IL-37通過調控M-CSF和抑制IL-6-JAK2/STAT3信號通路抑制骨質疏松的機制研究

馬 銘 任漢強

(江漢大學附屬醫院(武漢市第六醫院)內分泌科，武漢 430015)

IL-37通過調控M-CSF和抑制IL-6-JAK2/STAT3信號通路抑制骨質疏松的機制研究

馬 銘 任漢強

(江漢大學附屬醫院(武漢市第六醫院)內分泌科，武漢 430015)

目的探討IL-37在抑制骨質疏松過程中的作用機制。方法選取本院2013年1月至2015年12月收治的97例骨質疏松患者及在本院行骨折手術的81例無骨質疏松患者(對照組)為研究對象，檢測兩組血清中IL-37及IL-6的水平。構建IL-37轉基因小鼠，將C57BL/6J小鼠、IL-37轉基因小鼠分別設置假手術(Sham)組，手術組(卵巢切除術，OVX組)。8周后，取小鼠血清，檢測血清中雌激素水平、堿性磷酸酶水平(ALP)、血鈣和血磷水平；同時取小鼠的雙側股骨、脊柱，病理切片分析股骨組織形態結構，骨密度儀檢測脊柱骨密度變化。分離培養各組小鼠骨髓基質細胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)，檢測BMSCs的體外增殖能力，M-CSF及IL-6的表達及STAT3的激活。IL-37轉染小鼠成骨細胞MC3T3-E1，轉染后72 h，ELISA檢測上清中M-CSF及IL-6，流式細胞術檢測MC3T3-E1細胞的凋亡，Western blot檢測STAT3的激活。結果骨質疏松患者血清中IL-37水平顯著低于對照組(P<0.05)，而IL-6則顯著高于對照組；C57BL/6J小鼠、IL-37轉基因小鼠OVX組血清中雌激素、血鈣和血磷顯著低于假手術組，而ALP水平顯著高于假手術組(P<0.05)，但IL-37轉基因小鼠OVX組血鈣和血磷則顯著高于C57BL/6J小鼠OVX組(P<0.05)。股骨病理切片及脊柱骨密度結果顯示，C57BL/6J小鼠、IL-37轉基因小鼠OVX組均出現組織形態結構的破壞和骨密度下降，但IL-37轉基因小鼠明顯優于C57BL/6J小鼠(P<0.05)。IL-37轉基因小鼠OVX組BMSCs增殖能力顯著高于C57BL/6J小鼠OVX組，而STAT3的激活和M-CSF的表達則顯著低于C57BL/6J小鼠OVX組(P<0.05)。MC3T3-E1細胞轉染IL-37后能明顯抑制M-CSF及IL-6的表達，而STAT3的激活也明顯被抑制，流式細胞檢測顯示轉染IL-37后能顯著抑制MC3T3-E1細胞的凋亡。結論骨質疏松患者血清IL-37水平顯著降低，IL-37可能是通過調控M-CSF及IL-6-JAK2/STAT3信號通路促進BMSCs增殖和抑制成骨細胞的凋亡從而抑制骨質疏松的進展。

IL-37;M-CSF;IL-6;STAT3;骨質疏松

近年來，伴隨我國人口政策出現的人口老齡化給社會帶來的公共衛生問題日益嚴重，老齡人口的健康問題廣受關注。骨質疏松是老年人較為常見的一種疾病，特別是絕經后的老年婦女，其發病率呈逐年上升趨勢。該疾病是以骨密度降低伴隨骨折風險增加為主要特征的一種疾病。目前多數研究認為，在老年骨質疏松發病的機制中，主要是由于在絕經后骨質重塑的過程中，破骨細胞調控的骨吸收與成骨細胞調控的骨形成之間的競爭被打破，破骨細胞的調控占據了優勢。老年骨質疏松患者，其骨髓基質細胞增殖能力及分化為成骨細胞的能力顯著降低[1]。研究表明，在敲除STAT3的去卵巢小鼠模型中，其骨質疏松嚴重程度明顯重于未敲除小鼠[2]。此外，有研究表明，M-CSF調控的失調，與骨質疏松之間存在顯著的因果關系[3]。IL-37是近年來新發現的IL-1家族新成員，有研究表明，其在炎癥過程中發揮負調節因子的作用，能夠抑制炎癥因子的表達，從而抑制過度的炎癥反應，此外，它還能抑制STAT家族的表達和激活[4]。為此，本研究將探討在骨質疏松患者血清中IL-37的表達水平，同時通過骨質疏松小鼠模型，探討IL-37在骨質疏松過程中發揮作用的機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1患者及標本 選取本院2013年1月至2015年12月收治的97例骨質疏松患者為觀察組，其中男性患者23例，女性74例，年齡56～74歲，平均(61.3±13.5)歲。同期選擇在本院體檢中心健康體檢的81例志愿者為對照組，其中男性18例，女性63例，年齡45～60歲，平均年齡(48.8±10.9)歲。抽取兩組患者的外周血并制備血清備用。

