禾花鯉致病性嗜水氣單胞菌的分離鑒定、耐藥性及毒力基因檢測

鄧小紅，梁靜真，黎姍梅，呂小麗，韋慕蘭，韓書煜，蒙蘭麗，黃 鈞*，蔣經運

(1.廣西水生動物病害診斷實驗室，廣西 南寧 530005；2.廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530004；3.廣西水產技術推廣總站，廣西 南寧 530022；4.陸川縣水產養殖技術推廣站，廣西 陸川 537700；5.全州縣水產技術推廣站，廣西 全州 541500；6.都安瑤族自治縣水產技術推廣站，廣西 都安 530700；7.田東縣水產技術推廣站，廣西 田東 531500)

禾花鯉致病性嗜水氣單胞菌的分離鑒定、耐藥性及毒力基因檢測

鄧小紅1，5，梁靜真1，2，黎姍梅3，呂小麗4，韋慕蘭6，韓書煜3，蒙蘭麗7，黃 鈞1，2*，蔣經運5

(1.廣西水生動物病害診斷實驗室，廣西 南寧 530005；2.廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530004；3.廣西水產技術推廣總站，廣西 南寧 530022；4.陸川縣水產養殖技術推廣站，廣西 陸川 537700；5.全州縣水產技術推廣站，廣西 全州 541500；6.都安瑤族自治縣水產技術推廣站，廣西 都安 530700；7.田東縣水產技術推廣站，廣西 田東 531500)

【目的】對廣西全州縣飛機坪魚種場患病禾花鯉進行病原菌的分離鑒定，并對其致病性、耐藥特性及6種毒力基因進行檢測，為細菌引起的禾花鯉疾病及防控技術研究提供理論參考。【方法】從患病禾花鯉的肝臟、心臟和腎臟等部位取樣分離細菌，人工感染確定菌株的致病性，API生化鑒定和16S rRNA分子鑒定相結合進行細菌鑒定，細菌的耐藥特性試驗為K-B紙片擴散法，毒力基因以PCR擴增法檢測。【結果】從患病禾花鯉中分離到2株致病力很強的病原菌株TH1和TH3，對健康禾花鯉的致死率均為100.00 %；經生化和分子鑒定，2株分離菌株均為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，與標準菌株AeromonashydrophilaATCC 7966(NR 118944)的親緣關系最近，同源相似度99.80 %；2株菌株對硫酸新霉素等5種藥物高度敏感，對青霉素G等4種藥物不敏感；TH1攜帶所檢測的hly、Aer、Alt、Act、ahal和ahp6種毒力基因，TH3只攜帶hly、Aer、Alt、Act、ahal5種基因。【結論】引起廣西全州縣飛機坪魚種場禾花鯉大批死亡的病原菌是嗜水氣單胞菌，2株菌株TH1和TH3的毒力基因型分別為hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+和hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-，對健康禾花鯉的致死率均為100.00 %，對硫酸新霉素等5種藥物高度敏感，對青霉素G等4種藥物不敏感。

