基于Th細胞平衡探討“宣降清”三法對RSV感染幼齡大鼠T-bet、GATA3表達的影響＊

崔振澤，徐 超，黃 燕＊＊

（1.大連市兒童醫院 116000）

基于Th細胞平衡探討“宣降清”三法對RSV感染幼齡大鼠T-bet、GATA3表達的影響＊

崔振澤1，徐 超1，黃 燕1＊＊

（1.大連市兒童醫院 116000）

目的：觀察定喘湯“宣降清”三法對呼吸道合胞病毒（Respiratorysyncytical virus，RSV）感染幼齡大鼠肺組織內T-bet、GATA3、和血清中IFN-γ、IL-4的表達的影響，并進一步闡明該方藥對調節Th1/Th2免疫平衡的作用機制。方法：選健康幼齡Wistar大鼠54只隨機分為6組，即正常組、RSV模型組、定喘湯組、分解劑組（包括宣、降、清三組），每組各9只。除正常組外，余各組用RSV（Long珠）病毒予大鼠滴鼻造模，滴鼻2h后各干預治療組分別予相應的藥物灌胃，正常組和RSV模型組均以等體積的生理鹽水灌胃。采用Western Blot法檢測各組大鼠肺組織中T-bet和GATA3的蛋白表達水平，ELISA法檢測各組大鼠血清中INF-γ和IL-4細胞因子的含量。結果：1、定喘湯及各分解劑組均可不同程度的調節RSV感染后大鼠的一般狀態和降低RSV感染后的肺指數（P＜0.05）；2、RSV模型組和各干預組大鼠較正常組比較肺組織中T-bet蛋白表達均降低、GATA3蛋白表達均升高且具有顯著性差異（P＜0.05），定喘湯及宣法組與RSV模型組比較均可上調T-bet蛋白表達及下調GATA3蛋白表達且具有顯著性差異（P＜0.05）；3、RSV模型組大鼠血清中INF-γ含量明顯降低、IL-4含量升高與正常組比較均具有顯著性差異（P＜0.05），與模型組比較，定喘湯組可上調INF-γ含量、各干預組藥物均可下調IL-4含量且具有統計學意義（P＜0.05）。結論：定喘湯“宣降清”三法對于RSV感染幼齡大鼠后體內T-bet及INF-γ細胞因子具有明顯升高作用，而對GATA3及IL-4細胞因子則有明顯抑制效果，其具有調節Th1/Th2細胞免疫平衡能力，為定喘湯防治RSV感染有效性的重要機制之一。

宣降清 RSV 大鼠 Th1/Th2

呼吸道合胞病毒（Respiratorysyncytical virus，RSV）流行廣泛，是引起嬰幼兒嚴重下呼吸道感染（如細支氣管炎，支氣管炎或肺炎）的主要原因，因而被世界公認為重要的感染性致病原[1]。越來越多的研究表明[2-3]，Th1/Th2細胞功能和比例失衡是RSV感染最重要的免疫異常，是RSV感染發病機制中的重要環節。而T盒轉錄因子（T-bet）和鋅指蛋白3（GATA-3）又分別是Th1和Th2細胞特異的轉錄因子，在各自Th細胞分化過程中中起重要作用。因此有決定Th1/h2細胞分化的特異轉錄因子T-bet和GATA-3已成為近年來研究的熱點，且探討T-bet/GATA-3平衡對于明確RSV感染的發病機制及探索在此環節上進行的干預治療具有重要意義。

而針對RSV感染所致喘息，中醫認為肺之宣發與肅降失衡，肺氣閉塞不通為喘息之主因，西醫學者則公認Th1/Th2功能失衡為其主要病機。且前期研究已證實[4]定喘湯對RSV感染大鼠的細胞免疫具有良性調節作用，那么該方對RSV感染后機體的Th1/Th2免疫失衡是否有影響作用值得思考。對此，本文就基于定喘湯獨特的“宣降清”三法理論為基礎來探討RSV感染后引起的Th1/Th2免疫失衡機制，以期為探求中西醫相通的發病機制及治療方法提供有力依據。