1.1.2納入及排除標準 觀察組所有患者均符合骨質疏松的診斷，診斷依據參照文獻[1]，即以下標準：① 臨床表現：出現周身疼痛、身高降低、駝背、脆性骨折及呼吸系統受損等；②骨密度檢查結果為骨峰值降低2個標準差或下降25%。排除標準：① 長期營養不良及低鈣飲食患者；② 長期臥床患者；③ 伴有全身其他器官器質性疾病的患者；④ 惡性腫瘤患者；⑤ 近期及長期服用影響骨代謝藥物患者；⑥ 并發其他代謝性疾病患者。

1.1.3材料與設備 主要試劑包括DMEM培養基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)，青霉素、鏈霉素(美國Sigma公司)，人IL-37 ELISA試劑(美國R&D Systems)，小鼠M-CSF、IL-6 ELISA試劑盒(Elabscience iotechnology)，ALP檢測試劑盒(美國貝克曼公司)，STAT3、p-STAT3、β-actin抗體(美國Abcam公司)，Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)，Lipofectamine?2000轉染試劑盒(Thermo Fisher)，MTT檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。M-CSF及IL-6引物由上海生工合成。C57BL/6J小鼠、IL-37轉基因小鼠購自武漢大學實驗動物中心，MC3T3-E1細胞購自武漢大學典型培養物保藏中心。SDS-PAGE試劑購自Bio-Rad。主要設備包括CO2培養箱、超凈工作臺、Biotek酶標儀、流式細胞儀、Bio-Rad垂直電泳儀、Bio-Rad Western blot化學發光成像系統。

1.2方法

1.2.1骨質疏松小鼠動物模型 將健康C57BL/6J雌性小鼠30只、IL-37轉基因雌性小鼠30只均隨機分為2組，即卵巢切除術組(VOX)15只，假手術組(Sham組)15只。卵巢切除及假手術參照文獻[5]進行。術后8周分離各組小鼠血清，測定血清雌激素、鈣、ALP、磷水平；取VOX及Sham組小鼠的雙側股骨、脊柱，病理切片分析股骨組織形態結構，骨密度儀檢測脊柱骨密度變化。

1.2.2BMSCs的體外培養、增殖、成骨分化能力及M-CSF表達和STAT3表達與激活檢測 參照文獻[6]的方法，采用全骨髓法培養BMSCs。細胞分離后置CO2培養箱中培養，3 d后首次換液，以后間隔3 d換液一次。當原代細胞集落處細胞密度達到密集狀態時，以0.25%的胰酶進行消化傳代。

當細胞傳至第3代時，取各組BMSCs，計數后稀釋至濃度為4×104個/ml，向96孔板中加入細胞懸液，每孔接種200 μl。根據實驗需要設置復孔，每組各12孔。接種24 h后待細胞貼壁，給細胞換液，此后每48 h換液一次。在接種的第2、4、6天時以MTT法檢測各組細胞在492 nm波長處吸光值，每組每次檢測3孔，取均值。在細胞培養的第4天，吸棄培養基，參照文獻[6]的方法，細胞裂解后全自動生化分析儀測定每組ALP，每組3孔，結果取平均值。

