HIV-1假病毒感染未成熟樹突狀細胞實驗研究①

朱 娜 劉雪麗 仇 妮 張潔婷 吳詩品 李體遠 郭 焱 李 昌 金寧一

(青島市中心醫院藥學部，青島 266042)

·基礎免疫學·

HIV-1假病毒感染未成熟樹突狀細胞實驗研究①

朱 娜 劉雪麗 仇 妮 張潔婷 吳詩品②李體遠②郭 焱③李 昌④金寧一④

(青島市中心醫院藥學部，青島 266042)

目的構建攜帶增強型綠色熒光蛋白基因(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的HIV-1假病毒；通過HIV-1假病毒感染未成熟樹突狀細胞(immatural dendritic cell,iDC)實驗探討病毒與細胞的相互作用。方法利用慢病毒包裝系統構建攜帶EGFP基因的HIV-1假病毒，通過RT-PCR擴增HIV-1假病毒中的EGFP基因；HIV-1假病毒感染iDC，對HIV-1假病毒感染iDC后的基因組整合和轉錄水平進行檢測，觀察被感染iDC中EGFP基因的表達。結果構建的HIV-1假病毒通過RT-PCR結果顯示擴增得到EGFP基因；HIV-1假病毒感染iDC后，在基因組整合和轉錄水平檢測中都擴增得到了EGFP基因，熒光顯微鏡觀察被HIV-1假病毒感染的iDC，觀察到iDC表達綠色熒光蛋白。結論成功構建攜帶EGFP基因的HIV-1假病毒；HIV-1假病毒可以感染iDC，并將其遺傳物質整合到iDC基因組中，并經過轉錄和翻譯使iDC表達EGFP。

HIV-1假病毒；未成熟樹突狀細胞；感染實驗

艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)由人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起，HIV-1為主要病原，是循環CD4+T淋巴細胞顯著下降、機會感染及惡性疾病為特征的繼發性免疫缺陷綜合征[1]。樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)是目前已知功能最強的專職抗原遞呈細胞(Antigen presentation cell,APC)，主要誘導體內免疫反應，是抗感染免疫的中心環節。一般認為HIV-1侵入人體后，首先感染DC，DC將病毒抗原進行處理，提呈給T淋巴細胞，進而激發一系列抗病毒免疫反應[2,3]，DC在HIV感染與免疫中起到重要作用。DC家族的特點之一是成熟過程，在這個過程期間，他們改變形態和功能[4]。iDC有細胞吞噬能力，在受傷或感染部位捕獲抗原，DC吞噬過程比其他吞噬細胞更為復雜，并在MHCⅠ、Ⅱ類分子上呈遞正確的抗原蛋白[5]，加工抗原之后，DC成熟，轉移到局部淋巴結，吞噬功能下降和抗原遞呈能力提升，并進一步導致T細胞的激活。因此，本文選擇抗原吞噬功能較強的iDC作為靶細胞對HIV-1病毒感染機制進行研究，且既往關于HIV-1病毒此類感染的機制研究和相關報道寥寥無幾。

由于直接操作HIV-1存在生物安全性問題，需要在生物安全三級以上實驗室中進行，所以構建假病毒是當前HIV-1研究的一個重要手段。假病毒核酸分子上編碼囊膜蛋白的基因被修飾掉，喪失了病毒的自我復制能力，只進行“一個細胞周期”的侵染，具有單輪感染活性，因此不需要在高級別生物安全實驗室操作[6]。我們選用質粒pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB15)構建HIV-1假病毒，pNL4-3-ΔE-EGFP為骨架質粒，是基于HIV-1原病毒的克隆pNL4-3，但在env開放閱讀框中用EGFP基因替代，pTHRO4156 clone 18(SVPB15)為外膜蛋白包裝質粒，來自B型病毒，含有全長env和rev基因，這兩種質粒經過細胞共轉染可以包裝出HIV-1假病毒。筆者課題組已經建立4 d獲得具有典型形態、表型和功能iDC的優化方法[7]。HIV-1為反轉錄病毒，感染靶細胞后可以將自身遺傳物質整合到靶細胞基因組中，表達相應的蛋白。因此，本研究在前期工作基礎上，擬以構建成功的HIV-1假病毒感染iDC，病毒內化后，其RNA經過反轉錄會整合到iDC基因組中，同時HIV-1假病毒攜帶的EGFP基因在iDC中經過轉錄、翻譯最后表達EGFP，針對HIV-1假病毒這一生物學特性我們可以對病毒感染及病毒與細胞相互作用進行探討，對HIV感染DC的研究進行了有益的嘗試。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 人胚胎腎細胞系293T細胞為本實驗室保存；iDC為本課題組通過免疫磁珠技術分離與體外誘導培養獲得。

