miR-210調控Mex3B蛋白對肺癌細胞侵襲和增殖的影響①

王俊鋼 李聰聰 毛廣顯 張 潔 楊 翠

(鄭州大學附屬醫院/南陽市中心醫院胸外科，南陽 473000)

miR-210調控Mex3B蛋白對肺癌細胞侵襲和增殖的影響①

王俊鋼 李聰聰②毛廣顯③張 潔 楊 翠

(鄭州大學附屬醫院/南陽市中心醫院胸外科，南陽 473000)

目的探討miR-210和Mex3B蛋白對肺癌細胞侵襲和增殖能力的影響。方法運用qPCR檢測miR-210在正常肺組織和癌旁組織中的表達情況；運用qPCR檢測Mex3B在肺癌組織、癌旁組織中的表達；qPCR檢測miR-210在不同肺癌細胞株中(A549、H1299、H1650和H358)的表達水平；雙熒光素酶報告基因系統檢測miR-210對Mex3B轉錄的影響；細胞活性實驗檢測miR-210的表達對肺癌細胞活性的影響；平板克隆實驗檢測miR-210的表達對肺癌細胞A549的增殖能力的影響；Transwell侵襲實驗檢測miR-210的表達對肺癌細胞株A549的侵襲能力的影響。結果和癌旁組織比較，miR-210在肺癌組織中表達明顯增高，和癌旁組織比較,Mex3B在肺癌中表達較低，雙熒光素酶報告基因系統檢測結果顯示，miR-210可以直接調控Mex3B的轉錄活性，抑制miR-210的表達活性后，A549肺癌細胞的細胞活性受到一定的抑制；抑制miR-210后，肺癌細胞株A549的侵襲和增殖能力明顯降低。結論miR-210可以靶向調控肺癌細胞的侵襲和增殖能力。

肺癌；miR-210；Mex3B；Transwell

肺癌是全世界呼吸系統發病率最高的惡性腫瘤，也是男性死亡率最高的惡性腫瘤，小細胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)是其中主要的分類[2]。目前肺癌的主要治療方式包括手術，化療、放療，免疫治療及生物靶向治療等，盡管針對少部分肺癌亞型可以通過綜合治療獲得一定程度上的緩解，但是大部分類型的肺癌治療效果不佳或者緩解后容易復發，耐藥現象更是層出不窮，對疾病治療提出很多困難[3]。最近相關研究指出肺癌的復發、耐藥等生物學特性與某些分子指標有相關關系[4]。盡管肺癌治療手段不斷進步，但晚期肺癌患者的預后仍然很差，因此研發非侵入性且靈敏可靠的生物分子標志物是目前亟需解決的問題。

微小RNA(miRNA)是由18～22個核苷酸組成的小RNA編碼RNA[5]。已知這些小RNA分子在調節細胞增殖、分化和凋亡中起重要作用。通過結合至特異性mRNA的3′-非翻譯區(3′-UTR)，miRNA誘導降解或抑制靶mRNA的翻譯來調節基因表達[6]。以往的研究表明，miRNAs在不同腫瘤中的表達明顯不同，在腫瘤相關基因組區中發現了有50%的已知miRNAs類型[7]。研究還表明miRNA和腫瘤細胞與抗癌藥物之間存在密切的相關性[8]。

MiR-210在生物體中參與廣泛的生理病理過程，包括細胞增殖、遷移、凋亡、分化、DNA修復和細胞代謝等[9,10]。而且miR-210在調節抗腫瘤免疫反應過程中起到主要的調節樞紐作用，尤其miR-210可以抑制線粒體正常代謝從而對許多蛋白電子傳遞鏈的活性產生一定影響[11,12]。miR-210對肺癌等腫瘤的代謝也有一定的影響，但具體機制未有報道。

Mex3最初是在早期胚胎發生過程中發現的蛋白，其可以抑制部分蛋白翻譯過程，并且在對維持生殖系統的全能性中發揮重要作用[13]。在四種人類Mex3蛋白質中，Mex3A主要在脊椎動物的胚胎發育過程中發揮作用[14]。最近，據相關報道，Mex3B可以協調下游蛋白激活Rap1信號通路，進而誘發小鼠后代的體重和外觀發生明顯的異常表現[15]。且有研究表明，過表達Mex3蛋白過后，結腸癌的生物學行為得到一定程度的抑制[16]。