取第3代各組BMSCs，提取總RNA及總蛋白，Real time-PCR檢測M-CSF的表達，Western blot檢測STAT3蛋白表達及激活。

1.2.3MC3T3-E1細胞轉染 采用脂質體轉染法將構建好的pIL-37質粒及空質粒pcDNA3.1轉染至MC3T3-E1細胞，轉染后48 h ELISA檢測細胞培養上清中M-CSF的含量，流式細胞術檢測MC3T3-E1細胞的凋亡，Western blot檢測STAT3的表達及激活。

1.3統計學分析 所有實驗均單獨重復3次，所有數據采用SPSS20.0進行分析，計量資料采用單因素方差，采用t檢驗進行兩兩比較，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1骨質疏松患者與健康人血清IL-37及IL-6濃度比較 骨質疏松患者與對照組血清中IL-37及IL-6含量比較結果見圖1。結果顯示，骨質疏松患者血清IL-37濃度顯著低于對照人群(P<0.001)，而IL-6則顯著高于對照組(P<0.001)，差異具有統計學意義。

2.2骨質疏松模型的建立 術后8周血清學指標檢測顯示，C57BL/6J小鼠、IL-37轉基因小鼠OVX組血清中血鈣和血磷顯著高于假手術組，而ALP水平顯著低于假手術組(P<0.05)，但IL-37轉基因小鼠OVX組血鈣和血磷顯著低于C57BL/6J小鼠OVX組，ALP則高于C57BL/6J小鼠OVX組(P<0.05),見表1。

圖1 骨質疏松患者與對照組血清IL-37及IL-6比較Fig.1 Comparison of serum IL-37 and IL-6 between osteoporosis patients and control groupNote:**.P<0.001.

股骨組織(圖2A)病理切片及脊柱骨密度結果(圖2B)顯示，C57BL/6J小鼠、IL-37轉基因小鼠OVX組均出現組織形態結構的破壞和骨密度下降，但IL-37轉基因小鼠明顯優于C57BL/6J小鼠(P<0.05)。

2.3BMSCs的增殖、ALP合成及M-CSF表達和STAT3激活檢測 BMSCs細胞體外培養結果(見圖3)。IL-37轉基因小鼠OVX組第3代BMSCs增殖能力顯著高于Sham組和C57BL/6J小鼠OVX組(P<0.05)(圖3A)；ALP檢測結果顯示，IL-37能促進ALP的合成(圖3B)；Real time-PCR結果顯示，IL-37轉基因小鼠OVX組BMSCs細胞M-CSF及IL-6表達顯著低于C57BL/6J小鼠OVX組(P<0.05，圖3C)；Western blot結果顯示，IL-37轉基因小鼠OVX組BMSCs細胞STAT3的激活顯著低于C57BL/6J小鼠OVX組(P<0.05，圖3D)。

2.4IL-37對小鼠成骨細胞MC3T3-E1凋亡影響 MC3T3-E1轉染pIL-37后，MC3T3-E1細胞凋亡明顯減少(圖4A)，細胞培養上清中M-CSF及IL-6的濃度則顯著降低(圖4B)，Western blot結果顯示，STAT3的激活顯著降低(圖4C)。

表1 血清學指標檢測(n=15)

Note：Compared with Sham group，1)P< 0.05；compared with C57BL/6J OVX group，2)P< 0.05.

圖2 股骨組織病理切片及脊柱骨密度比較Fig.2 Comparison of pathological sections of femur and spine bone densityNote:Representative results of three independent experiments，*.P<0.01.

圖3 BMSCs的增殖、ALP合成、M-CSF及IL-6表達和STAT3激活檢測比較Fig.3 Comparison of proliferation,ALP synthesis,M-CSF and IL-6 expression and activation of STAT3 of BMSCsNote:Representative results of three independent experiments.*.P<0.01.

圖4 IL-37對小鼠成骨細胞MC3T3-E1凋亡的影響Fig.4 Influence of IL-37 on apoptosis of mice osteoblast MC3T3-E1Note:Representative results of three independent experiments.*.P<0.01.

