Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變檢測在大腸癌治療和預(yù)后中的臨床價值研究

厲金雷　蔡劍輝　任約翰

[摘要] 目的 研究Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變與大腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系。 方法 隨機選擇我院2010年2月～2013年8月期間收治的240例大腸癌患者作為研究對象，取術(shù)后腫瘤組織標(biāo)本，檢測Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變并分析其與大腸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系。隨訪3年，分析Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變與患者的3年生存率的關(guān)系。 結(jié)果 240例患者Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變分別占2.50%、7.92%、43.75%、4.17%。Kras突變合并Pik3ca突變占3.75%。Braf突變合并Pik3ca突變占0.42%。Kras突變合并Nras突變1例，占0.42%。Nras基因突變僅與患者的年齡有關(guān)（P<0.05）。Braf基因突變僅與患者的腫瘤原發(fā)部位、分化程度以及術(shù)后是否復(fù)發(fā)有關(guān)（P<0.05）。Kras基因突變僅與患者的年齡和病灶大小有關(guān)（P<0.05）。Pik3ca基因突變與患者的腫瘤原發(fā)部位、分化程度有關(guān)（P<0.05）。Nras、Braf、Kras和Pik3ca基因突變大腸癌患者的3年生存率均低于野生型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 對大腸癌患者行Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變檢測可以為靶向治療提供科學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 大腸癌；Nras基因；Braf基因；Kras基因；Pik3ca基因；靶向治療

[中圖分類號] R735.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）23-0001-05

[Abstract] Objective To study the relationship between Nras， Braf， Kras， Pik3ca gene mutation and clinicopathological features of colorectal cancer. Methods A total of 240 patients with colorectal cancer who were treated in our hospital from February 2010 to August 2013 were selected. The tumor tissues were taken and the relationship between Nras， Braf， Kras， Pik3ca gene mutation and clinicopathological features of colorectal cancer were analyzed. The relationship between Nras， Braf， Kras， Pik3ca gene mutation and 3-year survival was analyzed for 3 years follow-up. Results 240 cases of Nras， Braf， Kras， Pik3ca gene mutation accounted for 2.50%， 7.92%， 43.75%， 4.17%. Kras mutations combined with Pik3ca mutations accounted for 3.75%. Braf mutation combined with Pik3ca mutation accounted for 0.42%. Kras mutation combined with Nras mutation in 1 case， accounting for 0.42%. The mutation of Nras gene was related to the age of the patient（P<0.05）. The mutations of Braf gene were related to the location of primary tumor， the degree of differentiation and postoperative recurrence（P<0.05）. Kras gene mutations were associated with age and lesion size（P<0.05）. Pik3ca gene mutation was associated with the primary site and differentiation of the tumor（P<0.05）. The 3-year survival rates of patients with Nras， Braf， Kras and Pik3ca mutations were lower than those of wild type， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Nras， Braf， Kras and Pik3ca mutations in patients with colorectal cancer can provide a scientific basis for targeted therapy.

[Key words] Colorectal cancer； Nras gene； Braf gene； Kras gene； Pik3ca gene； Targeted therapy

