HA和NA基因，而未檢出H3N2亞型犬流感病毒及其他亞型流感病毒、犬瘟熱病毒、傳染性肝炎病毒、犬細小病病毒、副流感病毒；檢測方法靈敏度可達0.1 pg/μL。利用該方法對臨床樣本進行了檢測，證實該檢測方法可靠。該檢測方法的建立為監測北美H3N8亞型犬流感病毒提供了良好的技術支撐，可用于外來犬流感病毒的檢測。

H3N8 ； 犬流感病毒 ； 雙重RT-PCR

流感病毒可以引起家禽和人、馬、豬等哺乳動物的急性呼吸道疾病。2004年，美國弗羅里達州的灰獵犬暴發了急性呼吸道疾病，研究人員從死亡病例中分離到H3N8亞型流感病毒[1]。隨后在狗舍、寵物醫院的其他品種犬中也分離到了H3N8病毒，且與早期在灰獵犬中分離到的病毒同源性接近。多數病犬出現了上呼吸道病毒感染的臨床癥狀，包括咳嗽、流鼻涕、低熱。一些死亡病例出現了肺部、胸腔膈膜、胸膜腔廣泛性出血，組織病理學檢查出現氣管炎、支氣管炎、細支氣管炎及化膿性支氣管肺炎，暗示了H3N8亞型流感病毒能夠有效地感染犬[2]。2008年，美國有25個州出現了寵物犬感染病例；2009年，美國加利福尼亞州南部的一個狗舍暴發H3N8犬流感疫情，有64只狗出現流感癥狀；截止2009年5月，有30個州發現犬流感的存在，發病場所多為寵物店和犬場等[3]。

犬作為人類的伴侶，人與犬的親密接觸增加犬作為中間宿主將病毒傳播給人類的可能性[4]。因此，犬流感病毒不僅影響犬的健康，也對公共衛生安全構成了嚴重威脅。H3N8和H3N2是犬流感病毒的主要流行亞型，H3N8犬流感主要流行區域是美國，H3N2犬流感主要在亞洲地區流行。然而，隨著寵物市場的繁盛，各亞型犬流感流行區域逐漸擴大。2015年美國暴發亞洲H3N2病毒。Pei Zhou等人對2015年5月至2015年11月份自廣州、上海、北京、深圳分離的600份犬血清進行血清學檢測發現，5份(0.83%)對H3N8亞型流感病毒(H3N8 馬流感病毒或H3N8禽流感病毒)檢測為陽性[5]。這強調加強對犬流感病毒檢測的必要性，因此建立一種特異性好、靈敏度高、快速的檢測方法，對于H3N8亞型犬流感病毒預防和控制十分重要。本研究我們建立了針對北美H3N8亞型犬流感病毒的雙重RT-PCR檢測方法，并對該方法的特異性和靈敏度進行了優化和評價，該方法的建立對監測北美源H3N8亞型犬流感病毒入境傳播具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒 北美H3N8亞型犬流感病毒A/canine/lowa/13628/2005(H3N8) HA、NA基因質粒，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.1.2 病毒 A/canine/Beijing/364/2009(H3N2)、A/chicken/Tangshan/2/2015(H9N2)、A/California/04/2009(H1N1)、犬瘟熱病毒、傳染性肝炎病毒、犬細小病病毒、副流感病毒由本實驗室保存。

1.1.3 試劑 組織/細胞基因組DNA快速提取試劑盒由Aidlab公司生產；Roche(羅氏)病毒RNA提取試劑盒由Roche公司生產；反轉錄試劑盒由Promega公司生產；反轉錄流感特異性引物為Uni 12 ：5′-AGCAAAAGCAGG-3′，由北京擎科新業生物技術有限公司合成；2×TaqMix、Trans DNA MarkerⅠ由北京全式金生物技術有限公司生產。

1.1.4 測序引物 A型流感病毒HA和NA基因通用引物[6]，由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

1.1.5 臨床樣品 2015-2016年自中國農業大學動物醫院采集52份犬鼻咽拭子臨床樣品，置于-80 ℃保存。

1.2 引物設計與合成 利用MEGA 6.0對GenBank中H3N8亞型犬流感病毒HA、NA基因序列進行比對，以北美H3N8亞型犬流感病毒A/canine/lowa/13628/2005(H3N8)的血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)基因為參考序列，利用Primer Premier 5.0軟件針對H3N8亞型犬流感病毒HA和NA基因保守區分別設計合成特異性引物。引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