1.1.2菌株和質粒 大腸桿菌E.coli STBL 2購自長沙贏潤生物技術有限公司；HIV-1假病毒骨架質粒pNL4-3-ΔE-EGFP和外膜蛋白包裝質粒pTHRO4156 clone 18(SVPB15)為中國疾病預防控制中心病毒研究所馮霞博士惠贈。

1.1.3工具酶、主要試劑和儀器 限制性內切酶HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ、DL 2000 DNA標志物、λEcoT14 IDNA標志物、rTaq酶、M-MLV反轉錄酶、隨機引物、dNTP和RNasin抑制劑購自TaKaRa公司；TRIzol購自Invitrogen公司；氨芐青霉素購自Invitrogen公司；質粒制備試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN；0.25%胰蛋白酶(1×)溶液、DMEM培養基、胎牛血清購自Hyclone公司；opti-MEM培養液購自Gibco；FuGEENE HD轉染試劑購自Roche公司；TRIzol購自Invitrogen公司；EGFP上下游引物和DEPC水購自上海生工生物工程技術服務有限公司；其他常規生物化學試劑均為分析純級。高速常溫離心機(Sigma)；高速低溫臺式離心機(Eppendorf)；-80℃超低溫冰箱(三洋公司)；熒光顯微鏡(Olympus)；倒置顯微鏡(XSZ-D2)(重慶光學儀器廠)；透射電鏡(JEM-1200 EXⅡ)(日本電子公司)。

1.2方法

1.2.1pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB15)質粒大量制備及濃度測定 制備假病毒包裝系統配套大腸桿菌STBL 2感受態細胞參照《分子克隆實驗指南》進行的操作[8]，將質粒pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB15)用STBL 2感受態細胞進行轉化，利用限制性內切酶PstⅠ酶切反應鑒定pNL4-3-ΔE-EGFP，利用HindⅢ和BamHⅠ雙酶酶切反應鑒定pTHRO4156 clone 18(SVPB15)，進行擴增培養，提取質粒，用分光光度計NANODROP 2000測定質粒濃度。

1.2.2HIV-1假病毒包裝及保存 將對數生長期的293T細胞按照5×106～6×106cells/ml的密度接種于6孔細胞培養板，培養液為正常含有10% FBS的DMEM，37℃、5%CO2條件下培養 24 h；在0.5 ml無抗生素無血清的opti-MEM中加入3 μg質粒pTHRO4156 clone 18(SVPB15)和9 μg質粒pNL4-3-ΔE-EGFP，輕彈混勻，室溫放置孵育5 min，加入40 μl Fugene HD輕彈混勻，室溫放置孵育20 min制成轉染液；將轉染液直接加入細胞中，細胞培養48 h后收集上清液，將上清液3 000 r/min(4℃)離心15 min，去除顆粒碎片[9]，-80℃保存備用，避免反復凍融導致病毒滴度降低，使用熒光顯微鏡觀察轉染后293T細胞熒光蛋白表達情況。

1.2.3HIV-1假病毒的RT-PCR鑒定 取300 μl病毒上清液，采用TRIzol一步法提取上清液中HIV-1假病毒RNA，反轉錄生成cDNA，進行 RT-PCR，對骨架質粒pNL4-3-ΔE-EGFP中的EGFP進行PCR擴增，引物：上游EP1：ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG；下游EP2：CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC。PCR反應程序如下：95℃預變性5 min，94℃熱變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，擴增30個循環，72℃后延伸10 min，4℃保存，反應結束后瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1.2.4HIV-1假病毒感染iDC iDC作為感染靶細胞，用添加10%Gibco胎牛血清和1%青鏈霉素的1640培養液培養，每1×106cells接種病毒液1 ml[10]，吸附1 h后棄去接種液補加10% 1640培養液，繼續培養24 h后收集細胞[11]，每個實驗組設1個空白對照孔。

1.2.5HIV-1假病毒感染iDC后熒光蛋白表達觀察 HIV-1假病毒感染iDC后，將iDC繼續培養24 h，利用熒光顯微鏡觀察iDC中熒光蛋白表達情況，同時觀察正常生長狀態下的iDC。

1.2.6HIV-1假病毒感染iDC后電鏡觀察 用細胞刮將感染HIV-1假病毒3 h后的iDC刮下，得到細胞懸液，5 000 r/min離心20 min，吸棄上清，加500 μl 戊二醛固定，進行透射電鏡觀察(透射電鏡：JEM-1200 EXⅡ，購自日本電子公司)。