大腸癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居全球常見惡性腫瘤的第三位，死亡率位居第四位[1]。近年來其死亡率逐漸上升，傳統(tǒng)的手術(shù)治療和放化療已經(jīng)不能滿足日益增長的發(fā)病現(xiàn)狀。近年來精準(zhǔn)醫(yī)療理念逐漸被接受，大腸癌的治療也迎來靶向治療的時代[2，3]。近年來表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）單抗藥物在大腸癌中得到廣泛應(yīng)用[4]，其適用對象主要是Kras基因突變的患者，研究顯示EGFR信號通路下游的相關(guān)基因也能影響單抗藥物的靶向治療效果，這些基因包括Nras、Braf和Pik3ca[5，6]。因此，對大腸癌患者的Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因進(jìn)行檢測，研究Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變與大腸癌的臨床病理特征之間的關(guān)系，對大腸癌的靶向治療和預(yù)后具有重要的意義。本研究通過Sanger測序的方法對大腸癌患者Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變進(jìn)行檢測，并分析了Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變與患者臨床病理特征之間的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2010年2月～2013年8月期間經(jīng)手術(shù)切除的大腸癌標(biāo)本240例，其中男142例，女98例。患者的診斷參考2010年第三版世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）關(guān)于消化系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)中大腸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。所有切除的標(biāo)本組織采用10%甲醛固定后石蠟包埋，然后HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察患者腫瘤的病理學(xué)特征，記錄腫瘤的原發(fā)部位、腫瘤類型、分化程度、TNM（Tumor Node Metastasis）分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)類型、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況、腫塊大小。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計擴增引物序列設(shè)計的擴增 Nras基因的引物序列有：exon 2：F-5-GAACCAAATGGAAGGTCACACT-3；R：5-CCTCACCTCTATGGTGGGATC-3；exon 3：F-5-TAGCATTGCATTCCCTGTGGTT-3；R：5-CCTGTAGAGGTTAATATCCGCAA-3；exon 4：F-5-GCCACTGTACCCAGCTAATCTTG-3；R：5-CACATCTCTACCAGAGTTAATCAACTGATGC-3。設(shè)計的擴增Kras基因的引物序列有：exon 2：F-5-TACTGGTGGAGTATTTGATAG-3；R：5-TGGTCCTGCACCAGTAATATG-3；exon 3：F-5-GCACTGTAA-TAATCCAGACTGTG-3；R：5-CCCACCTATAATGG-TGAATATCTTC-3；exon 4：F-5-ATGACAAAAGTT-GTGGACAGGTTTTGA-3；R：5-ATGATTTTGCAGA-AAACAGATCTGTATTTATTTCAG-3。設(shè)計的擴增Braf基因的序列有：exon 15：F-5-CCTAAACTCTTCA-TAATGCTTGCTC-3；R：5-GTGGAAAAATAGCCTC-AATTCTTACC-3。設(shè)計的擴增Pik3ca基因的引物序列有：exon 9：F-5-TGTAATCATCTGTGAATCCAG-AGG-3；R：5-TGCTGAGATCAGCCAAATTCAG-3；exon 20：F-5-CAGGAGATGTGTTACAAGGCTTATC-3；R：5-ATGCTGTTTAATTGTGTGGAAGATC-3。引物序列參考李艷艷等[8]。

1.2.2 基因突變檢測 采用Qiagen公司的DAN FFPE Tissue Kit（Cat No：56404）抽提患者的腫瘤組織石蠟切片，具體操作步驟見試劑盒說明書。抽提DNA（deoxyribonucleic acid）后采用PCR擴增后直接對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序的方法檢測Nras、Kras、Braf和Pik3ca基因突變，PCR擴增體系為：10×PCR buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 mmol/L的上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，無酶水13 μL，LA Taq酶 0.1 μL，總體積20 μL。PCR擴增的反應(yīng)條件為95℃，5 min；95℃，30 s，56℃，45 s，72℃，20 s，40個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR完成后將PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司測序，測序結(jié)果采用Chromas軟件和Vector NTI 8.0軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料以[n（%）]表示，各基因突變與患者的一般資料之間的關(guān)系采用χ2檢驗，Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變與患者的生存率之間的關(guān)系采用Kaplan-Meier生存分析繪制生存曲線，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各基因突變與患者臨床病理特征之間的關(guān)系

本研究中240例患者共檢測到6例Nras基因突變，占2.50%；19例Braf基因突變，占7.92%；105例Kras基因突變，占43.75%；10例Pik3ca基因突變，占4.17%。Nras和Kras基因突變與患者的年齡有關(guān)，年齡≥65歲患者的突變明顯低于年齡<65歲的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），Braf基因突變與患者的癌癥原發(fā)部位、分化程度及術(shù)后是否復(fù)發(fā)有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Kras基因突變與患者的病灶大小有關(guān)，病灶≥3 cm的患者突變顯著高于病灶<3 cm的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Pik3ca基因突變與患者的原發(fā)部位、分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），患者的臨床病理特征與各基因突變情況之間的關(guān)系見表1。

