山仙顆粒對Lewis肺癌荷瘤小鼠抗腫瘤免疫力及外周血中IFN-γ、TNF-β、IL-10的影響①

方 艷 張朝玉 應小平 潘艷芳 焦佩娟

(陜西中醫藥大學，咸陽 712046)

·中醫中藥與免疫·

山仙顆粒對Lewis肺癌荷瘤小鼠抗腫瘤免疫力及外周血中IFN-γ、TNF-β、IL-10的影響①

方 艷 張朝玉 應小平 潘艷芳 焦佩娟

(陜西中醫藥大學，咸陽 712046)

目的觀察山仙顆粒對Lewis肺癌細胞增殖的影響及對Lewis肺癌荷瘤小鼠抗腫瘤免疫力及免疫微環境的影響，以探究山仙顆粒抑瘤及提高機體抗腫瘤免疫力的分子機制，為其臨床應用提供深層次的理論依據。方法腋下皮膚移植Lewis肺癌細胞建立小鼠荷瘤模型，分為空白組、模型組、化療組和山仙顆粒組；通過對Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織稱重并計算抑瘤率，采用免疫組織化學法檢測脾臟組織中淋巴細胞CD、CD8表達情況，采用CCK-8法檢測淋巴細胞對Lewis肺癌細胞增殖的影響，采用ELISA 法檢測外周血中IFN-γ、TNF -β與IL-10的變化。結果①山仙顆粒組對Lewis肺癌的抑瘤率為45.99%，顯著高于化療組(P<0.05)；②小鼠淋巴細胞可抑制Lewis肺癌細胞的增殖，并與淋巴細胞濃度和作用時間呈正相關；且脾臟組織中CD4+T細胞、CD4+/CD8+比值及淋巴細胞對Lewis肺癌細胞的抑制率，模型組和化療組顯著低于空白組(P<0.05)，山仙顆粒組顯著高于模型組和化療組(P<0.05)，而山仙顆粒組與空白組比較無顯著差異(P>0.05)；③模型組和化療組小鼠外周血中的IFN-γ和TNF-β顯著低于空白組(P<0.05)、而IL-10顯著高于空白組(P<0.05)，山仙顆粒組小鼠外周血中的IFN-γ、TNF-β顯著高于模型組和化療組(P<0.05)，而IL-10顯著低于模型組與化療組(P<0.05)；山仙顆粒組小鼠外周血中的IFN-γ、TNF-β、IL-10與空白組比較無明顯差異(P>0.05)。結論山仙顆粒能明顯抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織的生長，并具有提高小鼠脾臟指數、增強T淋巴細胞活性、使外周血中的IFN-γ、TNF-β上調而IL-10下調，提示山仙顆粒的抗腫瘤作用可能通過調節CD4+T 淋巴細胞含量、CD4+/CD8+、Th1/Th2比值，恢復腫瘤患者免疫功能穩態，提高機體免疫力、加強免疫監視功能有關。

山仙顆粒；Lewis肺癌細胞；T淋巴細胞；IFN-γ；TNF-β；IL-10

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及瘤細胞株 健康SPF級昆明小鼠48只，雌雄各半，4～5周齡，體重18～22 g(西安交通大學實驗動物中心提供，SCXK-2015-005)。Lewis肺癌細胞株(LLC)，購于賽齊(上海)生物工程有限公司。

1.1.2藥品與試劑 山仙顆粒(SXG)，陜西中醫藥大學附屬醫院制劑中心(生產批號150328)，順鉑注射液。主要試劑：Hyclone DMEM 糖培養液，CD4、CD8、兔抗鼠多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；ELISA 試劑盒(武漢新啟迪生物科技有限公司)；CCK-8細胞增殖-細胞毒性檢測試劑盒(上海 BestBio 貝博生物)。

1.1.3主要儀器 二氧化碳培養箱(德國BindCD-150)，超凈工作臺(蘇州凈化)，倒置顯微鏡(奧特 BDS-200)，普通石蠟切片機(A0-800型，上海醫療器械廠)，全自動酶標儀(美國Bio-Tek ELX808IU)等。