本研究擬分析miR-210和Mex3B在肺癌中的表達情況，并進一步探討miR-210與Mex3B的相互作用以及其在肺癌的遷移增殖過程中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株及相關材料 肺癌細胞株A549、H1299、H1650和H358均源自武漢大學典型培養物保藏中心。細胞培養條件：在RPMI1640培養基中加入1%青霉素/鏈霉素。用5%胎牛血清在5%CO2空氣濕潤培養箱中37℃恒溫培養。兔克隆單抗MEX3B購于Abcam公司(Abcam，FLJ40270)。miR-210-inhibitor慢病毒載體購買于上海吉瑪基因有限公司。SsoFast EvaGreen試劑及Lipofecta-mine2000轉染試劑購于TaKaRa公司。

1.1.2臨床標本采集及處理 收集2015年3月～2016年7月我院收治的80例肺癌患者，其中年齡(54.24±3.61)歲。所有患者術前無化療或放療，根據肺癌TNM分期標準，Ⅰ級29例、Ⅱ級26例、Ⅲ級20例、Ⅳ級5例。低分化22例、中分化29例、高分化29例。腫瘤組織離體后分兩塊，一塊迅速投入RNA保存液中，另一塊用經焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的冷磷酸緩沖液沖洗，去除血跡，迅速投入液氮凍存。標本收集獲得醫院倫理委員會的批準同意，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1細胞轉染 取對數生長期的肺癌A549細胞，按照Lipofectamine2000轉染試劑盒說明書將miR-210-inhibitor和陰性對照轉染細胞。轉染后qPCR檢測miR-210的表達情況。轉染后繼續培養，完成后續實驗。

1.2.2Western印跡分析 提取A549肺癌細胞蛋白檢測Mex3B的表達水平。配置SDS-PAGE電泳膠，取免疫沉淀最后所得的上清，上樣，每孔30 μl，電泳。用電轉移裝置將蛋白轉至PVDF或NC膜上。電轉移完畢后，使用TBST洗滌1次。將膜放入5%牛奶封閉液于室溫封閉1 h，或4℃封閉過夜。用封閉液稀釋目標蛋白抗體(Mex3B)1∶2 000，室溫下孵育作用2 h。TBST洗膜3次，每次10 min。稀釋酶標記二抗1∶500，室溫下孵育作用30 min。TBST洗膜3次，每次10 min。 使用Bio-Rad系統，ECL顯影劑顯影，使用Image Lab 3.0(Bio-Rad)進行分析。實驗重復3次。

1.2.3PCR實驗步驟 qPCR法檢測miR-210表達。將A549肺癌細胞接種于6孔板，接種密度為1×106L-1，培養36 h后按照Trizol說明操作提取組細胞總RNA，使用紫外分光光度計檢測核酸的濃度和純度。用在SsoFast EvaGreen試劑(Bio-Rad)中以1∶10 稀釋的cDNA進行qPCR測量。 將表達數據標準化至相應的參照基因。根據ΔΔCT 法計算檢測基因反應條件為：37℃ 15 min，98℃ 5min。根據PCR試劑盒說明書進行PCR反應。獲得數據以RQ=2-ΔΔCT計算mRNA表達量。

1.2.4細胞活性檢測實驗 使用細胞計數試劑盒CCK-8(Dojindo Laboratories，Tokyo，Japan)評估細胞活力。將6×103的A549細胞種植于96孔板中，將10 μl的CCK-8溶液加入到各孔中，將細胞在培養箱中孵育2 h(37℃和5%CO2)。 使用微板讀數器(Bio-Rad，CA，USA)在450 nm處測量吸光度，參考波長為630 nm。 計算出細胞活性比率。

1.2.5平板克隆形成實驗檢測肺癌細胞增殖能力 將A549細胞接種于6孔板，加入5 ml的無菌PBS溶液，輕輕吹散洗滌細胞沉淀并再次離心。反復洗滌3次后加入培養基，制備成單細胞懸液。測定細胞濃度并調整為1 000個/ml，將單細胞懸液均勻的種植在無菌的6孔板內，進行平板克隆形成實驗。兩周后觀察平板克隆細胞形成情況，并拍照，計算細胞的增殖率。實驗重復3次。