2.2 Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變的類型和頻率

6例Nras基因突變中，G12D突變3例，占1.25%；G12C、Q61H、Q61K突變各1例，分別占0.42%。19例Braf基因突變中均為V600E型，占7.92%。105例Kras基因突變中，G12D突變63例，占26.25%；G12V突變10例，占4.17%；G12C突變6例，占2.50%；G12S突變5例，占2.08%；G12A突變4例，占1.67%；G13D突變8例，占3.33%；Q16H突變、Q16L突變、A146T突變各2例，分別占0.83%；K117N突變、A146P突變、A146V突變各1例，分別占0.42%。10例Pik3ca基因突變中E542K突變6例，占2.50%；E545K突變和H1047R突變各2例，分別占0.83%。見表2。endprint

2.3 雙基因突變情況統(tǒng)計

本次檢測中，Kras突變合并Pik3ca突變9例，分別為G12C/E542K突變、G12D/E542K突變、G12D/E545K突變、G12V/E542K突變、G12V/E545K突變、G13D/E542K突變、G13D/H1047R突變、Q61H/E542K突變、Q61H/H1047R突變各1例，各占0.42%。Braf突變合并Pik3ca突變1例，為V600E/E542K突變，占0.42%。Kras突變合并Nras突變1例，為Q61H/A146T突變，占0.42%。見表3。

2.4 大腸癌患者的Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變的生存分析

240例大腸癌患者均獲得了3年的隨訪，對隨訪結(jié)構(gòu)進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示Nras基因突變大腸癌患者的3年生存率為45.5%，野生型大腸癌患者3年生存率為96.3%，突變型低于野生型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=28.41，P=0.00）。Braf基因突變大腸癌患者的3年生存率為49.8%，野生型大腸癌患者3年生存率為94.2%，突變型低于野生型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=26.97，P=0.00）。Kras基因突變大腸癌患者的3年生存率為64.3%，野生型大腸癌患者3年生存率為93.3%，突變型低于野生型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=14.11，P=0.00）。Pik3ca基因突變大腸癌患者的3年生存率為49.0%，野生型大腸癌患者3年生存率為92.0%，突變型低于野生型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=18.14，P=0.00），見封三圖1。

3 討論

大腸癌的發(fā)生和發(fā)展是受多基因調(diào)控的一個復(fù)雜過程，EGFR基因是治療大腸癌的主要靶點之一[9，10]。研究顯示在EGFR信號通路中，除Kras基因外，還存在其他的耐藥機制發(fā)揮作用，如Braf基因突變、配體表達(dá)以及其他信號通路被激活等因素[11，12]。相關(guān)研究顯示，Kras的第二外顯子以外的基因突變能夠影響靶向治療的效果[13]，因此本研究的檢測范圍包含了Nras基因的第二和第三個外顯子、Braf基因的第15外顯子、Kras基因的第二、第三、第四外顯子以及Pik3ca基因的第九和第二十外顯子。相關(guān)研究顯示[14]，在Ras基因突變中，Kras占大多數(shù)，本研究結(jié)果顯示，Kras基因突變占43.75%（105/240），主要檢測到的突變類型為G12D、G12V、G12C、G12S、G12A、G13D、Q61H、Q61L、K117N、A146T、A146P、A146V，與相關(guān)研究結(jié)果一致[15]，其中第二外顯子的突變占總突變的91.43%（96/105），略高于相關(guān)研究結(jié)果[16]，

本研究認(rèn)為樣本量是造成該差異的主要因素之一，但是也不排除地域差異的影響。另外，本研究結(jié)果顯示，Kras基因突變與患者的年齡和病灶大小有關(guān)（P<0.05），與其他病理特征無關(guān)（P>0.05），患者年齡≥60歲、病灶≥3 cm時Kras基因突變率較高，對于臨床大腸癌患者的治療具有一定的指導(dǎo)意義，相關(guān)研究顯示，Kras基因突變與患者的性別、年齡、腫瘤的部位及腫瘤的分化程度等因素有關(guān)[17]，分析研究結(jié)果的差異，一方面可能是樣本數(shù)差異導(dǎo)致統(tǒng)計結(jié)果誤差，另一方面可能是地域差異等因素。