1.2方法

1.2.1制備LLC細胞懸液 將LLC細胞體外培養擴增，取對數生長期的腫瘤細胞，制備1×108個/ml的瘤細胞混懸液。

1.2.2小鼠荷瘤模型的建立及分組 選取健康BALB/c小鼠48只，雌雄各半，4～5周齡，體重18～22 g，適應性飼養一周后，編號，按體重指數隨機、雌雄各半，選取12只，為空白組，于小鼠右前肢腋窩皮下注射0.4 ml生理鹽水。其余36只進行造模，將制備的LLC細胞懸液0.2 ml(約2×107個瘤細胞)接種于小鼠右前肢腋窩皮下，三天后檢查成瘤情況并測量，待腫瘤直徑約為5 mm時(約第5天)，然后按腫瘤大小指數、雌雄各半平均分為三組，每組12只，分別為模型組、化療組、山仙顆粒組。

1.2.3藥液制備 根據人、鼠體重計量換算法計算，將SXG用生理鹽水按SXG(g)∶生理鹽水(ml)=1∶20配置成SXG混懸液(0.05 g/ml)，4℃冰箱貯存備用。

1.2.4用藥 分組完成后第二天開始用藥。空白組、模型組及化療組均予以生理鹽水0.4 ml，SXG組予以山仙顆粒混懸液0.4 ml[g/(kg·d)]灌胃，每天上午9點及下午3點各一次，連續14 d；用藥第1、3、5天，空白組、模型組及SXG組，予以生理鹽水1 ml腹腔注射，化療組于，予以順鉑(DDP)生理鹽水溶液1 ml(含DDP 0.1 mg)腹腔注射。即：空白組、模型組(生理鹽水0.4 ml灌胃+生理鹽水1 ml腹腔注射)，化療組(生理鹽水0.4 ml灌胃+DDP生理鹽水溶液1 ml腹腔注射)，SXG組(SXG混懸液0.4 ml灌胃+生理鹽水1 ml腹腔注射)。

1.2.5樣品采集 各組小鼠于末次灌胃24 h后稱量體重、記錄，用2%的水合氯醛將小鼠麻醉，75%酒精消毒置超凈工作臺；腹主動脈穿刺取血，立即離心取血清凍存于-80℃冰箱備用；剝離瘤組織、游離出脾臟并稱重記錄。每組每只小鼠預留1/3的脾臟，生理鹽水沖洗備用。其余脾臟和瘤組織塊福爾馬林固定備用。

1.2.6指標檢測

1.2.6.1計算抑瘤率 根據記錄的瘤組織重量計算各組小鼠瘤組織平均值，按照公式：抑瘤率=(模型組瘤重-治療組瘤重)/模型組平均瘤重×100%，計算出抑瘤率。

1.2.6.2計算小鼠脾臟指數 根據記錄的小鼠體重與脾臟重量，按照公式:脾臟指數(mg/g)=脾臟重量/體重×100%,計算小鼠脾臟指數。

1.2.6.3免疫組織化學法檢測小鼠脾臟組織中T淋巴細胞CD4、CD8的表達 將脾組織常規制成石蠟切片,常規水化-洗片-封閉-洗片-抗原修復-加入CD4(或CD8)兔抗鼠多克隆抗體(1∶150)-洗片-加入生物素化羊抗兔第二抗體(1∶200)-洗片-封閉-顯色-蘇木素襯染-脫水、透明-封片。每例標本隨機選取10個高倍鏡視野(×400),計算陽性細胞百分率。

1.2.6.4CCK-8實驗 ①制備小鼠脾臟淋巴細胞懸液及LLC細胞懸液：將空白組、模型組、化療組、山仙顆粒組小鼠脾臟組織分別剪碎-研磨-PBS沖洗-離心-棄上清-加紅細胞裂解液2 min-離心-PBS重懸沉淀-離心-棄上清-計數，得淋巴細胞，用10%小牛血清DMEM培養液分別調整為1×108、2×108和4×108個/ml的細胞懸液。另取對數生長期的LLC細胞，用10%小牛血清DMEM培養液調整為1×107個/ml細胞懸液。②分組接種培養：將空白組、模型組、化療組、山仙顆粒組的不同濃度小鼠脾淋巴細胞懸液與LLC細胞懸液分別吸取100 μl進行混合培養，即形成效應細胞(淋巴細胞)∶靶細胞(LLC細胞)=10∶1、20∶1、40∶1的比例，并設對照組LLC細胞懸液100 μl+培養液100 μl及空白凋零組(培養液200 μl)，每組均設3個復孔(n=3)，置入37℃、5%CO2的二氧化碳培養箱中，分別于24、48 h后，倒置顯微鏡下觀察，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃孵育2 h。測定450 nm各孔的OD值。③計算抑制率：抑制率=(1-實驗各組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.6.5ELISA 法檢測小鼠外周血中IFN-γ、TNF-β與IL-10的變化 將凍存的血清置于37℃水浴箱中迅速溶解，從密封袋中取出實驗所需要的板條。每組均設3個復孔(n=3)，預留空白孔。加入備好的血清和標準品，37℃反應90 min-洗板2次-加入IFN-γ生物素化抗體工作液，37℃反應60 min-洗板3次-加酶結合物工作液(除空白孔外)，37℃反應30 min-洗板5次-TMB顯色-終止顯色-測量OD值(450 nm)TNF-β與IL-10檢測方法同上。