1 材料

1.1 病毒

RSV Long株，來源于中國預防醫學科學院病毒所毒種室，凍存于-80℃冰箱備用。測定大鼠RSV病毒半數致死量LD50為10-2/ml。

1.2 動物

健康3周齡左右的wistar大鼠54只，雌雄各半，SPF級，體重均為（30±10）g，由遼寧本溪長生生物技術有限公司提供。

1.3 藥物

定喘湯購于遼寧中醫藥大學附屬醫院中藥局。定喘湯組由麻黃 9 g，杏仁 9 g，半夏 9 g，蘇子 6 g，黃芩12 g，桑白皮9 g，白果9 g，款冬花9 g，甘草3 g組成；其中麻黃9 g，白果9 g組成宣法組；杏仁9 g，半夏9 g，蘇子6 g，款冬花9 g組成降法組；黃芩12 g，桑白皮9 g組成清法組。將以上各組藥物均按照傳統方法水煎2次混合后，制成含生藥2 g·ml-1的藥液備用。

1.4 主要設備與試劑

電泳儀（DYY-10C）；全外排Ⅱ級生物安全柜（SG403TXCE,美國Baker公司）；MicroChemi化學發光成像系統（MicroChemi4.2）；SDS-PAGE凝膠試劑盒（碧云天）；T-bet、GATA3抗體（由北京博奧森生物技術有限公司）；INF-γ、IL-4試劑盒（美國Ramp;D Systems公司）。

2 方法

2.1 分組

依據隨機數字表法，將wistar大鼠均分為6組，即正常組、RSV模型組、定喘湯組、宣法組、降法組及清法組，每組9只。

2.2 造模

采用病毒液滴鼻法進行造模，即除正常組外，其余各組在乙醚麻醉下經鼻腔接種RSV Long株病毒液，0.1 ml/只，正常組在同等條件下接種等量不含病毒的生理鹽水，每日1次，連續接種3天。

2.3 給藥

各組在RSV Long株病毒液滴鼻2 h后開始灌胃，各干預組給藥劑量相當于60 kg成人臨床等效量，正常組與RSV模型組均予等體積的生理鹽水灌胃，1次/日。所有大鼠均在同一條件下飼養，正常飲食，自由飲水。（人與大鼠等效劑量公式為：大鼠的劑量=6.3X mg·Kg-1）

2.4 取材及指標測定

各組大鼠分別于感染第7天取血后處死，將血置于血清分離管中，放置2小時，3000 r·min-1離心15 min，收集血清，后置于4℃度冰箱內保存，待進行INF-γ和IL-4含量的ELISA檢測。無菌條件下取鼠肺組織，用于肺指數測定、SABC免疫組織化學法檢測及Western blotting檢測。

2.5 檢測方法

2.5.1 肺指數測定

稱各組大鼠肺臟重量，計算肺指數。肺指數=肺臟重量（g）/體重（g）×100%。

2.5.2 Western blotting檢測

取出凍存的肺組織制備勻漿，進行總蛋白提取，并測定蛋白濃度。取40-60 μg的蛋白樣品于12%SDS-PAGE凝膠中進行電泳，待目的蛋白接近凝膠底部時(以蛋白質分子量Marker確定T-bet和GATA3的所在位置）停止電泳，4℃、120 V恒壓電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再加入抗T-bet、GATA3（1：1000）抗體，4℃封閉過夜，洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗（1∶1000），室溫封閉1 h后發光顯影，凝膠成像系統照相。實驗結果采用Image J軟件分析，掃描灰度值，T-bet和GATA3的蛋白水平通過其Western blotting曝光條帶亮度與GAPDH相應條帶亮度比值來確定。

2.5.3 SABC免疫組織化學法檢測

切片脫蠟至水，3%H2O2，室溫10 min滅活內源性酶，水洗3次，每次5 min。加入復合消化液修復抗原20 min，滴加5%BSA封閉液，室溫放置20 min。滴加兔抗鼠TSLP抗體（1∶100倍稀釋），濕盒內4℃過夜，每一批染色均設陰性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。次日取出濕盒至室溫，PBS清洗3次，每次2 min。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃放置20 min，PBS清洗3次，每次2min。滴加試劑SABC，37℃放置20 min，PBS清洗3次，每次5 min。DAB室溫顯色10 min，純凈水洗滌。脫水、透明、中性樹膠封片。用光學顯微鏡觀察，每張切片任選5個視野（×200），采集圖像后用圖像分析系統對結果進行半定量分析。陽性結果判定：以病變部位細胞上出現棕黃色顆粒為陽性表達，測定肺組織中陽性細胞的積分光密度值（IOD)，以均值作為該樣本TSLP的相對表達，IOD值越大，說明其表達越多。