1.2.6細胞侵襲實驗測定肺癌細胞侵襲能力 使用Transwell實驗進行肺癌細胞侵襲能力測定。將總共5×104個細胞接種在無血清培養基中的上室中。底室含有10%FBS的培養基。 48 h后，棉球擦拭上室細胞，使用結晶紫染色下室細胞。觀察并計數穿透Transwell膜的細胞數。實驗重復3次。

1.2.7雙熒光素酶報告基因實驗 從人類基因組DNA產生全長miR-210-3′UTR，并通過退火合成的信號寡核苷酸產生突變體miR-210-3′UTR。將這些DNA片段克隆到ph-TK載體(腎臟熒光素酶)中，Preporter-miR-Mex3B-3′UTR代表野生型質粒載體和miR- Mex3B質粒結合共轉染到293U細胞內，Preporter-miR-Mex3B-3′UTRm代表突變型質粒載體和miR-Mex3B質粒結合共轉染到293U細胞內，同時使用pGL-3.0(熒光素酶)作為內參照，檢測NC組和miR-210-inhibitor組293U細胞中Mex3B的熒光活性相對值。使用Lipofectamine2000TM(Invitrogen)檢測轉染效率在孢菌素酶活性的基礎上正常化。根據制造商的說明書，使用雙熒光素酶報告系統試劑盒(Promega)測量螢火蟲和海腎熒光素酶活性，通過雙熒光素酶檢測miR-210對Mex3B 的表達活性的調控能力，明確miR-210對Mex3B熒光活性的調控情況。

2 結果

2.1qPCR檢測肺癌組織和不同肺癌細胞中miR-210的表達 通過使用qPCR測定miR-210在肺癌細胞系中的表達水平。qPCR結果顯示(圖1)：在不同肺癌細胞株中，miR-210在A549肺癌細胞株中表達相對較高，后續實驗選取A549細胞株作為實驗對象。上述結果表明，miR-210在肺癌中可能充當一個促癌分子的角色。

2.2Western blot檢測肺癌組織Mex3B的表達及miR-210與臨床病理參數間的關系 Western blot檢測肺癌組織和癌旁組織中Mex3B蛋白的表達水平。結果顯示(圖2)：相比正常肺組織，肺癌組織中Mex3B表達水平相對較低，差異具有統計學意義。上述結果表明，Mex3B在肺癌中可能扮演一個相對抑癌的作用。

miR-210的表達水平隨肺癌病理分期的增加而降低；隨分化程度的降低，miR-210的表達水平逐漸降低；miR-210的低表達隨著淋巴結受累以及受累數目的增多而降低，差異有統計學意義；miR-210的表達水平與年齡無關。結果表明(表1)：miR-210與肺癌病理分期分級以及淋巴結是否存在轉移相關，而與年齡等因素無關。

圖1 miR-210在不同肺癌細胞株中的表達情況Fig.1 Expression of miR-210 in lung cancer cell

圖2 Mex3B在肺癌組織中的表達情況Fig.2 Expression of Mex3B in lung cancerNote: *.P<0.05.

表1 miR-210表達與肺癌臨床病理特征的關系

圖3 雙熒光素酶實驗檢測miR-210和Mex3B之間的關系Fig.3 Double luciferase assay to detect relationship betw-een miR-210 and Mex3BNote: A.miR-210-inhibitor inhibit the expression of miR-210;B.Double luciferase assay defect the relationship between miR-210 and Mex3B.*.P<0.05.

圖4 細胞活性實驗檢測miR-210對A549細胞的影響Fig.4 Cell activity test were used to detect the effect of miR-210 on A549 cellsNote: *.P<0.05.

