反義缺氧誘導因子-1α對人膀胱癌細胞生長的影響①

戰 鵬 范海濤 張 明 馮樹強 鄭紅淑

(吉林大學第二醫院泌尿外科，長春 130041)

反義缺氧誘導因子-1α對人膀胱癌細胞生長的影響①

戰 鵬 范海濤 張 明 馮樹強 鄭紅淑

(吉林大學第二醫院泌尿外科，長春 130041)

膀胱癌是泌尿系統發病率和病死率均居首位的惡性實體腫瘤。近年研究發現人類絕大多數惡性實體腫瘤，其內存在低氧微環境，腫瘤細胞會激活一系列相關分子信號傳導途徑以適應缺氧微環境，同時增強腫瘤細胞自身的侵襲性和對放化療的抗拒性，致使療效降低，其中缺氧誘導因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)起到了更為關鍵的樞紐作用。近期有關HIF-1α作為癌基因在人體多種惡性實體腫瘤中過表達和針對其用藥治療的有效性報道較多[1,2]。但在以HIF-1α為靶點的膀胱癌研究治療卻鮮見報道。為此我們通過反義寡核苷酸技術，抑制膀胱癌細胞中HIF-1α表達，觀察反義HIF-1α(AS-HIF-1α)對癌細胞生長的影響，探討其作為癌基因用于人膀胱癌靶向分子治療的可能性和有效性。

1 材料與方法

1.1實驗材料 反義和隨機對照寡核苷酸購自上海吉瑪制藥技術有限公司，反義HIF-1α(AS-HIF-1α)為5′-GCCTCTGTGGGTTTGCCTAGTGTTTC，隨機對照序列為5′-ATTGGTAAGGATGACAGTGTA-ATTTC。在Genbank中行Blastn檢測，證實ASODN與任何其他已知哺乳動物基因無匹配。DMEM和脂質體Lipofecta minc2000購自Gibco公司，Trizol試劑盒購自Invitrogen公司。人膀胱癌細胞株T24購自中國科學院上海細胞所。

1.2實驗方法 ①T24細胞培養和轉染：用含10%的滅活胎標準小牛血清RDMI1640培養液，在37℃，2%CO2卵育箱內貼壁培養，直到T24細胞成對數生長，細胞克隆并篩選。用Lipofectaminc2000，按照說明書所述方法分3組轉染細胞。即AS-HIF-1α轉染組，轉染無義序列組和空白對照組。②RNA提取及Western blot檢測:按照Trizol試劑盒說明書提取轉染細胞總RNA，采用Western blot檢測HIF-1α表達量。③檢測T24細胞增殖能力，細胞周期和凋亡變化 在細胞被轉染72 h后，用MTT比色法測定細胞增殖率，FCM鑒定細胞凋亡率和細胞周期。

2 結果

2.1HIF-1α在3組細胞中的表達 Western blot法檢測結果(見圖1)顯示，AS-HIF-1α轉染組的HIF-1α表達明顯降低，而轉染無義序列組和對照組的HIF-1α表達明顯上調。膀胱癌細胞中的HIF-1α表達明顯高于正常細胞，提示HIF-1α可能作為一種致癌基因參與了膀胱癌發生發展的過程。

2.2HIF-1α對T24細胞增殖的作用MTT比色法 分別檢測了3組細胞的增殖率，結果(見圖2)依次為，AS-HIF-1α組57.4%，轉染無義序列組94.8%，對照組100%。上述3組間分別比較，差異均具有顯著統計學意義(P<0.01)，而轉染無義序列組與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，AS-HIF-1α通過下調腫瘤細胞HIF-1α表達抑制體外T24細胞增殖的作用，為今后臨床膀胱癌的治療提供了一定的實驗依據。

2.3HIF-1α對T24細胞周期變化和凋亡的影響 FCM分析結果(見圖3)顯示，AS-HIF-1α組，轉染無義序列組和對照組的G0/G1期細胞分別是59.2%，48.7% 和45.9%；S期分別是21.5%，32.6%和35.8%。AS-HIF-1α組S期細胞比例減少，細胞大多阻滯在G0/G1期，對照組和無義序列組幾乎無變化(P>0.05)。AS-HIF-1α組與對照組和無義序列組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，AS-HIF-1α組，對照組和無義序列組的細胞凋亡率依次是15.9%，2.4 %和3.1%。AS-HIF-1α組細胞凋亡率明顯高于其他兩組，差異比較有顯著統計學意義(P<0.01),而對照組和無義序列組比較，差異則無統計學意義(P>0.05)。

圖1 HIF-1α在不同3組中的表達(SP×400)Fig.1 Expression of HIF-1α in different three groups(SP×400)

