呼吸道合胞病毒融合蛋白(F蛋白)結構及中和表位的研究進展①

曹健力 張 偉 夏寧邵 鄭子崢

(廈門大學國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，廈門大學分子疫苗學與分子診斷學國家重點實驗室，廈門 361102)

呼吸道合胞病毒融合蛋白(F蛋白)結構及中和表位的研究進展①

曹健力 張 偉 夏寧邵 鄭子崢

(廈門大學國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，廈門大學分子疫苗學與分子診斷學國家重點實驗室，廈門 361102)

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)，是造成全世界范圍內嬰幼兒下呼吸道感染的主要原因之一，2歲前的幼兒幾乎全部感染過RSV[1]，造成肺炎及毛細支氣管炎等呼吸道疾病[2]。 0～2個月的嬰兒在感染RSV后易出現嚴重的病癥[3]。而在最新的全球疾病死亡率分析中，1月到1周歲的兒童死亡中約有6.7%是由RSV感染造成的[4]。青壯年人群感染后病癥較輕，但在老年人群中會出現嚴重病癥及死亡病例[5]。人體被RSV感染后會激發出中和抗體并引發T細胞應答，但免疫能力會隨著時間衰退，進而造成終身的反復感染[6]。至今沒有安全有效的疫苗上市，唯一獲準上市的RSV特異性藥物是中和單抗Palivizumab(Synagis?)，但由于其價格高昂，中和效價不足致免疫劑量大等原因，目前僅用于降低免疫缺陷和先心病等高危新生兒的患病風險。結構生物學解析顯示Palivizumab能夠與一種穩定構象的F蛋白結合，提示F蛋白作為中和抗體靶向蛋白的重要性。

呼吸道合胞病毒屬于副黏病毒科(Paramyxov-iridae)成員，根據表面抗原的差異可分為RSV-A和RSV-B兩個亞型[7，8]。包含10個基因，編碼11種蛋白[9]。其中G蛋白和F蛋白是病毒表面的主要保護性抗原，能激起機體產生中和抗體[10]。G蛋白在亞型間差異性較大，故針對G蛋白的抗體大多是型特異性抗體[11,12]，而F蛋白在亞型間高度保守,由F蛋白誘導產生的抗體可同時抑制A/B型RSV病毒的感染，而且F蛋白也是激發機體產生保護性抗體的主要靶向蛋白[13,14]。因此，目前疫苗研究的重要目的是激起靶向RSV F的高中和抗體。

近期，研究者在RSV F蛋白的蛋白結構，表位及其免疫原性等方面均取得了顯著進展，其中包括通過抗原抗體復合物晶體解析出融合前構象(Prefusion)和融合后構象(Postfusion)的結構，并發現了新的中和抗體表位。本文旨在總結近年來RSV F蛋白的研究進展，包括Post/Prefusion結構的解析、代表性表位及其抗體的發現，以期對疫苗發展做出貢獻。

1 呼吸道合胞病毒融合蛋白的結構研究

呼吸道合胞病毒F蛋白(Fusion glycoprotein，融合蛋白)是N-糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，全長為574個氨基酸，包含信號肽(aa 2-20)、信號肽切割位點(aa 21-25)、F2區(aa 26-109)、多肽裂解區(aa 110-136)以及F1區(aa 137-574)[15]。RSV感染細胞后，會先合成一個70 kD的非活性F0前體，組裝成同源三聚體，之后轉移到高爾基體，109和136位點經弗林蛋白酶切割后，F1和F2通過二硫共價鍵連接成具有活性的F蛋白[16,17]。F2亞單位含有2個N連接糖基化位點，決定RSV感染的宿主特異性[18]。F1亞單位則包含了膜融合的重要因素：F1-N端融合膜肽段(FP，aa 137-155)，引發細胞膜融合，以及F1-C端穿膜肽段(TM，aa 488-516)。F1核心包括HR1(aa 149-206)和HR2(aa 474-523)，兩者都是亮氨酸基序形成的卷曲螺旋結構，其中HR1可以介導融合肽段插入靶細胞膜。在F結構并未明確解析的早期，研究者猜測RSV F蛋白與其他副黏病毒科病毒類似，在病毒粒子表面存在亞穩定態的融合前構象(Prefusion F)[19]。

隨著冰凍電鏡技術的發展，研究者在病毒粒子表面同時觀測到Prefusion和Postfusion結構[20]，該發現也同時證明了Prefusion是亞穩定狀態，最終會轉變為穩定態的Postfusion形態。研究也證明了高溫以及低滲透壓會引發Prefusion的變構[21,22]。但是目前對自然環境下變構的觸發機制仍不明確。有研究者提出是宿主細胞表面的受體與F蛋白結合而觸發了融合機制，比如最近發現的核仁素[23,24]。