1.2.7HIV-1假病毒感染iDC后基因組整合檢測 HIV-1假病毒感染iDC后，iDC繼續培養24 h，用細胞刮刮取iDC，獲得細胞懸液，參照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取iDC的基因組DNA，然后對其進行PCR擴增EGFP基因，設未感染iDC為對照。

1.2.8HIV-1假病毒感染iDC后的轉錄水平檢測 HIV-1假病毒感染iDC后，iDC繼續培養24 h，吸棄細胞培養液，用細胞刮刮取iDC，加約200 μl的PBS重懸，提取細胞總RNA，進行RT-PCR，擴增EGFP基因，設未感染iDC為對照，具體方法同1.2.3。

2 結果

2.1質粒pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB15)酶切鑒定結果 質粒pNL4-3-ΔE-EGFP的全長為14.7 kb，經PstⅠ單酶切后得到4個條帶，片段大小約為8 000、3 000、2 000和 1 300 bp(圖1)；質粒pTHRO4156 clone 18(SVPB15)全長為8 440 bp，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后得到目的片段env/rev，大小約為3 000 bp，另一個條帶約為5 000 bp(圖2)，得到正確目的片段，證明pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB15)可以用于HIV-1假病毒構建實驗。

2.2pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB15)大量制備濃度及純度測定結果 用于轉染實驗的質粒要求分光光度儀測定其OD260/OD280值在1.6到1.8之間，證明質粒純度較好，無蛋白和RNA污染。質粒pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB15)濃度及純度如表1所示，符合要求，可以用于轉染實驗。

2.3HIV-1假病毒包裝實驗 正常培養生長狀態良好的293T細胞如圖3A所示；pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB15) 共轉染293T細胞，48 h后，觀察到293T細胞略微變圓、積聚、顏色稍有加深(圖3B)，并沒有其他病變特征；在熒光顯微鏡下觀察，可以看到細胞中有綠色熒光，證明經轉染后pNL4-3-ΔE-EGFP中的EGFP基因在293T細胞中得到表達(圖3C、D)。轉染48 h后，理論上包裝出的HIV-1假病毒存在于細胞培養上清液中，收集細胞培養上清液于-80℃保存備用，并離心處理細胞碎片，用Trizol 法提取細胞總RNA，進行RT-PCR擴增EGFP基因，結果得到約700 bp的目的片段，與pNL4-3-ΔE-EGFP中插入的外源基因EGFP片段大小相同(圖4A)，設β-actin為內參對照(圖4B)。

圖1 pNL4-3-ΔE-EGFP的酶切鑒定結果Fig.1 Analysis of pNL4-3-ΔE-EGFP by enzyme digestionNote: M.DNA marker λEcoT14I;1.pNL4-3-ΔE-EGFP;2.pNL4-3-ΔE-EGFP digested by PastⅠ.

圖2 pTHRO4156 clone 18(SVPB15)的酶切鑒定結果Fig.2 Analysis of pTHRO4156 clone 18(SVPB15)by enzyme digestionNote: M.DNA Marker λEcoT14I;1.pTHRO4156 clone 18(SVPB15);2.pTHRO4156 clone 18(SVPB15) digested by BamH Ⅰ/Hind Ⅲ.

2.4HIV-1假病毒感染iDC后iDC中EGFP表達 HIV-1假病毒感染iDC 24 h后細胞未發生病變(圖5A)，與未感染的iDC形態和生長狀態都沒有區別，但熒光顯微鏡觀察到被感染的iDC中存在綠色熒光(圖5B)，證明EGFP在iDC中獲得表達，初步提示HIV-1假病毒可以感染iDC。

表1 pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB-15)濃度及純度

圖3 293T細胞觀察Fig.3 Observation of 293T cellsNote: A.Normal 293T cell(×200);B.293T cells transfected by plasmid(×200);C/D.EGFP observation of the 293T cells transfected by plasmid(×200).

2.5HIV-1假病毒感染iDC后透射電鏡觀察 對感染HIV-1假病毒3 h后的iDC進行電鏡觀察，發現存在疑似病毒粒子，通過電鏡拍攝下的病毒形態、病毒粒子大小及存在于兩細胞間的位置，表明該病毒粒子可能為結合在iDC表面的病毒粒子(圖6)。

圖4 β-actin檢測Fig.4 β-actin identificationNote: β-actin PCR amplification:M.DL2000 DNA marker;1.H2O control;2.Positive control;3.RT-PCR product of HIV-1 pseudovirus;4.RT-PCR product in control of normal 293T cells supernatant.