3 討論

隨著我國社會經濟的發展，人口老齡化將帶來一系列公共衛生問題。骨質疏松是其中困擾中老年婦女的一大難題，且該疾病在我國發病率呈逐年上升趨勢。骨質疏松是一種全身性疾病，其特征是以骨量減少、骨密度降低、骨組織微結構破壞、骨脆性增加以及骨折敏感性增加為主[7]。研究表明，種族、遺傳、身體、社會文化、經濟及生活習慣的差異對發病的影響非常大[8]。該疾病在老年患者中具有發病率高、致殘致死率高的特點，同時還會給社會和患者家庭帶來沉重的經濟負擔。絕大多數骨質疏松引起的骨折會對患者生活質量造成嚴重的影響。以往研究骨質疏松發病機制主要以雌激素為中心，隨著時間的推移和研究的不斷深入，目前該疾病的發病機制開始以年齡相關因素和骨以及氧化應激為主要線索[9]。骨骼是一種具有高度重建性的器官組織，能持續性的重塑。在骨代謝過程中，骨形成和骨吸收是影響重建的一對最重要的耦聯動態因素，這兩個因素共同維持骨質及骨量的平衡，一旦平衡被打破，骨吸收量超過形成量，則會發生骨質疏松，即發生病理性的重塑，骨組織的微形態結構將發生改變[10,11]。研究表明，很多的炎癥因子如M-CSF、TNF-α、IL-1家族成員、IL-6、IL-17等均能通過影響調節骨吸收的途徑從而影響骨質疏松的發生[12-14]。我們的研究則表明，IL-37能夠抑制M-CSF的表達，同時抑制STAT3的表達和激活，從而抑制骨質疏松的發生。IL-37是近年來發現的IL-1家族成員之一，其生物學作用目前仍知之甚少。目前的研究表明，其在炎癥的過程中扮演著抑制炎癥過度反應的角色，它能夠廣泛性的抑制促炎癥因子的表達。在小鼠巨噬細胞內表達IL-37后，能夠抑制LPS誘導的炎癥，其機制主要是抑制了促炎性細胞因子IL-1α、TNF-α和IL-6等[15]。

研究表明，炎癥和骨質疏松之間存在明顯的關系，因為破骨細胞前體細胞位于骨髓中，而該前體細胞是單核細胞/巨噬細胞家族的成員[16]。由骨髓基質產生的M-CSF是巨噬細胞存活和增殖的必要條件。M-CSF結合到前體細胞的C-fms受體上，發揮激活RANKL的作用，從而增加前體細胞分化為破骨細胞的數量[17]。而體外純化培養的人破骨細胞，是由骨髓巨噬細胞在M-CSF和RANKL共同存在下培養而獲得的[14]。因此，M-CSF在破骨細胞的形成中扮演了非常重要的作用。我們的研究結果表明，IL-37轉基因小鼠骨質疏松模型中BMSCs細胞的增殖明顯低于普通骨質疏松小鼠，且其M-CSF的表達被明顯下調；體外培養的成骨細胞MC3T3-E1轉染表達IL-37后，其M-CSF的表達也被下調，這表明，IL-37在骨質疏松過程中可能是通過下調M-CSF的表達，從而抑制破骨細胞的形成抑制骨質疏松的進展，其機制尚需進一步的研究。

在骨質疏松患者體內，血清IL-6的表達明顯上調，而IL-6對基質細胞、成骨細胞、破骨細胞及其前體細胞的產生調控具有重要的意義。研究表明，IL-6能通過多條途徑對成骨細胞的凋亡和增殖分化進行調控，促進破骨細胞的形成，從而直接促進骨的吸收導致骨質疏松的發生[18]。值得注意的是，IL-37轉基因小鼠骨質疏松模型中，BMSCs細胞IL-6表達水平顯著低于普通野生型小鼠，成骨細胞MC3T3-E1轉染表達IL-37后，IL-6表達水平顯著低于未轉染細胞，這與IL-37轉基因小鼠骨質疏松嚴重程度明顯輕于普通小鼠這一組織學結果相一致，這表明，IL-37能通過調控IL-6的表達，從而抑制骨質疏松的進展。研究表明，IL-6-JAK/STAT3信號途徑是IL-6在骨質疏松中發揮作用的主要途徑[19]。阻斷IL-6特異性的信號通路JAK/STAT3后，IL-6的表達被顯著抑制，骨質疏松模型動物骨密度明顯增高，血清中ALP也顯著升高，而ALP能促進成骨細胞的形成[19]。為此，本研究檢測了STAT3信號通路的激活水平，結果發現，在IL-37轉基因小鼠，其BMSCs中STAT3信號的激活顯著低于普通骨質疏松小鼠。這表明，IL-37能通過阻斷IL-6-JAK/STAT3信號途徑從而抑制骨質疏松的進展。