由于Postfusion結構的穩定性，通過重組表達系統獲得的F蛋白可以穩定保持在Postfusion狀態。Melero團隊在2011年首次通過重組痘病毒載體表達系統在HEp2細胞上表達出可溶性的Postfusion蛋白[25]，通過電鏡及蔗糖密度梯度分析，該蛋白能聚集呈玫瑰花狀。同年，McLellan團隊利用哺乳動物細胞懸浮表達純化，得到了缺失融合膜肽段(FP)前10個疏水性氨基酸及穿膜(TM)區的F蛋白，隨后通過X射線晶體學衍射對其結構進行解析[26，27]。該蛋白的結構(圖1B)揭示Postfusion是1個類似錐形的三聚體分子，頭部類似球狀，尾部呈柄狀，頭部包含F1和F2亞單位且兩者緊密地結合在一起，形成了數個α螺旋和β折疊。尾部包含6HB結構，幾乎全由α螺旋構成，與其他Ⅰ型融合蛋白的Post結構類似。

由于Prefusion蛋白結構的不穩定，存在多種中間體，在前期實驗中，McLellan團隊利用已知結構的HPIV5 prefusion蛋白對RSV prefusion蛋白的結構進行模擬和預測[28]，提出RSV F蛋白極可能存在類似的Prefusion結構。接下來，為了解析Prefusion的準確結構，McLellan團隊在F蛋白基因上分別進行一系列的基因突變以穩固Prefusion狀態，選取其中的優勢突變質粒(敲除C端的穿膜區肽段，C端引入了三聚體結構穩定肽，凝血酶切割位點，6個His標簽以及Streptag標簽)與針對Prefusion的單克隆抗體質粒共轉[29]。該復合物制備并純化后進行晶體結構解析，從結構上看，Prefusion是一個致密的橢圓形三聚體結構，其中部有一個空腔(圖1A)。RSV F蛋白胞外域部分約有470個氨基酸，其中約300個在Prefusion和Postfusion間是相對保守的，差異部分基本都位于F1的C端和N端(圖1C、D)。pre-F蛋白的近膜端包含F2-N端和F1-C端，其由1個三層β折疊及3個螺旋(α8、α9和α10)組成的，其中α10螺旋延伸到病毒膜中。而遠膜端包含F1-N端和F2-C端，由7個螺旋(α1-α7)形成的三股反向平行折疊組和β折疊發夾(β3+β4)組成(圖1C)。3個原聚體(Protomer)相互接觸從而穩固三聚體的結構(圖1A)。在Prefusion轉變為Postfusion的過程中，F1 N端的變化最為明顯，有5個二級結構會重排為更延展的α螺旋，這5個二級結構分別是α2、α3、α4、β3和β4(圖1C、D)。大部分特異性靶向Prefusion的抗體結合在F1的C端或者N端，而與Prefusion和Postfusion均有反應的抗體，它們的結合位點基本位于變構前后的保守性區域。

2 融合蛋白的表位研究

隨著呼吸道合胞病毒融合蛋白結構的解析，新的中和表位也被逐步發現，目前確認的代表性表位及其對應抗體有：SiteⅠ：131-2a[30]；SiteⅡ：1129[31]、Palivizumab[32]、Motavizumab[33]；SiteⅢ：MPE8[34]；SiteⅣ：101F[35]；SiteⅤ：7.936；SiteⅥ：7.916和9.432[36]；SiteⅦ：hRSV90[37]；Site ?： D25、5C4、AM22[29](表1、圖2)。此外，還發現一株特異性結合Prefusion三聚體表位的抗體AM14[38]。由于F蛋白存在變構現象，部分表位會由于結構的扭曲或延展而消失。其中，SiteⅠ、SiteⅡ、SiteⅣ～Ⅵ在Prefusion及Postfusion結構均存在，而其中代表性的中和表位是SiteⅡ和SiteⅣ。針對這兩個表位的抗體雖不能阻斷病毒吸附，但是可以通過阻斷病毒粒子與宿主細胞膜的融合來中和感染[39]。

圖1 RSV Prefusion蛋白及Postfusion蛋白的二級結構比較[29]Fig.1 Comparision of Pre- and Postfusion secondary structure[29]

表1 RSV F蛋白表位情況

圖2 RSV Prefusion現有的中和表位情況[54]Fig.2 Current neutralizing epitopes on RSV prefusion[54]