1.3統計學方法 本實驗應用SPSS19.0統計分析

2 結果

2.1SXG對Lewis肺癌荷瘤小鼠實體瘤生長的影響，見表1。

2.2SXG對Lewis肺癌荷瘤小鼠脾臟指數的影響，見表2。

2.3免疫組織化學法檢測SXG對Lewis肺癌荷瘤小鼠脾臟T淋巴細胞CD4+、CD8+亞群比例及CD4+/CD8+比值的影響，見表3、圖1、2。

2.4CCK-8法檢測SXG對Lewis肺癌細胞增殖的影響(表4、5，圖2) 空白培養液中的Lewis肺癌細胞呈梭形并伸出偽足，貼壁生長；與淋巴細胞共培養的Lewis肺癌細胞，數量明顯減少，并與淋巴細胞的濃度和作用的時間呈正相關，受到淋巴細胞的攻擊，細胞偽足減少、蜷縮、甚或死亡碎裂。

2.5ELISA 法檢測SXG對Lewis肺癌荷瘤小鼠外周血中的IFN-γ、TNF-β與IL-10的影響，見表6。

表2 各組小鼠脾臟指數比較分析表

Note：Compared with blank groups，1)P<0.05；compared with model group，2)P<0.05；compared with chemotherapy group，3)P<0.05.

表1 SXG與化療藥對LLC荷瘤小鼠實體瘤的抑制率

Note：Compared with model group，1)P<0.05；compared with chemotherapy group，2)P<0.05.

表3 各組小鼠脾臟CD4+、CD8+ T淋巴細胞比例及CD4+/CD8+比值

Note：Compared with blank groups，1)P<0.05；compared with model group，2)P<0.05；compared with chemotherapy group，3)P<0.05.

表4 不同濃度淋巴細胞作用24 h對Lewis肺癌細胞的抑制率

Note：Compared with blank groups，1)P<0.01； compared with model group，2)P<0.05，compared with chemotherapy group，3)P<0.05.20∶1 with 10∶1，4)P<0.05；40∶1 with 20∶1，5)P<0.05.

表5 不同濃度淋巴細胞作用48 h對Lewis肺癌細胞的抑制率

Note：Compared with blank groups，1)P<0.05；compared with model group，2)P<0.05；compared with chemotherapy group，3)P<0.05；20∶1 with 10∶1，4)P<0.05；40∶1 with 20∶1，5)P<0.05.

表6 小鼠外周血中的TNF-β、IFN-γ及IL-10的濃度

Note：Compared with blank groups，1)P<0.05；compared with model group，2)P<0.05；compared with chemotherapy group，3)P<0.05.

圖1 小鼠脾臟T淋巴細胞CD4、CD8表達情況(×400)Fig.1 Expression of CD4 and CD8 in spleen T lymphocytes of mice(×400)

圖2 不同濃度淋巴細胞24 h、48 h對Lewis肺癌細胞生長的影響Fig.2 Effects of different concentrations of lymphocytes on the growth of Lewis lung cancer cells at 24 h and 48 h

圖3 CTL活化和殺傷腫瘤細胞機制示意圖Fig.3 Mechanism of CTL activation and killing of tumor cells

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，尤其隨著環境污染的加重,近年來肺癌的發病率和死亡率呈明顯上升趨勢，我國大多數城市肺癌的發病率和死亡率居惡性腫瘤的第一位和第二位[1]。目前，肺癌的治療仍未能取得令人滿意的效果，5年總生存率只有 10%～15%[2]。研究發現，惡性腫瘤患者免疫功能狀態紊亂和低下[3],機體的免疫功能與腫瘤的發生發展密切相關[4]。2013年《Science》雜志將癌癥免疫療法評為本年度最重要的科學突破，并認為“免疫治療完全經得起考驗”。腫瘤免疫治療是通過激發或調動機體免疫系統，增強抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細胞。