禾花鯉；嗜水氣單胞菌；耐藥性；毒力基因

【研究意義】原產于廣西桂北地區的禾花鯉(Procyprismerus)是鯉(Cyprinuscarpio)的變種，體型短肥，個體重多在250 g以下，屬小型經濟魚類。禾花鯉因含肉率高、肌肉中富含人體所需的必需氨基酸，營養價值高[1]而深受消費者的喜愛，被列入廣西桂林市農產品的十大名牌行列，廣西全州縣也將其作為特種水產養殖品種大力發展。禾花鯉的稻田養殖在廣西桂北地區具有悠久歷史，養殖區域主要集中在興安、全州、灌陽、三江和融安等縣[2]，近年來，禾花鯉的稻田養殖規模不斷擴大，在養殖過程中的病害問題也越來越常見，尤其是細菌性疾病造成的損失有逐年增加的趨勢，在廣西全州縣各養殖場的禾花鯉經常出現暴發性死亡現象，造成損失嚴重，對當地禾花鯉養殖業已構成嚴重威脅，因此，研究患病禾花鯉的病原菌及其藥敏特性顯得尤為迫切和重要。【前人研究進展】有關鯉的細菌性疾病已有不少報道，主要有鯉魚的出血病、細菌性敗血癥、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)病、鰻利斯頓氏菌(Listonellaanguillarum)病、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)病和殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)病[3-10]，錦鯉的吉氏庫特菌(Kurthiagibsonii)病、潰瘍病和熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)病[11-13]，有色鯉魚的遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)[14]等。在禾花鯉中，由細菌引起的疾病目前僅見龍蘇等[15-16]報道的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)病和暴發性死亡征，而有關禾花鯉致病性嗜水氣單胞菌分離鑒定以及禾花鯉病原菌毒力基因型的研究報道鮮見。【本研究切入點】對引起廣西全州縣飛機坪魚種場禾花鯉大批死亡的病原菌嗜水氣單胞菌進行分離鑒定，研究患病禾花鯉的病原菌及其藥敏特性。【擬解決的關鍵問題】本試驗對廣西全州縣飛機坪魚種場患病禾花鯉進行了病原菌的分離鑒定，并對病原菌的致病性、耐藥特性以及hly、Aer、Alt、Act、ahal和ahp6種毒力基因進行檢測，以期為嗜水氣單胞菌引起的禾花鯉疾病及防控技術研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

禾花鯉病樣采自廣西全州縣飛機坪魚種場，個體重30.6～38.3 g。健康禾花鯉購自廣西大學農貿市場，體長約10 cm，個體重35 g左右，肉眼未見病癥，購回后先經15 d的檢疫暫養，在人工感染試驗前，隨機抽取5尾按常規進行病檢，并取每尾魚的心、肝、脾、腎、腦等組織進行細菌的分離接種，確認試驗魚健康。

API全自動細菌鑒定儀及相關試劑為法國梅里埃公司生產，培養基和細菌基因組 DNA提取試劑盒分別購自鄭州安圖生物工程股份有限公司和天根生化科技(北京)有限公司，TaqDNA 酶等PCR擴增試劑購自寶生物工程(大連)有限公司，瓊脂糖購自Invitrogen(美國)公司，PCR擴增的細菌通用引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 病魚的剖檢及細菌分離

在實驗室中對病魚進行常規剖檢，先后對體表、鰓和內臟器官的病癥進行肉眼觀察，對體表粘液、鰓組織和腸道內膜取樣鏡檢，進行寄生蟲檢查。

從病魚的心臟、肝臟等組織取樣進行細菌分離接種，37 ℃培養18～24 h，挑取優勢菌落純化后置4 ℃保存備用。

1.3 無菌濾液的人工感染

無菌濾液是參照黃艷華等[17]和黃鈞等[18]的方法，取病魚的內臟器官勻漿，10 ℃條件下高速離心0.5 h后取上清液，經微孔細菌濾器過濾后獲得，并以平板涂布培養法檢測其無菌性。將健康禾花鯉隨機分成30尾/組的試驗和對照2組，通過胸鰭基部腹腔注射分別注射無菌濾液和無菌生理鹽水(0.2 mL/尾)，注射后連續飼養觀察18 d。期間正常飼養管理，連續充氣增氧，每天上午和下午各1次對受試魚的發病及死亡等情況進行記錄。

1.4 分離菌株的人工感染

以無菌生理鹽水將經過3次復壯培養的備用菌株新鮮培養物制成菌懸液，菌懸液的細菌濃度以WGZ-2-XJ細菌濁度儀進行調整。按無菌濾液的人工感染方法進行第1次人工感染試驗，從第1次人工感染試驗中取發病癥狀與自然發病癥狀相似的瀕死個體分離細菌后，按同樣的方法再進行第2次人工感染試驗。試驗期間的日平均水溫為(25.5±1.3) ℃。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 菌株基本形態及溶血性觀察 革蘭氏染色觀察菌株的形態和染色特性，將分離菌株接種于兔血培養基上37 ℃培養24 h后觀察其溶血性。