2.1SiteⅡ SiteⅡ的代表性抗體是鼠源抗體1129[31]、人源化的Palivizumab[40]與其二代抗體Motavizumab[33]。F蛋白對這些抗體的逃逸突變位于F1的Asn262、Asn268和Lys272，結合表位橫跨了aa 255-276。從Motavizumab與RSV-F復合物的晶體結構可以看到，該表位形成了一個螺旋-環-螺旋(Helix-loop-helix)結構，Motavizumab識別的是這兩個螺旋[41]。雖然這個表位是由不連續的殘基組成，但仍然聚合成一個20氨基酸的線性肽段，使SiteⅡ可以成為免疫及疫苗發展的潛力靶標。

Lopez團隊曾用該表位的肽段免疫，但并沒有激起中和抗體[31]，其實從結構上可以發現，保持螺旋-環-螺旋結構對抗體識別是至關重要的，所以一旦破壞了該空間結構，就無法有效激起抗體。McLellan團隊為了穩固該結構，曾嘗試將表位放置于一個含有逆平行α螺旋的支架蛋白上，但該重組蛋白免疫后并不能顯著提高小鼠體內的中和抗體滴度[42]。Schief團隊則通過計算機設計和納米粒子展示的方法，生產出了Motavizumab表位支架，該蛋白能在恒河猴體內激起類似Motavizumab的中和抗體[43]。雖然激起的體內抗體滴度較低，但這個設計理念提出了一個精確研究免疫反應的方法。

2.2Site Ⅳ 另一個在Prefusion和Postfusion均存在的重要表位是SiteⅣ，該表位的代表性抗體是101F，該抗體的逃逸突變是F1的Arg429、Ile432、Lys433和Val447。101F和RSV-F復合物的晶體結構可見，結合位置橫跨了aa 422-438，這是一段線性結構[28]。在RSV的Prefusion和Postfusion結構上，這段肽段位于半胱氨酸富集區的7*beta鏈中最外側的β18上。對101F與RSV F胞外結合區域建模，發現Site Ⅳ區域在空間結構上比這段線性肽段更大且更復雜，還包括了額外的beta折疊。這個發現也解釋了101F與線性肽段的反應性比與RSV F的反應性弱10 000倍的原因[28]。最近，Schuster團隊從人體內分離出了一株可中和包含RSV在內的四種副黏病毒的抗體，研究者預測該抗體識別RSV F上的Site Ⅳ位點[44]。綜上可知，SiteⅣ是廣譜中和抗體的靶標，有望用于被動性預防免疫。

2.3Site ? Melero團隊在人血清中發現大部分的中和活性并不是由Postfusion引起的，從而確定了特異性靶向Prefusion結構抗體的存在[13]，Graham團隊同樣也發現人血清中的中和活性大部分來源于Prefusion特異性抗體[45]。RSV F上的其余表位SiteⅢ、SiteⅧ、Site ?就是Prefusion的特異性表位。D25、5C4、AM22是第一批被發現的Prefusion特異性的抗體，其中和效價比Palivizumab高5倍以上，其中D25和AM22是通過將志愿者提供的B細胞進行永生化后使用AIMM療法后分離得到的[46]，5C4是廈門大學夏寧邵團隊用質粒免疫小鼠后通過雜交瘤腹水純化獲得的鼠源抗體[29]。這三株抗體均有高中和活性且檢測不到與Postfusion RSV F的反應性。綜合X射線晶體學和電子顯微鏡的結果，發現三株抗體均特異性結合在Prefusion RSV F三聚體的遠膜端頂部，該位點被命名為Site ?。該表位包括了F1的α4螺旋(aa 196-209)和F2的部分區域(aa 62-69)。這兩個區域在由Prefusion變構為Postfusion的過程中均發生了巨大的變化，α4螺旋甚至翻轉了180°。這些結構間的巨大變化正好印證了抗體的Prefusion特異性，也間接說明了Fusion抑制劑的機理。其中Prefusion特異性抗體D25可以與單體F(Monomeric F)結合[47]，說明單體與三聚體Prefusion構象有類似結構域。

2.4SiteⅧ 近期，Crowe團隊從一位8歲兒童外周血單核細胞分離得到能與Prefusion(SC-TM)[48]特異性反應的B細胞，處理為雜交瘤細胞株[49]后進行表達鑒定，發現hRSV90這株抗體對A/B亞型均有很好的中和活性，且有Prefusion特異性。為了確定新抗體的結合位置情況，研究者將各表位的代表性抗體與hRSV90進行競爭實驗，發現hRSV90能完全阻斷SiteⅡ和Site ?，就此將hRSV90的結合區域定義為表位SiteⅧ。為了進一步了解新表位的情況，研究者將RSV A2 SC-TM與hRSV90-Fab復合物進行了X射線晶體結構建模分析，觀察到Fab位于SiteⅡ和Site ?間的界面，每個Fab僅結合一個原聚體(Protomer)。分析hRSV90的結合界面可知，SiteⅧ主要區域是靠近螺旋-環-螺旋的aa 163-181并部分覆蓋SiteⅡ和Site ?。該表位的抗體易受周邊表位抗體的空間位阻影響，當hRSV90與D25，Motavizumab、AM14共結合時，會發生近90°的偏轉，轉移到RSV F的垂線。Site Ⅷ覆蓋了部分SiteⅡ和Site ?表位且能激發出高效中和抗體，其特殊位置可以為未來的疫苗設計提供新思路。