2.5.4 ELISA檢測

具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。

2.6 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件，數據以xˉ±s來表示，采用單因素方差分析對各組進行比較分析，組間比較均選用LSD法，校正法選用Bonferroni法，P＜0.05差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況比較

實驗過程中，正常組大鼠精神狀態均保持良好，反應靈活，行動敏捷，毛發潔白有光澤，活動、飲食、飲水、呼吸頻率均正常，體重逐漸增加；RSV模型組大鼠較正常組比較，反應遲鈍，精神萎靡，行動緩慢，呼吸頻率加快，飲水、食量嚴重減少，體重嚴重減輕；定喘湯組大鼠較模型組比較，毛色潤澤，反應靈活，呼吸較平穩，飲食、飲水略減少，體重接近正常；宣、降、清組與定喘湯組比較，分別有不同程度的精神狀態不佳，毛色失去光澤，倦怠少動，飲食、飲水量減少，體重減輕。

3.2 定喘湯對RSV感染大鼠肺指數的影響

于實驗第7天（從第0天開始）測定正常組、RVS模型組及各藥物干預組大鼠肺指數，變化情況見表1。

結果顯示，與正常組比較，RSV模型組及其余各組大鼠的肺指數均有明顯增高且具有顯著性差異（P＜0.05）；與RSV模型組比較，各干預組大鼠肺指數均有不同程度的降低，具有顯著性差異（P＜0.05）；與定喘湯比較，降法和清法組大鼠的肺指數增高有統計學意義（P＜0.05）。

3.3 定喘湯對RSV感染大鼠肺組織T-bet、GATA3蛋白表達情況的影響

于實驗第7天（從第0天開始）取材，采用WB法測定正常組、RVS模型組及各藥物干預組大鼠肺組織的T-bet、GATA3蛋白表達。檢測的T-bet為聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜在相應分子量區域（59 KDa）一條長方形抗原條帶，PVDF膜在相應分子量區域（49 KDa）一條長方形抗原條帶即為所檢測的GATA3組織蛋白條帶，具體情況見圖1及表2。

表1 各組大鼠肺指數測定結果

圖1 各組大鼠肺組織T-bet、GATA3蛋白表達情況

表2 各組間肺組織WB檢測T-bet、GATA3的蛋白含量結果 (±s)

表2 各組間肺組織WB檢測T-bet、GATA3的蛋白含量結果 (±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▼P＜0.05；與定喘湯組比較，ΔP＜0.05

組別正常組RSV模型組定喘湯宣法組降法組清法組例數9 9 9 9 9 9 T-bet 1.17±0.08 0.32±0.03*0.86±0.07*▼0.44±0.04*▼Δ 0.34±0.04*Δ 0.33±0.03*Δ GATA3 1.4±0.03 2.3±0.04*1.84±0.05*▼2.05±0.08*▼Δ 2.27±0.04*Δ 2.28±0.03*Δ

蛋白組學層面結果顯示，與正常組比較，RSV模型組與各干預組大鼠肺組織中T-bet蛋白表達量均降低且具有統計學意義（P＜0.05），GATA3蛋白表達量均升高且具有顯著性差異（P＜0.05）；與RSV模型組比較，定喘湯組及宣法組均可上調T-bet蛋白表達量及下調GATA3的蛋白表達量（P＜0.05）；與定喘湯組比較，各分解劑組的T-bet蛋白表達量均降低且具有顯著性差異（P＜0.05），GATA3蛋白表達量均升高且具有顯著性差異（P＜0.05）。