1.5.2 生化鑒定 以API全自動細菌鑒定儀進行生化鑒定。

1.5.3 分子鑒定 按黃艷華等[17]和黃鈞等[18]的方法，將分離菌株在28 ℃震蕩(200 r/min)培養16 h后，配成濃度約0.5 MCF的菌懸液，經離心收集菌體，細菌DNA提取后-20 ℃保存備用。細菌16S rRNA基因PCR擴增引物為fD1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，rp2：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。反應體系(25 μl)及擴增條件除DNA模板調為2 μl和退火溫度調為58 ℃外，其余均按黃鈞等[18]的方法進行。PCR反應結束后以1.5 %瓊脂糖凝膠電泳法(100 V電壓下電泳35 min)進行鑒定，凝膠成像分析系統觀察，根據電泳條帶確定和記錄結果，PCR產物送華大生物技術有限公司進行測序。多重序列比對分析以CLUSTAL X軟件完成，系統發育樹以MEGA6.1軟件構建。

1.6 菌株的耐藥性試驗

K-B紙片擴散法，藥敏紙片從杭州天和微生物試劑有限公司購得，試驗及結果判定按黃鈞等[18]的方法進行。

1.7 菌株的毒力基因型檢測

先按黃艷華等[17]、黃鈞等[18]的方法提取細菌基因組DNA后于-20 ℃保存備用。各選1對特異性引物對菌株的毒力基因hly、Aer、Alt、Act、ahal和ahp進行PCR擴增，擴增引物序列、退火溫度、基因片段大小、目的基因的鑒定等均按黃艷華等[17]和黃鈞等[18]的方法進行。

2 結果與分析

2.1 病魚的主要癥狀及細菌分離結果

肉眼觀察到的自然發病禾花鯉主要癥狀為：體表發紅有大量粘液、無肉眼可見寄生蟲，腹部腫大，肛門發紅，鰓腫脹，鰓絲末端溶解，體腔中有大量腹水，膽囊腫大，脾臟腫大。對體表粘液、鰓組織和腸道內膜的鏡檢結果均未發現寄生蟲。從兩口發病池塘患病禾花鯉肝臟組織中共分離到2株β-溶血的優勢菌株TH1和TH3，均為革蘭氏陰性短桿菌，2株菌株在普通營養瓊脂培養基上的菌落形態為圓形，邊緣完整光滑，中央微隆起，白色或淡黃色，半透明，直徑1.25～2.06 mm。

2.2 人工感染試驗結果

涂布于普通營養瓊脂培養基上的無菌濾液經37 ℃培養24 h無菌落，將無菌濾液人工感染禾花鯉18 d后，試驗組、對照組的禾花鯉均無病癥出現，也無死亡現象。據此認為廣西全州縣飛機坪魚種場禾花鯉發病死亡由病毒引起的可能性不大。

2次菌懸液人工感染結果，TH1和TH3對禾花鯉均有很強的致病力，試驗組在注射菌懸液后8～24 h出現死亡，3～5 d為死亡高峰期，6～7 d全部死亡(表1)，試驗結束時對照組的成活率為100.00 %，且活動和攝食均正常，無肉眼可見的病癥。注射菌懸液后開始出現死亡的試驗魚發病癥狀不明顯，2 d后發病死亡的個體均出現鰓腫脹，鰓絲末端溶解，體表發紅粘液多，腹部膨大，肛門發紅，體腔中有大量腹水，膽囊和脾臟腫大等與自然發病魚很相似的癥狀。表明TH1和TH3菌株都是引起廣西全州縣飛機坪魚種場禾花鯉發病死亡的病原菌。

2.3 API生化鑒定結果

TH1、TH3均為氧化酶試驗陽性，在API生化試驗中，2株病原菌的硝酸鉀、色氨精、葡萄糖、精氨酸、七葉靈、明膠、對硝基-β-D甲基半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麥芽糖、葡萄糖酸鹽、癸酸、蘋果酸、檸檬酸和四甲基-對一苯二胺試驗呈陽性，脲素和苯乙酸試驗呈陰性；已二酸試驗TH1呈陰性，TH2呈陽性。API鑒定結果，2株病原菌均為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)。

表1 分離菌株的人工感染結果Table 1 Results of artificial infection of isolated strains

表2 病原菌株的藥敏試驗結果(抑菌圈直徑，mm)Table 2 Antibiotic sensitivity test results of the tested strains (Diameter of inhibition zone，mm)