據(jù)相關(guān)研究結(jié)果顯示[18]，Nras基因突變在血液腫瘤中比較常見，在羅馬尼亞人種中Nras基因突變的頻率為9.0%～10.21%，明顯高于本研究的2.50%，國內(nèi)有研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致[8]，本研究中也未能檢測到第四外顯子突變，與相關(guān)研究結(jié)果一致[8]，說明我國大腸癌患者中Nras基因的第四外顯子突變率很低。Nras基因突變與患者的年齡有關(guān)（P<0.05），與其他病理特征無關(guān)（P>0.05），分析原因可能是由于樣本量限制使檢出的Nras基因突變較少。本研究檢測到7.92%（19/240）的Braf基因突變，與相關(guān)研究報道的Braf突變范圍一致[19]，本研究結(jié)果顯示，Braf基因突變與患者的腫瘤原發(fā)部位、分化程度以及術(shù)后是否復(fù)發(fā)有關(guān)（P<0.05），與相關(guān)研究結(jié)果一致[20]，但是與有關(guān)研究不同的是本研究并未發(fā)現(xiàn)不同性別的大腸癌患者Braf基因突變概率之間存在明顯差異。另外，本研究發(fā)現(xiàn)Braf突變的患者術(shù)后更容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，推測Braf基因突變可能是大腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險因素。近年來，Pik3ca基因突變成為大腸癌患者研究的熱點之一并受到廣泛關(guān)注[21]。本研究結(jié)果顯示，Pik3ca基因突變率為4.17%，與國內(nèi)有關(guān)研究結(jié)果一致[8]，明顯低于國外有關(guān)研究結(jié)果[22]，分析原因可能是Pik3ca基因突變與人種差異有關(guān)，不同人種之間Pik3ca基因突變的位點不一致，本研究僅檢測到E542K、E545K和H1047R三個突變位點，是否還存在其他位點突變可能是影響該基因突變率不同的因素，本文不作深入討論。從本研究結(jié)果可以看出，Pik3ca基因突變與患者的腫瘤原發(fā)部位、分化程度有關(guān)（P<0.05），與其他病理特征無關(guān)（P>0.05），右半結(jié)腸癌、分化程度高的患者Pik3ca基因突變率較高。有關(guān)研究顯示，Pik3ca基因突變與大腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[23]。有研究顯示，Pik3ca基因突變可能導(dǎo)致Kras野生型大腸癌患者對于EGFR單抗藥物不敏感[24]，因此推測Pik3ca基因突變可能解開EGFR耐藥機制的謎團(tuán)，成為治療大腸癌的新靶點。另外，本研究結(jié)果顯示，大腸癌患者的Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變后其生存率均明顯下降，顯示大腸癌患者的Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變篩查具有顯著的臨床意義，可以作為轉(zhuǎn)移性大腸癌治療和預(yù)后的重要指標(biāo)進(jìn)行臨床檢測從而指導(dǎo)臨床靶向治療。

綜上所述，Nras基因突變與患者的年齡有關(guān)，Braf基因突變與患者的腫瘤原發(fā)部位、分化程度及術(shù)后是否復(fù)發(fā)有關(guān)，Kras基因突變與患者的年齡和病灶大小有關(guān)，Pik3ca基因突變與患者的腫瘤原發(fā)部位、分化程度有關(guān)，對大腸癌患者行Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變檢測可以為靶向治療提供指導(dǎo)。endprint

[參考文獻(xiàn)]

[1] 任建松，石菊芳，張洪召，等. 2012-2013年中國城市人群大腸癌篩查結(jié)果初步分析[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2015，49（5）：441-443.

[2] 沈胤晨，石遠(yuǎn)凱，韓曉紅. 結(jié)直腸癌靶向治療研究進(jìn)展[J].中華病理學(xué)雜志，2015，44（6）：430-433.

[3] Russo M，Siravegna G，Blaszkowsky LS，et al. Abstract 878：Tumor heterogeneity and lesion-specific response to targeted therapy in colorectal cancer[J]. Cancer Discovery，2016，76（14 Supplement）：878.

[4] 楊悅，萬義增，陳素賢，等. 結(jié)直腸癌組織中EGFR及HER-2的表達(dá)及臨床意義[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志，2015，31（6）：615-618.

[5] Therkildsen C，Bergmann TK，Henrichsen-Schnack T，et al.The predictive value of KRAS，NRAS，BRAF，PIK3CA and PTEN for anti-EGFR treatment in metastatic colorectal cancer：A systematic review and meta-analysis[J]. Acta Oncologica，2014，53（7）：852-864.