3.4 定喘湯對RSV感染大鼠肺組織T-bet、GATA3表達量的影響

圖2 各組大鼠肺組織T-bet表達情況（免疫組化X200）

圖3 各組大鼠肺組織GATA3表達情況（免疫組化X200）

于實驗第7天（從第0天開始）取材，采用免疫組化法測定正常組、RVS模型組及各藥物干預組大鼠肺組織的T-bet、GATA3表達量。正常組大鼠T-bet陽性表達呈棕色細顆粒狀，定位于肺間質肺泡璧內大部分細胞上，RSV模型組T-bet肺間質基本不著色，其余各治療組均部分著色。正常組大鼠肺組織GATA3在肺間質肺泡璧細胞上基本不著色，RSV模型組大鼠GATA3肺間質大部分細胞著色，其余各治療組均部分著色。各組免疫組化法測定T-bet表達見圖2，GATA3表達見圖3，兩指標分析見表3。

組織細胞層面結果顯示，與正常組比較，RSV模型組與各干預組大鼠肺組織中T-bet表達量均降低且具有統計學意義（P＜0.05），GATA3表達量均升高且具有顯著性差異（P＜0.05）；與RSV模型組比較，定喘湯組及宣法組均可上調T-bet表達量且具有統計學意義（P＜0.05），定喘湯組及各分解劑組均可下調GATA3表達量且具有統計學意義（P＜0.05）；與定喘湯組比較，各分解劑組的T-bet表達量均降低且具有顯著性差異（P＜0.05），GATA3蛋白表達量均升高且具有顯著性差異（P＜0.05）。

3.5 定喘湯對RSV感染大鼠血清中INF-γ、IL-4細胞因子含量的影響

于實驗第7天（從第0天開始）取材測定正常組、RVS模型組及各藥物干預組大鼠血清中的INF-γ、IL-4細胞因子含量，具體情況見下表：

與正常組比較，RSV模型組大鼠血清中INF-γ含量明顯降低且具有統計學意義（P＜0.05），IL-4含量顯著升高且具有統計學意義（P＜0.05）；與RSV模型組比較，定喘湯組可上調INF-γ含量（P＜0.05），各干預組藥物均可下調IL-4含量（P＜0.05）；與定喘湯組比較，宣、降、清三組大鼠血清中兩種指標含量變化不明顯，無明顯差異（P＞0.05）。

4 討論

RSV感染所致的毛細支氣管炎和（或）肺炎屬中醫學“肺炎喘嗽”，其病因主要為外邪入侵肺衛，致使肺失肅降，閉郁不宣，化熱爍津為痰，肺氣又不通，致痰、熱、氣三者相互阻滯，則出現喘咳、呼吸急促、鼻煽、發熱、痰黃稠等癥狀。針對此癥候群，源于《攝生眾妙方》的定喘湯運用“方從法出、法隨證立”的理論依據，對于肺氣不通、郁而化熱，以致痰熱互結、肺失宣降引起的喘息，功效甚佳。定喘湯君以宣法，臣以降法，佐以清法，融三法于一體，宣肺、降肺、清肺相輔相成，共湊定喘之功。而對于RSV感染后引起的喘息，肺之宣發與肅降失衡、免疫應答的Th1與Th2失衡定有著不可言表的密切關系。