2.3雙熒光素酶實驗檢測miR-210和Mex3B之間的關系 雙熒光素酶實驗檢測A549細胞株中miR-210和Mex3B蛋白的表達結果顯示(圖3)：加入miR-210-inhibitor后Mex3B的熒光活性水平出現相應上調。表明miR-210可以調控Mex3B的表達水平。Mex3B是miR-210下游的一個靶點基因，miR-210可能通過干擾Mex3B的表達水平，繼而影響后續對肺癌細胞生物學行為的影響。

2.4沉默miR-210表達對肺癌細胞活性的影響 CCK-8檢測沉默miR-210對肺癌細胞活性的影響。實驗結果顯示(圖4)：加入miR-21-inhibitor后細胞增殖活性受到明顯的抑制。

2.5沉默miR-210表達對肺癌細胞增殖的影響Transwell侵襲實驗檢測miR-210對A549增殖能力的影響。使用miR-210-inhibitor轉染細胞，然后將培養好的細胞進行平板克隆形成實驗檢測增殖能力。結果顯示(圖5)：相比NC組，miR-210-inhibitor組的克隆形成細胞數出現相應的減少[(220.32±18.15)% vs (42.28±8.16)%,P<0.05]。表明沉默miR-210的表達后可以明顯地抑制肺癌細胞的增殖能力。

圖5 平板克隆形成試驗檢測沉默miR-210表達后A549細胞增殖能力的變化Fig.5 Proliferation of lung cancer cells were inhibited after inhibitor of miR-210Note: *.P<0.05.

2.6沉默miR-210表達對肺癌細胞侵襲的影響 Transwell侵襲實驗檢測miR-210的表達對A549侵襲能力的影響。使用miR-210-inhibitor轉染細胞，然后將培養好的細胞進行Transwell侵襲測定。結果顯示(圖6)：相比NC組，miR-210-inhibitor組的細胞侵襲數目相應減少[(330.32±25.82)% vs (65.37±11.34)%,P<0.05]。表明沉默miR-210的表達后可以明顯抑制肺癌細胞的侵襲能力。

3 討論

目前臨床診斷肺癌的主要依據仍是病理細胞檢查，只有在病理細胞學確診肺癌后才可以臨床診斷，但是根據臨床癥狀及影像學早期診斷陽性率較低[17]。因此,尋找一種早期診斷肺癌的方法極為迫切。RNA基因組和蛋白質組指紋圖能夠整體定量、動態反映疾病發生過程中蛋白質的種類及其數量峰值變化規律，有助于尋找與疾病密切相關的蛋白，可以成為診斷和判斷預后的生物標記物及藥物治療的靶點[18]。近年來，RNA圖譜和蛋白組指紋圖在臨床疾病尤其是惡性腫瘤的診斷、預防及治療方面迅猛發展。所以尋求肺癌腫瘤的早期標志物對于肺癌的臨床診斷和治療是極其重要的。

微小RNA(miRNA)可以調控基因的內源性非編碼RNA，并且最近的研究已經證明它們在腫瘤的發病機理中起到關鍵的作用[19]。miRNA表達譜可以作為診斷、預后、個體化治療和疾病管理的潛在生物標志物[20]。目前，血清中循環miRNA可以以明顯穩定的形式被鑒定出來，許多學者報道腫瘤患者血液中循環miRNA的異常表達。但是據我們所知，目前只有少數研究發現肺癌患者的血清或血漿miRNAs存在明顯異常[21]。然而，關于組織和血清血漿之間miRNA表達水平的關系仍有不同的爭議，尚未能在臨床檢測中達成一致[22]。

miR-210是由19～23個核苷酸組成，可以參與細胞內多種功能的調節[23]。最近有研究成功地建立了低溫細胞模型，通過調節miRNA的表達參與誘導細胞因子信號[24]。然而，很多研究都是集中在將腫瘤細胞作為研究模型去探討在缺氧缺血性微環境中如何去避免過多凋亡的分子機制，沒有做關于miR-210對腫瘤細胞惡性生物學行為的監測和影響。萬菁[25]研究表明，miR-210可以調控因基因缺失而導致的內皮細胞功能缺損對細胞遷移和侵襲的影響，而且抑制miR-210的表達可以增強細胞對缺氧缺血的耐受能力，間接地證明了miR-210的促癌機制。值得注意的是，抑制miR-210的表達與內皮細胞的凋亡能力呈正相關。

而MiR-210也可以作為腫瘤的放射抗性標記，miR-210在許多腫瘤中廣泛存在，尤其是肺癌的各個類型中，都存在miR-210的高表達狀態[26]。之前研究報道miR-210可以作為小細胞肺癌的不良預后的預測因子[27]。更有學者研究發現，經過術后放射治療的肺癌患者的miR-210的表達和DNA損傷修復之間有明顯的相關性，miR-210的表達可以影響DNA的損傷修復，從而導致肺癌的遠處擴散及轉移，甚至影響肺癌對化療藥物耐藥機制的產生[28]。