2.4 分子鑒定結果

16S rRNA基因片段的PCR擴增和PCR產物的測序結果，病原菌TH1和TH3的16S rRNA基因序列長度均為1373 bp(圖1)，GenBank登錄號分別為KU143917和KT961634。將菌株的序列與Genbank中已有序列進行BLAST比對結果，TH1和TH3與嗜水氣單胞菌標準株AeromonashydrophilaATCC 7966(NR 118944)的親緣關系最近，同源相似度均為99.80 %。構建的系統發育樹見圖2。

2.5 菌株的耐藥特性

對2株病原菌都高度敏感的藥物有多粘菌素B、左氧氟沙星、頭孢他啶鈉、依諾沙星和硫酸新霉素5種，都不敏感的藥物有青霉素G、氨芐青霉素、氟苯尼考和磺胺對甲氧嘧啶4種。對其他藥物的敏感性在2株病原菌株之間存在較大差異(表2)。

2.6 毒力基因檢測結果

PCR擴增結果表明，病原菌TH1和TH3擴增到的毒力基因片段均與預期片段大小相符，檢測結果，2株菌株TH1和TH3的毒力基因型分別為hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+和hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-。

圖1 TH1和TH3的16S rRNA 基因PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification results of 16S rRNA genes of strain TH1 and TH3

3 討 論

引起廣西全州縣飛機坪魚種場大批禾花鯉發病死亡的病原菌是嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)，與眾多學者對鯉的細菌性疾病研究結果[5-9,11-14]不同，與龍蘇等[15-16]從患病禾花鯉中分離到病原菌也不一致。綜合前人和本試驗的研究結果可以看出，禾花鯉等多種鯉魚細菌性疾病的病原菌種類表現為多樣性，均可造成嚴重危害，尤其是嗜水氣單胞菌，是鯉魚養殖過程中危害特別嚴重的常見病原菌，一些如鰻利斯頓氏菌、肺炎克雷伯氏菌、吉氏庫特菌、熒光假單胞菌、簡達氣單胞菌和銅綠假單胞菌等是近年來在多種鯉魚中新發現的病原菌，應引起廣大魚病工作者和養殖人員的共同關注。

本試驗從患病禾花鯉中分離到的2株嗜水氣單胞菌TH1和TH3對禾花鯉的致死率均為100.00 %，與該菌對其他水生動物人工感染試驗的致死率結果[19-21,22-24]一致。另外，本試驗中，2株菌株雖然都是嗜水氣單胞菌，但在API鑒定中發現兩者的生化特性稍有不同，這一差異主要與2株菌株對已二酸的分解結果不同有關。

在本研究的藥敏試驗結果中，2株病原菌TH1、TH3對藥物的敏感性存在較大差異。都高度敏感的藥物只有5種，都不敏感的藥物有4種，對其他藥物的敏感性2株菌株之間存在較大差異(表2)。已知嗜水氣單胞菌因毒力基因型不同，其致病力也不同[23]，2株病原菌株TH1和TH3對藥物敏感性存在差異，是否與菌株所攜帶的耐藥基因不同有關，有待進行更深入的研究。很多情況下，防治由嗜水氣單胞菌等細菌引起的水生動物疾病常以含氯消毒劑作為外用藥[20]。

圖2 TH1和TH3的16S rRNA 基因序列系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of strain TH1 and TH3

據已有的檢測結果，黃沙鱉源嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌的基因型分別有10和6種，均以hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+為主，分別占檢測菌株數的55.74 %和50.00 %[23-24]；胡子鯰源氣單胞菌的毒力基因型也各有不同，其中，嗜水氣單胞菌的毒力基因型為hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-和hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+2種，而溫和氣單胞菌為hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-和hly-Aer+Alt-Act+ahal-ahp-2種[25]。本試驗中，TH1的毒力基因型為hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+，與黃沙鱉源嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌的主要毒力基因型一致，這一基因型在胡子鯰源嗜水氣單胞菌中也檢測到，但在胡子鯰源溫和氣單胞菌中未檢測到[27]，可能與檢測樣本量有關；TH3的基因型為hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-，這一基因型在胡子鯰源嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌中均檢測到[27]，但在黃沙鱉源嗜水氣單胞菌(61株)和溫和氣單胞菌(14株)中均未檢測到[17-18，23-24]，這種差異是否與菌株的動物源性不同有關，尚須更多的深入研究結果予以證明。TH1和TH3攜帶所檢6種毒力基因中包含hly和Act在內的5到6種，對禾花鯉的致死率均為100.00 %，均屬強毒株，此結果與劉杰等[23]的研究結果一致。