生理狀態下，機體內T細胞（Th0、Th1、Th2）及所分泌的各類細胞因子以網絡形式存在并發揮作用，如Th0細胞按照一定比例向Th1和Th2分化，細胞因子間或相互協同、促進，或相互拮抗，分別行使各自不同的生理功能，來調節正常的免疫應答，以維持機體在生理或病理水平上的平衡[5]。機體感染病毒后，其體內T細胞及所分泌的細胞因子形成的網絡平衡即被打破，出現多種形式的改變，如Th1向Th2漂移、Th1向Th0漂移等反應[6]。其中，T-bet細胞因子為Th1細胞系特異轉錄因子，其不僅對Th1細胞的發育有良好的促進作用，同時又可抑制Th2細胞因子的合成；它在Th1細胞活化過程中可激活IFN-γ的基因轉錄，而IFN-γ又可以逆向上調T-bet的表達水平，形成自分泌反饋環，來進一步誘導Th0向Th1細胞分化；甚至T-bet都可以將已分化的Th2型細胞逆轉為Th1型細胞，同時可產生大量IFN-γ細胞因子[7]，進而影響Th系統向Th1優勢發展。而對于Th2反應，雖然多種細胞因子均可激活Th2系統，但GATA-3卻是Th2細胞特異性轉錄因子，其不僅Th2細胞極化過程中起關鍵作用，還是Th2型細胞因子轉錄所必需的，主要是通過白細胞介素4（IL-4）基因啟動子上的兩個GATA-3結合位點直接激活IL-4，而激活IL-4又促進了Th2細胞的增殖及分化，參與所有Th2型細胞因子的轉錄[8]。由此可見，體現機體免疫狀態的Th1/Th2極化與T-bet、GATA-3的表達密切相關，即T-bet、GATA-3決定了Th1/Th2平衡的穩定性，因此探討T-bet/GATA-3的平衡對于明確RSV感染的發病機制及在此環節上的干預治療具有重要意義。本次實驗結果顯示：RSV感染后的幼齡大鼠體內T-bet及IFN-γ水平明顯降低，而GATA-3及IL-4水平則顯著增高。一方面提示這幾種細胞因子可能參與了RSV發病過程中機體的炎癥反應，指標含量的變化可進一步證明參與了Th1與Th2之間的轉化過程；另一方面提示T-bet與GATA-3轉錄因子反向的失衡表達很可能是通過調節細胞因子IFN-γ、IL-4的失衡表達，引起以IFN-γ為主的Th1型細胞因子分泌減少，和以IL-4為主的Th2型細胞因子分泌亢進，進而介導炎性細胞的滲出與趨化，參與炎癥病理性損害，激發了機體的免疫應答系統，引起RSV感染急性期的免疫功能紊亂。

表3 各組間肺組織免疫組化檢測T-bet、GATA3的積分光密度值測定結果(±s)

表3 各組間肺組織免疫組化檢測T-bet、GATA3的積分光密度值測定結果(±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▼P＜0.05；與定喘湯組比較，ΔP＜0.05

組別正常組RSV模型組定喘湯宣法組降法組清法組例數9 9 9 9 9 9 T-bet 53.76±0.44 19.92±2.84*43.5±2.3*▼27.39±1.74*▼Δ 21.14±1.53*Δ 21.28±1.14*Δ GATA3 57.99±0.42 92.78±1.46*64.59±2.2*▼82.34±1.34*▼Δ 84.92±1.6*▼Δ 82.62±1.2*▼Δ

表4 定喘湯對大鼠血清INF-γ、IL-4細胞因子含量的影響 (±s,n=9)

表4 定喘湯對大鼠血清INF-γ、IL-4細胞因子含量的影響 (±s,n=9)

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▼P＜0.05；與定喘湯組比較，ΔP＜0.05

組別正常組RSV模型組定喘湯宣法組降法組清法組例數9 9 9 9 9 9 INF-γ 16.21±4.67 12.6±2.54*16.04±3.04▼13.35±2.00 12.93±2.67 12.81±2.37 IL-4 17.17±2.06 26.01±6.11*18.2±4.08▼18.77±3.81▼18.74±4.02▼19.45±6.35▼

針對RSV病毒導致的Th1/Th2細胞功能的異常或失衡，本研究運用定喘湯及宣、降、清分解劑對RSV感染后的幼齡大鼠進行了干預，結果顯示，各干預組均不同程度的上調了T-bet、IFN-γ表達量及下調了GATA-3、IL-4細胞因子的含量，說明定喘湯及各宣、降、清分解劑均可不同程度的調節Th1/Th2的免疫失衡。尤其對于定喘湯組及宣法組而言，調節Th1/Th2細胞功能失衡的效果更加顯著（P＜0.05）。宣法由麻黃和白果組成，其中麻黃辛溫，宣肺平喘；白果甘澀，斂肺定喘；兩藥合用，收散自如，相得益彰，即宣法以宣散與收斂并用來調節Th1/Th2的失衡。而集“宣、降、清”三法為一體的定喘湯對Th1/Th2的異常漂移具有更優的調節作用，白果與麻黃收散發揮，合為君藥；杏仁降肺以止咳、款冬花溫肺化痰以止咳、半夏降逆化痰以止嘔、蘇子降氣以平喘，四藥共用為臣藥；黃芩、桑白皮皆性苦寒，清熱瀉肺以平喘，解內蘊之痰熱，二者合為佐藥；甘草調和諸藥，用以使藥；以上諸藥合用，使定喘湯的宣發與清降之法在調節RSV感染后機體Th1/Th2的免疫失衡方面更具優勢。