微小RNA可以參與細胞轉錄和基因表達的調控過程，其表達水平的缺失會影響轉錄平衡的穩定[29]。有研究表明，抑制miR-210的表達可以大幅度降低卵巢癌、肺癌及前列腺癌細胞在裸鼠中的成瘤率，也可以改善荷瘤小鼠的預后[30]。我們實驗通過檢測肺癌組織和細胞中miR-210和Mex3B表達情況，確定miR-210在肺癌中扮演一個促癌基因的作用，然后查閱相關生物學信息，運用Targetscans/PICTAR預測軟件預測miR-210下游可能存在的靶基因位點，篩選出和肺癌有相關關系的靶基因。我們通過生物信息學軟件查找，發現miR-210可能與Mex3B的某些保守序列相結合。因此我們推測Mex3B可能是miR-210的潛在下游靶基因，miR-210可能調控Mex3B的表達。為了進一步探討肺癌細胞中miR-210的改變對Mex3B蛋白的影響，我們通過轉染miR-210-inhibitor到肺癌細胞中，發現抑制miR-210能夠有效上調Mex3B蛋白的表達。上述結果與其他腫瘤組織中Mex3B受miR-210的調控情況是相似的[31]。

通過雙熒光素酶實驗證實二者有相同結合位點，且miR-210可以調控Mex3B的表達。后面通過肺癌細胞的增殖和侵襲實驗檢測沉默miR-210后肺癌細胞的生物學行為的變化，證實miR-210可以調控肺癌細胞的生物學行為。它提供了在功能學方面的miR-210和Mex3B之間的直接作用的證據。

總之，我們的研究表明miR-551和Mex3B在肺癌發生和發展中的作用關系，更好地理解調控肺癌腫瘤發生的分子機制，可以對肺癌的臨床診療提供一定幫助，為肺癌的臨床診治提供新的分子生物學標志物。

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[收稿2017-03-24 修回2017-06-26]

(編輯 倪 鵬)

歡迎訂閱和投稿《中國免疫學雜志》

EffectsofmiR-210onMex3Bproteinonmigrationandproliferationoflungcancercells

WANGJun-Gang，LICong-Cong,MAOGuang-Xian,ZHANGJie,YANGCui.
DepartmentofThoracicSurgery,theAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityHospital/TheCentralHospitalofNanyangCity,Nanyang473000,China

Objective:To investigate the effect of miR-210 on the migration and proliferation of lung cancer cells.MethodsThe expression of miR-210 in normal lung tissues and lung cancer tissues were detected by qPCR.The expression of Mex3B in lung cancer tissues and adjacent tissues were detected by qPCR.qPCR was used to detect the expression of miR-210 in different lung cancer cell lines(A549,H1299,H1650 and H358).The effect of miR-210 on the transcription of Mex3B was detected by double luciferase reporter gene system.The effect of miR-210 expression on the activity of lung cancer cells was detected by cell viability assay.The effect of miR-210 on the proliferation of A549 cells were detected by plate cloning assay.Transwell invasion assay were used to detect the effect of miR-210 on the invasion ability of lung cancer cell line A549.ResultsCompared with adjacent tissues,the expression of miR-210 were significantly decreased in lung cancer tissues,Mex3B were lower in lung cancer.Double luciferase reporter gene system results showed that miR-210 can directly regulate the transcriptional activity of Mex3B.The invasion and proliferation ability of lung cancer cell line were significantly reduced after inhibition of miR-210.ConclusionmiR-210 can target regulate the expression of Mex3B,and affects the invasion and proliferation of lung cancer cells.

Lung cancer;miR-210;Mex3B;Transwell

①本文為深圳市科技計劃項目(JCYJ20140415162338820)和深圳市醫療衛生科研項目(201302068)。

②鄭州大學附屬醫院/南陽市中心醫院特需病房一病區，南陽 473000。

③北京大學附屬深圳醫院胸外科，深圳 518036。

R734.2

A

1000-484X(2017)10-1468-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.006

王俊鋼(1978年-)，男，主治醫師，主要從事胸外科疾病方面研究，E-mail：doctorll22@163.com。