抗腫瘤免疫以T淋巴細胞介導的細胞免疫為主(圖3)，成熟的T淋巴細胞根據細胞表面是否表達CD4和CD8而分為CD4+T細胞(helper T cell，Th)和CD8+T細胞(cytotoxic T cell，Tc)2個亞群CTL是抗腫瘤免疫的主要效應細胞，主要為活化的CD8+T細胞[4]。腫瘤抗原經抗原提呈細胞攝取加工，提呈給 CD8+T細胞，直接激活增殖分化為CTL；提呈給CD4+T細胞，誘導Th0細胞分化為Th1和Th2細胞，Th1細胞分泌IL-2和IFN-γ可協同刺激CTL的增殖和分化[4]。CTL通過Fas-Fasl和TNF-TNFR兩種途徑特異性殺傷靶細胞，介導腫瘤細胞壞死或凋亡[4]。正常生理狀態下CD4+和CD8+T細胞亞群比值保持動態平衡，以維持機體細胞免疫功能的穩定[3]。研究顯示，惡性腫瘤患者則出現免疫失衡，多表現為細胞免疫功能紊亂，主要表現為T淋巴細胞亞群發生改變，具體表現為CD4+T 淋巴細胞含量明顯低于正常人，CD4+/CD8+比值下降[5-7]。因此，可通過檢測荷瘤機體CD4+T細胞含量及CD4+/CD8+比值的變化以觀察機體的抗腫瘤免疫力。

另外，分化的Th1和 Th2 兩個細胞亞群，各自分泌不同的細胞因子，均能刺激自身分化和發展而抑制對方的分化和發展，相互影響。Th1型細胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-β等，IL-2、IFN-γ能刺激CTL的增殖和分化，IFN-γ可增強NK細胞的殺傷能力，TNF等可直接殺傷腫瘤細胞等，從而抑制腫瘤的發展[8-10]。Th2型細胞因子IL-10等為抑制性細胞因子，可抑制巨噬細胞的抗原提呈能力，抑制NK細胞活性，從而促進腫瘤免疫逃逸，促進腫瘤生長。研究顯示，IL-10介導免疫機制是通過作用于不同的免疫細胞亞群，并通過多種方式發揮免疫抑制，造成機體抗腫瘤免疫逃逸能力下降[11]。正常生理狀態下，機體通過調節Th1/Th2，維持細胞免疫和體液免疫的動態平衡，如果Th1/Th2平衡失調，出現Th1向Th2轉化的趨勢稱為 Th1/Th2漂移。現已發現肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、結直腸癌、白血病等多種類型腫瘤患者體內出現了Th1/Th2漂移現象[12-16]，即荷瘤機體強勢表達 Th2 型細胞因子，而Th1型細胞因子表達減弱。Wang等[16]對消化道腫瘤的研究表明，胃癌、結直腸癌患者血清中IL-2、IFN-γ等 Th1 型細胞因子與正常組比較均顯著降低，而 IL-4、IL-6、IL-10 等 Th2 型細胞因子均顯著升高。因此，使荷瘤機體由 Th2向 Th1漂移，為腫瘤的免疫治療提供了新思路。

山仙顆粒是陜西中醫藥大學第一附屬醫院腫瘤科根據中醫基礎理論，結合多年臨床經驗以及現代藥理研究，在“扶正培本、活血化瘀”基本治療法則的基礎上研制而成的純中藥抗腫瘤復方制劑，由西洋參、龜板、鱉甲、莪術、仙鶴草、生山楂等組成，方中各味藥的現代藥理研究均顯示有一定的抑瘤作用，并可促使腫瘤細胞的凋亡[17-21]。并且，臨床研究表明,山仙顆?？商岣邫C體抗腫瘤免疫、明顯改善臨床癥狀，有抑瘤、抗轉移、防復發作用[22，23]；實驗研究發現，山仙顆粒可以抑制Lewis肺癌轉移，還可影響腫瘤細胞凋亡相關基因bcl-2/bax、fasl/fas、caspase-3等和Hsp70、VEGF的表達[24-27]。