綜上所述，RSV感染后的免疫病理機制主要是Th1/Th2細胞功能的異常或失衡，其也可能是RSV感染日后演變為哮喘的重要機制之一。而定喘湯的“宣、降、清”三法在調節Th1/Th2的免疫失衡方面，可以逆轉機體向Th2系統過度漂移狀態，最終達到Th1/Th2細胞的平衡，從而達到治療RSV感染后喘息性疾病的目的。

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Study on Effect of“Xuan-Jiang-Qing”Theory on Expression of T-bet and GATA3 among Young Rats Infected with RSV Based on Th Cell Balance

Cui Zhenze,Xu Chao,Huang Yan
(Dalian Children’s Hospital,Dalian 116000,China)

This study was aimed to observe the method of“Xuan-Jiang-Qing”of Ding-Chuan(DC)decoction on the expression of T-bet and GATA3 of lung tissues,IFN-γ and IL-4 in serum of young rats infected with respiratory syncytial virus(RSV),in order to further explore the mechanism of Th1/Th2 immune balance.A total of 54 ealthy young Wistar rats were randomly divided into 6 groups,which were the normal group,RSV model group,DC decoction group,ascending(Xuan)therapy group,descending(Jiang)therapy group,pyretic clearing(Qing)therapy group,with 9 rats in each group.Except the normal group,rats in other groups were with RSV(Long bead)virus to establish the animal model.Two hours after intranasal medication,intragastric administration of corresponding medication was given to each intervention group.And equal volume of normal saline was given to the normal group and the RSV model group.Levels of T-bet and GATA3 protein in lung tissues were detected by Western blotting.Levels of INF-γ and IL-4 cytokines in serum were detected by ELISA.The results showed that DC decoction and each decomposing agent group can adjust the general condition of RSV infection and reduce the lung index after RSV infection(P＜0.05).Compared with the normal group,the expression of T-bet protein in lung tissues was decreased and the expression of GATA3 protein was significantly higher in the RSV model group and each intervention group with significant difference(P＜0.05).The expression of T-bet protein was up-regulated and the expression of GATA3 protein was down-regulated in DC decoction and ascending(Xuan)therapy group compared to the RSV model group with significant difference(P＜0.05).Compared with the normal group,the content of INF-γ in serum of RSV model group was significantly decreased,and the content of IL-4 was increased with significant difference(P＜0.05).Compared with the model group,DC decoction group can increase the content of INF-γ,and each intervention group can reduce the IL-4 content with statistical significance(P＜0.05).It was concluded that the method of“Xuan-Jiang-Qing”of DC decoction can obviously increase T-bet and INF-γ cytokines,and inhibit GATA3 and IL-4 cytokines among RSV infected young rats.It can regulate Th1/Th2 cell immune balance.It is one of the important effectiveness mechanisms to prevent and treat RSV infection.

Xuan-Jiang-Qing,RSV,rat,Th1/Th2

10.11842/wst.2017.08.008

R725.6

A

2017-05-11

修回日期：2017-07-20

＊ 國家自然科學基金（No.81473726）：定喘湯“宣降清三法”干預合胞病毒感染T-bet哮喘易感基因及代謝組學研究，負責人：崔振澤。遼寧省自然科學基金（2014020173）：呼吸道合胞病毒感染后T-bet基因多態性及TSLP表達的研究，負責人：崔振澤。

＊＊ 通訊作者：黃燕（1963—），女（漢族），遼寧大連人，大連市兒童醫院呼吸科主任，碩士研究生導師，主要從事變態反應性疾病及小兒呼吸系統疾病研究工作。

（責任編輯：韓覆蔓，責任譯審：王 晶）