4 結 論

引起廣西全州縣飛機坪魚種場禾花鯉大批死亡的病原菌是嗜水氣單胞菌，2株菌株TH1和TH3的毒力基因型分別為hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+和hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-，對健康禾花鯉的致死率均為100.00 %，對硫酸新霉素等5種藥物高度敏感，對青霉素G等4種藥物不敏感。

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Isolation,Identification,AntibioticResistanceandVirulenceGenesDetectionofPathogenicAeromonashydrophilainCyprinuscarpio

DENG Xiao-hong1，5，LIANG Jing-zhen1，2，LI Shan-mei3，LV Xiao-li4，WEI Mu-lan6，HAN Shu-yu3，MENG Lan-li7，HUANG Jun1，2*，JIANG Jing-yun5

(1.Guangxi Aquatic Animal Diseases Diagnosis Laboratory,Guangxi Nanning 530005,China; 2.College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Guangxi Nanning 530004,China; 3.Guangxi General Station of Aquaculture Technology Extension,Guangxi Nanning 530022,China; 4.Luchuan Station of Aquaculture Technology Extension,Guangxi Luchuan 537700,China; 5.Quanzhou Station of Aquaculture Technology Extension,Guangxi Quanzhou 541500,China; 6.Du’an Station of Aquaculture Technology Extension,Guangxi Du’an 530700,China; 7.Tiandong Station of Aquaculture Technology Extension,Guangxi Tiandong 531500,China)

【Objective】In order to providea reference for effective prevention and control of bacterial disease ofProcyprismerus,the study was conducted to isolate and identify the pathogen of bacterial disease inProcyprismerus in the Feijiping fingerling farm in Quanzhou Guangxi,the pathogenicity,antibiotic resistance and six kinds of virulence genes of the pathogen were tested.【Method】The pathogen was isolated from parts such as the liver,heart and spleen tissues in the diseasedProcyprismerus in this study.An artificial infection was measured on the pathogenicity of the isolated strains.Bacterial identification was finished by API biochemical analysis combined with 16S rRNA gene sequencing.The K-B paper diffusion method was used to test antibiotic resistance of the pathogen,presence of virulence genes was determined by using the PCR method.【Result】Two virulent pathogenic strains TH1 and TH3 were isolated from diseasedProcyprismerus.The two strains both contributed a fatality rate of 100.00 % to healthyProcyprismerus carps.Moreover,the strains were both identified asAeromonashydrophila,and had the closest genetic relationship relatives with the standard strain ATCC 7966 (NR 118944) ofA.hydrophila,sharing homology of 99.80 %.The two strains were highly sensitive to five kinds of antibiotics including neomycin sulphate,however,they were insensitive to four kinds of antibiotics including penicillin G.Strain TH1 carried six kinds of virulence genes includinghly,Aer,Alt,Act,ahalandahp.Whereas strain TH3 carried five virulence genes includinghly,Aer,Alt,Act,ahal.【Conclusion】The pathogens causing fulminant death ofProcyprismerus wereA.hydrophilain the Feijiping fingerling farm in Quanzhou,Guangxi.The genotypes of the pathogenic strain TH1 and TH3 werehly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+andhly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-,respectively,and the pathogens contributed a fatality rate of 100.00 % to healthyProcyprismerus.The pathogens were highly sensitive to five kinds of antibiotics including neomycin sulphate,however,they were insensitive to four kinds of antibiotics including penicillin G.

Procyprismerus;Aeromonashydrophila; Antibiotic resistance; Virulence genes

1001-4829(2017)4-0952-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.4.038

2016-12-10

廣西水產畜牧獸醫局專項項目(桂漁牧財[2013]35號，桂漁牧財[2014] 52號，桂漁牧財[2015] 97號)

鄧小紅(1976-)，女，廣西全州人，工程師，從事水產養殖及病害防控技術的研究和推廣，E-mail：574875004 @qq.com，*為通訊作者，E-mail：hj1351@163.com。

S965.116

A

(責任編輯 王冠玉)