2.5SiteⅢ 其他的Prefusion特異性抗體，比如MPE8，同樣是分離自捐贈者的IgG+記憶B細胞，可以交叉中和四種副黏病毒。在MPE8發現初期，研究者預測其表位位于β2/β7附近，結合位點有Thr50、Asp305、Gly307、Ile309、Asp310,在結構上位于SiteⅡ螺旋-環-螺旋的下方并包含了部分F2的區域[34]，研究者將其定義為SiteⅢ表位。近期Jardetzky團隊解析了MPE8與Prefusion RSV F(Ds-Cav1)[50]的晶體結構，發現MPE8橫跨了Prefusion三聚體相鄰的兩個亞基，是僅在Prefusion結構存在的亞基間表位；MPE8結合七肽重復序列A(Heptad reaped A，HRA)上的β(aa 178，180,184-187)[51]，該區域在Postfusion狀態時會重排為一段長螺旋并遠離MPE8原結合位置[29,52]，使該表位在Postfusion狀態時喪失；該區域在HRSV、BRSV、hMPV(人類偏肺病毒)、PMV(鼠肺炎病毒)間高度保守，基于此結構MPE8才具有交叉中和活性。

類似的三聚體識別抗體AM14則是識別另一個聚體表位，并同樣橫跨兩個原聚體(Protomer F)，包括在Pre/Post轉變后顯著變化的區域。對AM14的逃逸突變位點Leu160、Asn183、Asn426、Arg429，從晶體結構解析可知，該三聚體表位位于α2/α3、β3/β4的Loop環和另一個Protomer的β17/β18 Loop環。通過反應性分析發現AM14是特異性結合弗林蛋白酶切割后的Prefusion F三聚體，這是存在于病毒粒子表面的F成熟形態[38]。這些結果說明Prefusion F三聚體包含有單體F不具備的高中和表位，這更有助于設計RSV F疫苗抗原。

Prefusion新表位的發現對有效預防RSV感染的研究有著深遠影響。這些表位激發的抗體中和效價比Palivizumab強10倍以上，促進了針對F蛋白三聚體和Prefusion的抗體藥物的研發[13]。此外，由于Prefusion特異性抗體可以穩固F蛋白的Pre結構，有研究者便參考抗原抗體復合物結構對F蛋白進行改造，其中，Graham團隊利用D25與Site ?的結合界面對F進行突變來穩固Prefusion結構[50]，其中最好的突變體DS-Cav1，能在小鼠和恒河猴的體內免疫出高滴度中和抗體。而且Prefusion上有所有已知的中和表位[47]，這個特性更易于在體內激起高效價抗體。目前，以Prefusion為研究基礎的亞單位疫苗作為RSV候選疫苗也正在研發中[53]。

3 結語

綜上所述，近期關于RSV融合蛋白F結構、表位的研究，包括分離出新的F特異性抗體并由此發現新的高中和表位，都對RSV疫苗的發展起到了推動作用。目前對RSV F的Prefusion和Postfusion的結構以及中和表位結構的解析，讓研究者意識到特定的結構即可激起高效價的中和抗體，尤其是Prefusion構象上的表位。那么如何維持融合蛋白的Prefusion狀態或者設計出與高中和抗體表位類似結構就成為疫苗設計的關鍵。此外，疫苗可以通過這些抗體的結合表位結構為依托進行優化。在疫苗免疫后如何才能在體內激起高中和抗體且避免產生無用抗體則是目前研究者的主要探究方向。

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[收稿2017-03-17 修回2017-04-03]

(編輯 倪 鵬)

①本文為國家自然科學基金(No.81401668、No.81361120408)項目和國家自然科學基金委員會(NSFC)與美國國立衛生研究院(NIH)合作研究項目(No.81161120419)。

R373.1

A

1000-484X(2017)10-1568-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.028

曹健力(1992年-)，女，在讀碩士，主要從事呼吸道合胞病毒抗體改造及真核表達系統方面的研究，E-mail：jenny_cao422@163.com。

及指導教師：鄭子崢(1982年-)，男，博士，副教授，主要從事戊型肝炎病毒及呼吸道合胞病毒感染機制方面研究，E-mail:zhengzizheng@xmu.edu.cn。