1.3 總RNA提取及反轉錄、總DNA提取 按照羅氏病毒RNA提取試劑盒說明書分別提取H3N2亞型犬流感病毒、H9N2亞型禽流感病毒、H1N1亞型禽流感病毒、犬瘟熱病毒、副流感病毒總RNA，并用引物Uni 12進行反轉錄形成cDNA；按照組織/細胞基因組DNA快速提取試劑盒說明書提取傳染性肝炎病毒、犬細小病病毒總DNA；產物做PCR擴增。

1.4 反應條件的優化 通過對HA∶NA引物的摩爾比及反應參數(包括退火溫度、退火時間、延伸時間、循環次數)進行優化，具體如下：(1)HA∶NA引物摩爾比(2∶1,3∶2,1∶1,2∶3,1∶2)；(2)退火溫度(50 ℃,53 ℃,56 ℃,59 ℃,62 ℃)；(3)退火時間(30 s,45 s)；(4)延伸時間(30 s,45 s,60 s,75 s,90 s)；(5)循環次數(27,30,33,36,39個)，篩選出雙重RT-PCR最佳反應體系及反應條件。

1.5 特異性試驗 用建立的檢測方法分別對北美H3N8犬流感HA和NA質粒混合物、H3N2犬流感病毒、H1N1禽流感病毒、H9N2禽流感病毒、犬瘟熱病毒、副流感病毒、傳染性肝炎病毒、犬細小病病毒進行檢測，并設置陰性對照，以評價該方法的特異性。

1.6 敏感性試驗 將A/canine/lowa/13628/2005(H3N8) HA、NA質粒分別稀釋至初濃度為1ng/μL，再依次進行10倍倍比稀釋，作為模板進行 RT-PCR 擴增，評價該方法的敏感性。

1.7 臨床樣本檢測

1.7.1 雙重RT-PCR檢測方法應用本研究建立的雙重RT-PCR檢測方法，對2015-2016年采集自中國農業大學動物醫院52份犬鼻咽拭子臨床樣品進行檢測，對雙重RT-PCR檢測為陽性的樣品，運用HA、NA基因通用引物進行全長擴增并克隆測序，驗證雙重RT-PCR所得結果。

1.7.2 傳統檢測方法將相同的52份臨床樣品，用PBS處理，4 ℃過夜，用傳統雞胚接種的方法進行病原分離，通過血凝試驗鑒定是否分離到流感病毒，收集有血凝性的雞胚尿囊液，提取RNA，運用HA、NA基因通用引物進行全長擴增并克隆測序，并與雙重RT-PCR檢測的結果進行比較。

2 結果與分析

2.1 引物設計與篩選 針對H3N8亞型犬流感病毒HA和NA基因保守區域分別設計5對引物。將引物分別組合進行PCR擴增，根據條帶特異性和靈敏度，篩選出1組引物。HA引物序列：F:5′-TTAGTTCAGAGCATTTCAATGGGGA-3′；R:5′-TGTTTATCATTAGGATATCTCCAGG-3′；NA引物序列：F:5′-CAGTTGGAGTCACAGGGCCCGACAA-3′；R:5′-GTACATGAGCCTGTGAATTGACTAT-3′，擴增出目的片段大小分別約600 bp、400 bp。

2.2 RT-PCR檢測方法的優化 通過對北美H3N8亞型犬流感病毒雙重RT-PCR檢測方法進行優化，最終確定北美H3N8亞型犬流感病毒HA∶NA引物的最佳摩爾比為2∶1，最佳退火溫度、退火時間、延伸時間、循環次數分別為59 ℃、30 s、45 s、30個循環。

2.3 特異性評價 特異性試驗結果表明，只有H3N8亞型犬流感病毒HA和NA質粒混合物擴增出2條與試驗設計大小相符的條帶(600 bp和400 bp)，其他毒株均未見擴增條帶(圖1)。以上結果與預期結果相一致，說明所建立的雙重RT-PCR檢測方法具有良好的特異性。

圖1 北美H3N8亞型犬流感病毒HA和NA基因雙重RT-PCR檢測方法的特異性評價

2.4 敏感性評價 將北美H3N8亞型犬流感病毒HA和NA質粒分別稀釋至初濃度為1ng/μL，再依次進行10倍倍比稀釋，作為模板進行RT-PCR擴增，評價該方法的敏感性。如圖2所示，HA和NA引物對組合能檢測出的最低質粒濃度為0.1 pg/μL。

2.5 臨床樣本檢測結果 用本試驗建立的雙重RT-PCR檢測方法，對52份犬鼻咽拭子臨床樣品進行檢測，均無陽性條帶；通過傳統雞胚接種的方法進行病原分離，尿囊液均無血凝性，未分離到流感病毒。