圖2 MTT法檢測T24細胞的增殖率Fig.2 Detect proliferation rate of T24 cells by MTT

3 討論

據流行病學資料統計，膀胱癌雖可發生在任何年齡，但其發病年齡高峰是在中年以后，發病率隨年齡增加而上升，并且男性多于女性。膀胱癌的特點是發病率高，治療后易復發，復發后惡性程度增高[3,4]。因此早期診斷，提高療效，預防復發對膀胱癌來說既是難點也是熱點。隨著對腫瘤分子生物學研究的深入和癌基因學說的確立，癌基因檢測和針對癌基因的分子靶向治療成為目前腫瘤研究與治療的熱點之一。最近幾年的研究發現，HIF-1α在人體多種惡性實體腫瘤中過表達，并被證實既能促進腫瘤本身發生發展也與化療耐藥密切相關[3，5]。提示HIF-1α在腫瘤中的致癌作用與生物學行為具有普遍性。Nurwidya等[6]報道在人體幾乎所有惡性實體腫瘤中檢測到了一種類似的致癌因子——缺氧誘導因子-1α，該因子的表達水平與腫瘤惡性程度呈正相關。上述研究結果使我們有理由推測，應用HIF-1α的干擾物或阻礙物，通過轉染腫瘤細胞可能有助于抑制腫瘤的生長轉移，這一作用可能是通過降解癌基因蛋白，阻斷腫瘤分子信號傳導通路實現的[7]。

反義寡核苷酸技術是一門業已發展成熟的腫瘤生物治療方法，已被推薦用于癌癥、病毒感染和遺傳性疾病的治療[8-10]。本研究用反義技術，針對HIF-1α設計其反義寡核苷酸，觀察AS-HIF-1α對人膀胱癌T24細胞株的作用。結果提示，抑制T24細胞中過表達的HIF-1α后，該細胞增殖能力明顯下降，凋亡指數顯著上升，以及S期細胞比例減少。提示HIF-1α極有可能作為一種癌基因參與了臨床膀胱癌發生發展的過程。這使我們有理由推測對HIF-1α高表達的膀胱癌T24細胞，能夠通過反義技術有效抑制HIF-1α的表達，這為拓展臨床膀胱癌更加有效的靶向分子治療提供了實驗依據和新的思路。

圖3 FCM檢測T24細胞周期和凋亡率Fig.3 Detect cell cycle and apoptosis rate of T24 by FCM

[1] Semeza GL.Hypoxia-inducible factors:mediators of cancer progression and targets for cancer therapy [J].Trends Phar-macol Sci,2012,33(4):207-214.

[2] Sun Y,Guan Z,Liang L,etal.HIF-1α/MDR1 pathway confers chemoresistance to cisplatin in bladder cancer.[J].Oncol Rep,2016,35(3):1549-1556.

[3] Sun YW,Xuan G,Shu GA,etal.Correlation of tumor relapse and elevated expression of survivin and vascular endothelial growth factor in superficial bladder transitional cell carcinoma[J].Gene Mol Res,2013,12 (2) :1045-1053.

[4] Miglietta G,Gouda AS,Cogoi S,etal.Nucleic acid targeted therapy:G4 oligonucleotides downregulate hras in bladder cancer cells through a decoy mechanism [J].ACS Med Chem Lett,2015,6(12):1179-1183.

[5] Soni S,Padwad YS.HIF-1α in cancer therapy:two decade long story of a transcription factor[J].Acta Oncol,2017,56(4):503-515.

[6] Nurwidya F,Takahashi F,minakata K,etal.From tumor hypoxia to cancer progression:the implications of hypoxia-inducible factor-1 expression in cancers[J].Anat Cell Biol,2012,45 (2):73-78.

[7] Guan Z,Ding C,Du Y,etal.HAF drives the switch of HIF-1α to HIF-2α by activating the NF-κB pathway,leading to malignant behavior of T24 bladder cancer cells[J].Int J Oncol,2014,44(2):393-402.

[8] Li H,Quan J,Zhang M,etal.Lipid-albumin nanoparticles (LAN) for therapeutic delivery of antisense oligo-nucleotide against HIF-1α[J].Mol Pharm,2016,13 (7) :2555-2562.

[9] 周燕瓊，張艷美，高分飛，等.反義寡核苷酸抑制早期生長反應基因-1表達對內皮細胞缺氧復氧損傷的影響[J].中國臨床藥理學與治療學，2015,20(1)：14-18.

[10] Studzińska S,Bocian S,Siecińska L,etal.Application of phenyl-based stationary phases for the study of retention and separation of oligonucleotides [J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2017,1060:36-43.

[收稿2017-06-13 修回2017-09-05]

(編輯 許四平 劉格格)

①本文為吉林省自然科學基金項目(20150101195JC)。

R737.14

A

1000-484X(2017)10-1557-02

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.024

戰 鵬(1985年-)，男，碩士，醫師，主要從事泌尿系統腫瘤疾病方面研究。

及指導教師：張 明(1963年-)，男，博士，主任醫師，碩士生導師，主要從事泌尿系統腫瘤疾病方面的研究,E-mail：zhang ming196312@163.com。