本實驗顯示，山仙顆粒能明顯抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織的生長。小鼠脾組織中CD4+T細胞、CD4+/CD8+比值及淋巴細胞對Lewis肺癌細胞抑制率的檢測結果均顯示：模型組低于空白組，化療組低于模型組，SXG組高于模型組，SXG組與空白組比較無顯著差異，顯示Lewis肺癌荷瘤小鼠機體出現免疫功能紊亂，而化療可進一步破壞機體免疫力，但山仙顆?？赏ㄟ^調節CD4+T 淋巴細胞含量、CD4+/CD8+比值恢復機體的免疫穩態。提示山仙顆?？梢燥@著改善Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫功能，提高機體抗腫瘤免疫力，并且與時效呈正相關。另外，外周血中Th1型細胞因子IFN-γ和TNF-β，模型組低于空白組；Th2型細胞因子IL-10，模型組高于空白組；顯示Lewis肺癌荷瘤小鼠Th1/Th2失衡，發生了Th1/Th2漂移。并且Th1型細胞因子IFN-γ和TNF-β，化療組低于模型組，SXG組高于模型組；Th2型細胞因子IL-10，化療組高于模型組，SXG組低于模型組；SXG組與空白組比較它們均無顯著差異；提示，山仙顆?？赏ㄟ^逆轉Lewis肺癌荷瘤小鼠機體的Th1/Th2漂移，維持細胞免疫和體液免疫的動態平衡。綜上所述并結合前期研究結果，山仙顆粒的臨床抗腫瘤作用可能與其恢復腫瘤患者免疫功能穩態，提高機體抗腫瘤免疫力、加強免疫監視功能，介導腫瘤細胞壞死或凋亡有關。

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[收稿2017-04-13 修回2017-05-25]

(編輯 許四平 劉格格)

EffectsofShanxianGranuleonantagonisticimmunityofLewislungcancermiceandlevelofIFN-γ，TNF-β，IL-10inperipheralblood

FANGYan,ZHANGChao-Yu,YINGXiao-Ping,PANYan-Fang,JIAOPei-Juan.
ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Xianyang712046,China

Objective:To investigate the effects of Shanxian granule on proliferation of Lewis lung cancer cells and anti-tumor immunity and immune microenvironment of Lewis lung cancer-bearing mice in order to explore the molecular mechanism of anti- tumor of Shanxian Granule and improve the anti-tumor immunity of the body,and provide further theoretical basis for its clinical application.MethodsLewis lung cancer cells was transplanted to axillary skin to establish mouse tumor model.The mice divided into blank group,model group,chemotherapy group and Shanxian granule group.The tumor tissue of Lewis lung cancer tumor bearing mice was weighed and the tumor inhibition rate was calculated.Immunohistochemical method was used to detect the expression of CD and CD8 in spleen tissue.The effect of lymphocytes on the proliferation of Lewis lung cancer cells was detected by CCK-8 method.The level of IFN-γ,TNF-β and IL-10 in peripheral blood were detected by ELISA.Results①The tumor inhibition rate of Lewis lung cancer was 45.99% in Shanxian Granule group,which was significantly higher than that of chemotherapy group (P<0.05).②The lymphocytes of mouse can inhibit the proliferation of Lewis lung cancer cells and have a positive correlation with lymphocyte concentration and duration of action.Moreover,CD4+T cells,CD4+/CD8+ratio and lymphocyte inhibition rate of Lewis lung cancer cells in model group and chemotherapy group were significantly lower than those in blank group (P<0.05).Shanxian granule group was significantly higher than the model group and chemotherapy group (P<0.05).However,there was no significant difference between Shanxian granule group and blank group(P>0.05).③The levels of IFN-γ and TNF-β in peripheral blood of model group and chemotherapy group were significantly lower than those in blank group,while IL-10 was significantly higher than that in blank group (P<0.05).The levels of IFN-γ and TNF-β in peripheral blood of mice in Shanxian granule group were significantly higher than those in model group and chemotherapy group,while IL-10 was significantly lower than that in model group and chemotherapy group (P<0.05).There was no significant difference in IFN-γ,TNF-β and IL-10 in peripheral blood of mice between Shanxian granule group and blank group.ConclusionShanxian granule can significantly inhibit the growth of tumor tissue of Lewis lung cancer tumor bearing mice,increase the spleen index of mice,enhance the activity of T lymphocytes,upregulate IFN-γ and TNF-β in peripheral blood and decrease IL- I.These suggested that the anti-tumor effect of Shanxian granule may be achieved by regulating the content of CD4+T lymphocyte,the ration of CD4+/CD8+and Th1/Th2 ratio,in order to restore the immune steady function of tumor patients,improve the immune system and enhance the immune surveillance function.

Shanxian granule；Lewis lung cancer cells；T lymphocytes；IFN-γ；TNF-β；IL-10

①本文為陜西省教育廳專項科研教育項目(15JK1190)。

R73

A

1000-484X(2017)10-1487-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.010

方 艷(1976年-)，女，碩士，副教授， 主要從事中醫藥抗惡性腫瘤機制的研究，E-mail：fangyan9494@163.com。