圖5 iDC觀察Fig.5 Observation of iDCNote: A.iDC infected by HIV-1 pseudovirus(×200);B.EGFP observation of the iDC infected by HIV-1 pseudovirus(×200).

圖6 病毒結合與捕獲試驗(透射電鏡，×6 000)Fig.6 Virus binding and capture assay(Observation of transmission electron microscopy，×6 000)

圖7 HIV-1假病毒感染iDC基因組整合檢測Fig.7 Genome integration level detection of HIV-1 pseudovirusNote: EGFP of genome of iDC PCR amplification:M.DL2000 DNA marker;1.Genome of iDC infected by HIV-1 pseudovirus;2.Genome of normal iDC.

圖8 RT-PCR檢測HIV-1假病毒感染iDC的mRNAFig.8 RT-PCR identification of mRNA of iDC infected by HIV-1 pseudovirusNote: EGFP of mRNA of iDC PCR amplification:M.DL2000 DNA Marker;1.RT-PCR product in control of mRNA of normal iDC;2.RT-PCR product of mRNA of iDC infected by HIV-1 pseudovirus.

2.6HIV假病毒感染iDC后基因組整合檢測結果 HIV-1假病毒感染iDC 24 h后提取iDC的基因組，得到cDNA，利用EGFP特異性引物進行PCR擴增，得到700 bp條帶(圖7)，與EGFP條帶的大小一致，證明HIV-1假病毒感染iDC后其RNA經反轉錄整合到iDC基因組中。

2.7HIV-1假病毒感染iDC后的轉錄水平檢測結果 HIV-1假病毒感染iDC 24 h后提取iDC的RNA，進行RT-PCR，經反轉錄得到cDNA，利用EGFP特異性引物進行PCR擴增后得到了700 bp條帶，與EGFP條帶的大小一致(圖8)，證明HIV-1假病毒感染iDC后在iDC中正常轉錄，mRNA得到表達。

3 討論

我們構建HIV-1假病毒，其基因組中的表達膜蛋白的基因失活，需要外源膜蛋白基因共轉染才能包裝出HIV-1假病毒顆粒，因此，HIV-1感染細胞iDC后，iDC中沒有外膜蛋白包裝基因，HIV-1不能進一步復制產生新一輪的病毒，降低了生物危險性，同時增加了實驗的可重復性。HIV-1假病毒的細胞嗜性和感染過程與真病毒相似，在研究病毒與細胞間相互作用時，直接感染靜止培養的iDC，可以模擬病毒感染的早期過程，這樣可以更好地理解與闡釋病毒與細胞的相互作用，為病毒感染與致病機制提供重要線索，對抗艾滋病DC疫苗與藥物的研制奠定理論基礎。

實驗中HIV-1假病毒骨架質粒為pNL4-3-ΔE-EGFP，它源于HIV-1原病毒克隆的pNL4-3，在env開放閱讀框中攜帶EGFP基因，EGFP是從pEGFP-N1質粒上擴增得到的，通過KpnⅠ和NheⅠ酶切位點插入pNL4-3主鏈。pNL4-3-ΔE-EGFP表達一種內質網固定的去除頂端的Env-EGFP融合蛋白[12]。外膜蛋白包轉質粒pTHRO4156 clone 18(SVPB15)包含全長env和rev基因，源于一個進化枝B型病毒感染的實驗者，通過RT-PCR擴增得到。env/rev片段通過HindⅢ和BamHⅠ酶切位點連接到pcDNA3.1(+)表達載體上，克隆表達一個有用的env/rev，可以構建假性感染性病毒[13]。對于B型病毒(SVPB15)來說，pTHRO4156.18 env包含假病毒粒子后屬于標準病毒中和模型。pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB15)構建的HIV-1假病毒是HIV-1報告病毒，可以被用于HIV-1抗藥性的表型分析，用于測定針對HIV-1 gag-pol結構域決定的病毒復制能力。

實驗中293T細胞系在骨架質粒和外膜蛋白包裝質粒共轉染后包裝HIV-1假病毒。最佳化的293T生產細胞系在人類CMV啟動子控制下穩定表達SV40 大T抗原，是病毒產量處于最佳化，同時維持HIV-1假病毒的生存環境[14]。HIV-1假病毒易于濃縮，具有良好的安全性、廣泛的宿主范圍和更高的轉染效率，可以應用于研究病毒與宿主細胞之間相互關系、評價中和抗體效價以及基因治療方面，是一種新型、安全的實驗工具。