綜上所述，骨質疏松患者體內IL-37明顯降低。在IL-37轉基因小鼠的骨質疏松模型和體外細胞模型中，IL-37能夠通過抑制M-CSF的表達和阻斷IL-6-JAK/STAT3信號途徑從而抑制骨質疏松的進展。但本研究仍然存在一定的局限性，在IL-37發揮作用機制的上下游，仍未探討清楚，這需要進一步深入的研究。

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[收稿2017-02-14 修回2017-03-07]

(編輯 倪 鵬)

IL-37inhibitsosteoporosisviaregulatingM-CSFandinhibitingIL-6-JAK2/STAT3signalingpathway

MAMing,RENHan-Qiang.
EndocrineDepartment，AffiliatedHospitalofJianghanUniversity(SixthHospitalofWuhan),Wuhan430015，China

Objective:To investigate the mechanism of IL-37 in inhibiting osteoporosis.MethodsNinety-seven patients with osteoporosis and eighty-one fracture surgery patients without osteoporosis in our hospital from Jan 2013 to Dec 2015 were selected as study subjects.The serum level of IL-37 and IL-6 were detected.Construction of IL-37 transgenic mice,the C57BL/6J mice,IL-37 transgenic mice were set in sham operation group(Sham),operation group(ovariectomy,OVX) respectively.The serum level of estrogen,alkaline phosphatase(ALP),calcium and phosphorus were detected after 8 weeks.The bilateral femur and spine of mice were collect after sacrifice,the morphology and structure of the femur were analyzed,and the bone density was measured by bone density meter.The bone marrow stromal cells(BMSCs) were isolated and cultured in vitro.The proliferation ability of BMSCs,expression of M-CSF and IL-6,and the activation of STAT3 were detected.IL-37 was transfected into mouse osteoblast MC3T3-E1 cell,M-CSF and IL-6 in cultured supernatant were measured by ELISA.Apoptosis of MC3T3-E1 cells were detected by flow cytometry.The activation of STAT3 was detected by Western blot.ResultsThe serum level of IL-37 in patients with osteoporosis were significantly lower than control group(P<0.05),while IL-6 was significantly higher than control group(P<0.05).The serum level of estrogen,calcium and phosphorus in OVX group of C57BL/6J mice and IL-37 transgenic mice were significantly lower than the sham operation group(P<0.05),while the level of ALP was significantly higher than sham operation group(P<0.05),but the serum level of calcium and phosphorus in OVX group of IL-37 transgenic mice were significantly higher than C57BL/6J mice(P<0.05).The pathological section of femur and spine BMD showed that the bone tissue in C57BL/6J mice and IL-37 transgenic mice in OVX group were damaged and the bone density decreased significantly,but IL-37 transgenic mice was significantly better than C57BL/6J mice(P<0.05).The proliferation ability BMSCs in OVX group of IL-37 transgenic mice was significantly higher than C57BL/6J,while the activation of STAT3 and expression of M-CSF were significantly lower than C57BL/6J(P<0.05).The expression of M-CSF and IL-6 were inhibited after MC3T3-E1 cell was transfected with IL-37,and the activation of STAT3 were also inhibited after IL-37 transfection.The results of flow cytometry showed that IL-37 could significantly inhibit the apoptosis of MC3T3-E1 cells.ConclusionThe serum level of IL-37 in patients with osteoporosis decreased significantly.IL-37 may inhibit the proliferation of BMSCs and inhibit the apoptosis of osteoblasts by regulating the expression of M-CSF and the activation of IL-6-JAK2/STAT3 signaling pathway.

IL-37;M-CSF;IL-6;STAT3;Osteoporosis

R392.9

A

1000-484X(2017)10-1552-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.023

馬 銘(1979年-)，男，主治醫師，主要從事內分泌臨床與基礎醫學方面研究，E-mail：maming1244@163.com。

及指導教師：任漢強(1963年-)，男，副主任醫師，主要從事內分泌臨床與基礎醫學方面研究。