圖2 北美H3N8亞型犬流感病毒HA和NA基因雙重RT-PCR檢測方法的敏感性評價

本試驗建立的檢測方法對臨床樣品檢測結果與傳統檢測方法一致，未檢測到北美H3N8亞型犬流感病毒。

3 討論

近年來，甲型流感病毒感染犬的報道不斷出現，包括H3N8、H3N2、H5N1、H1N1亞型流感病毒，其中，美國、英國、澳大利亞等國家均有H3N8犬流感疫情的報道[7]，但目前，中國尚未有犬感染H3N8亞型犬流感病毒的報道。隨著近幾年寵物市場擴展，H3N8亞型犬流感病毒可能不再具有地方流行性，增加北美H3N8亞型犬流感病毒傳入中國的可能，因此，需要建立一種針對北美H3N8亞型犬流感病毒的快速檢測方法。

在美國首次報道H3N8亞型犬流感病毒時，血凝抑制試驗被用來診斷病毒感染[8]，但是血凝抑制試驗涉及到病原的分離，操作相對繁瑣，且各亞型之間容易相互影響，敏感性較低，耗時耗力。目前，單重RT-PCR和real-time RT-PCR等診斷方法被用來診斷H3N8亞型犬流感病毒感染[9]。本研究所建立的針對北美H3N8亞型犬流感病毒HA和NA基因的雙重RT-PCR檢測方法，是在普通RT-PCR基礎上，在同一PCR反應體系中加入2對引物進行擴增，可同時確定H3和N8亞型，節約了檢測試劑，簡化了反應程序，具有省時省力的優點，而且降低診斷成本。

本研究針對H3N8亞型犬流感病毒HA、NA基因保守區域分別設計了2對特異性引物，成功建立了H3N8亞型犬流感病毒雙重RT-PCR檢測方法，并對反應條件進行了優化。該方法能檢測出的最低質粒濃度為0.1 pg/μL，具有良好的敏感性，且應用該引物對H3N2亞型犬流感病毒、H1N1禽流感病毒、H9N2禽流感病毒、犬瘟熱病毒、傳染性肝炎病毒、犬細小病病毒、副流感病毒，在相同的反應條件下未擴增出任何片段，具有較好的特異性。用所建立的檢測方法對52份犬鼻咽拭子臨床樣品進行檢測，并與病毒分離、血清學試驗檢測結果比較，證實該方法可靠。

本文所建立的針對北美H3N8亞型犬流感病毒的雙重RT-PCR檢測方法特異性強、敏感性高，為該病的流行病學調查與診斷提供一種方法。

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DuplexRT-PCRassayfordetectionofNorthAmericanH3N8subtypecanineinfluenzavirus

SONG Jing-wei1, WANG Chen-xi1, ZHANG Xu-xiao1, SUN Hong-lei1, PENG Jin-shan2, PU Juan1

(1.College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193，China;2. BeijingBureau of Agriculture, Beijing 100029,China)

H3N8 subtype canine influenza virus has spread through North America and resulted in respiratory diseases. However , at present the case of dogs infected with the virus has not been reported in China. As the pet trade has flourished in recent years, it also increases the possibility of transmitting the virus into our country. Therefore, it is necessary to establish a specific and sensitive method for the detection of the H3N8 subtype canine influenza virus. In this study, a duplex RT-PCR (dRT-PCR) was established. Two primer sets targeting the hemagglutinin (HA) gene and the neuraminidase (NA) gene of North American H3N8 subtype canine influenza virus were designed , respectively were designed. The amplification by the duplex RT-PCR assay was positive for North American H3N8 subtype canine influenza virus but negative for H3N2 subtype canine influenza virus, other subtypes (H1N1 and H9N2) of influenza viruses, canine distemper virus, infectious canine hepatitis virus, canine parvovirus and parainfluenza virus. The sensitivity was 0.1 pg/μL. The detection of clinical samples was carried out, and proved that this method was feasible. This detection method will provide effective technical support for monitoring the North American H3N8 subtype canine influenza virus and can be used in the surveillance of exotic diseases.

H3N8 ; canine influenza virus ; duplex RT-PCR

PU Juan

S852.65+5

A

0529-6005(2017)08-0026-03

2016-11-02

“十二五”國家科技支撐項目(2013BAD12B01)

宋晶偉(1992-)，女，碩士生，從事流感病毒研究工作，E-mail：15600912168@163.com

蒲娟，E-mail：pujuan@cau.edu.cn