體外分離、誘導、培養CD14+單核細胞被認為是獲得具有良好細胞活力iDC最普遍的途徑[15]，我們構建的HIV-1假病毒每一次凍融病毒滴度會降低10%，因此，病毒液儲于-80℃保存，感染實驗中是將病毒液融化后感染iDC。HIV-1感染iDC實驗一方面是對HIV-1假病毒的感染活性作以鑒定，另一面是模擬HIV-1的感染過程，尋找病毒的作用靶標，探索病毒與靶細胞的相互作用。HIV-1假病毒感染進入iDC，病毒RNA反轉錄后進入細胞核[16]，穩定地整合到宿主基因組中[17]，EGFP作為報告基因易于檢測，因此，通過觀察iDC中EGFP的表達、測定iDC的mRNA和基因組cDNA，可以判斷HIV假病毒是否感染細胞。本實驗結果表明，HIV-1能夠成功感染iDC，其RNA經反轉錄可以整合到iDC基因組中，并得到表達，從而為開展HIV-1與宿主細胞相互作用研究奠定了基礎。

HIV感染DC的研究尚處于起步階段，還有許多問題有待于進一步闡明和證實，比如HIV-1假病毒的功能和單輪感染活性驗證實驗；iDC攝取HIV-1假病毒后，iDC內部發生了哪些改變，激活了哪些信號通路，從而導致iDC分化為mDC等等。本課題組將開展HIV-1感染DC的差異蛋白組學研究，通過生物信息學分析，進一步了解HIV-1感染過程對iDC造成的影響，相信實驗研究的深入和實驗技術的發展會為HIV的靶向性抗病毒研發提供新的思路。

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[收稿2017-06-03 修回2017-07-25]

(編輯 張曉舟)

ExperimentalstudyonimmaturaldendriticcellsinfectedbyHIV-1pseudovirus

ZHUNa,LIUXue-Li,QIUNi,ZHANGJie-Ting，WUShi-Pin,LITi-Yuan,GUOYan,LIChang,JINNing-Yi.
PharmacyDepartmentoftheQingdaoCenterHospital,Qingdao266042，China

Objective:To construct HIV-1 pseudovirus containing enhanced green fluorescent protein(EGFP)gene.To understand the interaction between the virus and the cells.MethodsHIV-1 pseudovirus containing EGFP gene was constructed by lentiviral packaging systems,and its EGFP gene was amplified using RT-PCR.The level of genomic integration and transcription of HIV-1 pseudovirus containing EGFP gene were detected on iDCs infected with HIV-1 pseudovirus.At the same time,research on expression of the EGFP gene in iDCs infected with HIV-1 pseudovirus was performed.ResultsThe EGFP gene of HIV-1 pseudovirus was detected through RT-PCR.The EGFP gene was identified in iDCs infected with HIV-1 pseudovirus through PCR and RT-PCR.The EGFP was observed in iDCs infected with HIV-1 pseudovirus under fluorescence microscopy.ConclusionHIV-1 pseudovirus containing EGFP gene has been successfully produced.The HIV-1 pseudovirus that we constructed can infect iDCs,then its RNA can integrate into the genome of iDCs in the way of reverse transcription,and the EGFP gene could express in the iDCs after infected with HIV-1 pseudovirus.

HIV-1 pseudovirus;Immatural dendritic cell;Infection experiment

①本文受國家自然科學基金(31472197)、病原微生物生物安全國家重點實驗室開放課題(SKLPBS1435)、北京市自然科學基金(5152023)和吉林省青年科研基金項目(20140520173JH)資助。

②暨南大學第二臨床醫院，深圳市人民醫院，深圳 518000。

③長春中醫藥大學基礎醫學院，長春 130117。

④軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，省部共建吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，長春 130062。

R392

A

1000-484X(2017)10-1441-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.001

朱 娜( 1986年-)，女，碩士，主要從事臨床藥學研究,主要從事微生物與免疫方面的研究，E-mail: merryzhuna@163.com。

及指導教師：郭 焱(1963年-)，女，博士，教授，博士生導師,主要從事微生物與免疫方面的研究，E-mail: ccguoyan@163.com。李 昌(1978年-)，男，博士，教授，副研究員，主要從事微生物與免疫方面的研究，E-mail: lichang78@163.com。金寧一(1956年-)，男，博士，中國工程院院士，博士生導師,主要從事微生物與免疫方面的研究，E-mail: ningyij@hotmail.com。