[6] Liu J，Hu J，Cheng L，et al. Biomarkers predicting resistance to epidermal growth factor receptor-targeted therapy in metastatic colorectal cancer with wild-type KRAS[J].Oncotargets& Therapy，2016，9（Issue 1）：557.

[7] Hamilton SR，Aaltonen LA. Pathology and genetics of tumours of the digestive system[J]. Histopathology，2010， 38（6）：585.

[8] 李艷艷，高靜，楊蕊，等. 結(jié)直腸癌Ras、BRAF和PIK3CA基因突變分析及與臨床病理特征的關(guān)系[J]. 臨床腫瘤學(xué)雜志，2016， 21（1）：27-33.

[9] 宋均飛，劉弋. EGFR、HER2在結(jié)直腸癌患者血清與組織中的表達(dá)及其臨床意義分析[J]. 中華疾病控制雜志，2016，20（4）：403-407.

[10] 王銘. 大腸癌治療中EGFR耐藥相關(guān)分子[J]. 中國腫瘤生物治療雜志，2017，24（3）：17-20.

[11] Yao S，Wang X，Li C，et al. Kaempferol inhibits cell proliferation and glycolysis in esophagus squamous cell carcinoma via targeting EGFR signaling pathway[J]. Tumor Biology，2016，37（8）：10247-10256.

[12] Alvarez K，Orellana P，Villarroel C，et al. Abstract 2232：Next generation sequencing of the EGFR signaling pathway in colon cancer tumors from Chilean patients[J]. Cancer Research，2014，74（19 Supplement）：2232.

[13] 葉美華，何向蕾，來茂德. 結(jié)直腸癌KRAS基因突變檢測方法的應(yīng)用和評價[J]. 中華病理學(xué)雜志，2015，44（6）：427-429.

[14] 王倩，頤頁，林潔. 高分辨率熔解曲線分析法檢測結(jié)直腸癌組織K-ras基因突變及其臨床意義[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2015，28（8）：840-842.

[15] 劉珊，王丹，盧福昱，等. 結(jié)直腸癌組織中K-ras基因突變情況及其臨床意義[J]. 山東醫(yī)藥，2015，55（36）：220.

[16] 張凱，顧滕振. 結(jié)直腸癌組織K-ras、BRAF及PIK3CA基因突變的檢測及其與臨床病理特征的關(guān)系[J]. 廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2016，33（2）：299-301.

[17] Chang YY，Lin PC，Lin HH，et al. Mutation spectra of RAS gene family in colorectal cancer[J]. American Journal of Surgery，2016，212（3）：537-544.

[18] Negru S，Papadopoulou E，Apessos A，et al. KRAS， NRAS and BRAF mutations in Greek and Romanian patients with colorectal cancer：A cohort study[J]. Bmj Open，2014，4（5）：e004652.

[19] Cicenas J，Tamosaitis L，Kvederaviciute K，et al. KRAS， NRAS and BRAF mutations in colorectal cancer and melanoma[J]. Medical Oncology，2017，34（2）：26.

[20] 孫屏，萬佳藝，吳靚驊，等. 結(jié)直腸癌KRAS、NRAS和BRAF基因突變及其與臨床病理相關(guān)性研究[J]. 中華普通外科雜志，2016，31（1）：50-54.

[21] Sartorebianchi A，Martini M，Molinari F，et al. PIK3CA Mutations in Colorectal Cancer Are Associated with Clinical Resistance to EGFR-Targeted Monoclonal Antibodies[J]. Cancer Research，2009，69（5）：1851-1857.

[22] Normanno N，Rachiglio A M，Lambiase M，et al. Heterogeneity of KRAS，NRAS，BRAF and PIK3CA mutations in metastatic colorectal cancer and potential effects on therapy in the CAPRI GOIM trial[J]. Annals of Oncology，2015，26（8）：1710.

[23] Foltran L，De M G，Pella N，et al. Prognostic role of KRAS，NRAS，BRAF and PIK3CA mutations in advanced colorectal cancer[J]. Future Oncology，2015，11（4）：629-640.

[24] 許仲寧，楊宇飛. 晚期大腸癌患者中醫(yī)證素與KRAS、BRAF、NRAS基因突變情況的相關(guān)性研究[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，36（12）：1445-1448.

（收稿日期：2017-05-18）endprint