基于抑郁模型大鼠miR-665表達及靶基因功能分析探討開心解郁方抗抑郁療效機制＊

王聯生，黃世敬，潘菊華，王彥云，張 穎，陳宇霞

（中國中醫科學院廣安門醫院 北京 100053）

基于抑郁模型大鼠miR-665表達及靶基因功能分析探討開心解郁方抗抑郁療效機制＊

王聯生，黃世敬＊＊，潘菊華，王彥云，張 穎，陳宇霞

（中國中醫科學院廣安門醫院 北京 100053）

目的：通過考察中藥開心解郁方干預抑郁癥模型大鼠海馬miR-665表達變化并對miR-665的靶基因進行生物信息分析，探討miR-665在抑郁癥的發病及開心解郁方抗抑郁機制中的作用。方法：建立慢性應激抑郁癥大鼠模型并用開心解郁方干預42天，取海馬組織提取總RNA，采用RT-qPCR檢測各組大鼠海馬miR-665相對表達量，并采用TargetScan和microRNAorg數據庫對miR-665進行靶基因預測，采用DAVID數據庫對預測得到的靶基因進行GO功能富集分類及KEGG信號通路分析。結果：與正常組比較，模型組大鼠海馬miR-665表達水平顯著增高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組及西藥組大鼠海馬miR-665表達水平顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。miR-665靶基因的生物學功能主要富集于有機物質反應等；信號通路主要富集于N-糖鏈的合成等。結論：miR-665可能參與了抑郁癥病理機制過程調控，通過改善其表達異常可能為開心解郁方的抗抑郁機制之一，通過對其靶基因的功能預測分析對于后期繼續研究開心解郁方干預miR-665的具體作用機制提供了方向和理論基礎。

抑郁癥 miR-665 生物信息分析 開心解郁方

抑郁癥是一種以顯著而持久的抑郁狀態為特征的常見的情感障礙性疾病，該病具有高治病率、高致殘率及高復發率等特點，對患者的身心健康帶來嚴重危害。據世界衛生組織（WHO）2012年統計目前全世界抑郁癥患者約有3.5億，每年因該病自殺者近百萬人[1]。抑郁癥為多因素共同致病，其形成的神經生物學機制至今了解有限。一般認為與神經遞質改變、神經內分泌免疫功能失調、神經元可塑性及神經再生障礙有關。中醫藥在抑郁癥的防治過程中發揮了重要的作用，開心解郁方為臨床上治療抑郁癥的有效方劑。本實驗室前期研究發現開心解郁方具有明顯抗抑郁臨床療效，其作用機制與改善神經元損傷、保護血腦屏障、調節情感調節因子5-羥色胺（5-HT）及其受體亞型的表達等有關[2-4]。

miRNA是近年來發現的與疾病密切相關的小分子RNA[5]，可通過調控神經元的生成、神經可塑性及信號傳導通路關鍵性元件的基因表達等參與抑郁癥的病理過程[6,7]。miR-665是新近發現的一個與中樞神經系統功能密切相關的miRNA分子，在海馬神經元的凋亡及神經保護過程中具有調控作用[8]。本研究旨在探討中藥開心解郁方對慢性應激抑郁模型大鼠海馬miR-665表達影響，并應用生物信息學方法對miR-665的靶基因進行功能分析，為抑郁癥的防治以及中醫藥治療抑郁癥提供新的理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選擇成年健康雄性SD大鼠，體重220±20 g，（由北京維通利華實驗動物中心提供），動物合格證號：SCXK（京）2012-0001，。

1.2 實驗藥物

開心解郁丸由人參、柴胡、赤芍、茯苓、遠志等組成（中國中醫科學院廣安門醫院大興制劑室，批號：20140418）。

1.3 主要試劑

水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150508）；miScript II RT Kit試劑盒（p/n 218160），由德國QIAGEN公司提供；miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒（德國QIAGEN公司，p/n 218073；鹽酸氟西汀（美國禮來公司，批號：4139A）。

1.4 主要儀器

定量 PCR儀（p/n 7900HT），由美國 Applied Biosystems公司提供；PCR儀（p/n 9700），由美國ABI公司提供；離心機（p/n 5418），由德國eppendorf公司提供；振蕩器-1（p/n GL-88B），由中國其林貝爾公司提供。

2 實驗方法

2.1 動物模型復制

慢性不可預見性溫和應激（CUMS）抑郁癥大鼠模型建立：參照Willner等[9]方法改進將大鼠予以禁水、禁食、夾尾、潮濕墊料、水平振蕩、電擊足底、冰水游泳、明暗顛倒等刺激。這些刺激每天隨機采取一種,使動物不能預料刺激發生。孤養，CUMS的同時單籠隔離飼養。

2.2 實驗動物分組與給藥

實驗前大鼠每組5只正常飼養，適應環境后進行行為學評分，選行為學得分相近者隨機分為：正常組（常規飼養）；模型組（CUMS+孤養42天）；中藥組（模型基礎上給予開心解郁方，灌胃給藥劑量為0.90 g·kg-1·d-1，治療42天）；西藥組（模型基礎上給予鹽酸氟西汀，灌胃給藥劑量為2.0 mg·kg-1·d-1，治療42天）。

2.3 行為學觀察

于造模42天后所有大鼠單籠飼養，配制1%蔗糖溶液，第1天每籠放置2瓶糖水；第2天每籠左右分別放置1瓶糖水，1瓶純水；第3天禁水24 h；第4天給每籠左右分別放置1%蔗糖水和純水各1瓶并稱重，120 min后，取2瓶水再次稱重。記錄每只大鼠的糖水消耗量、純水消耗量，以及糖水消耗百分率。

2.4 海馬組織提取

所有大鼠用水合氯醛深度麻醉，腹腔取血后用4℃生理鹽水灌流（心尖進針插入右心室，剪開左心耳），灌流結束后，斷頭取腦，剝離海馬組織，標號，入液氮速凍，轉入-80℃冰箱儲層待測。

2.5 miR-665表達測定

選取正常組、模型組、中藥組及西藥組大鼠整個海馬組織標本各10例，通過分離、沉淀、洗滌及溶解來提取海馬組織中總RNA。然后通過設計miR-665特異性頸環反轉錄引物進行逆轉錄反應，反應體系于PCR儀中，37℃下逆轉錄反應1 h，反應完全后95℃下5 min終止反應。實時熒光定量PCR反應條件為94℃下15 s，55℃下30 s，70℃下30 s，40個循環。表達結果采用2-△△Ct法分析miR-665相對表達量。

2.6 miR-665靶基因預測及功能分析

使用GeneSpring1 3.1軟件，分別通過TargetScan（http：//www.targetscan.org/）和 microRNAorg（http：//www.microrna.org/microrna/home.do/）數據庫對 miR-665 進行靶基因預測。為增加預測結果的準確性，對兩個數據庫預測到的靶基因取交集。再采用DAVID數據庫對預測得到的靶基因進行功能富集分析，應用Gene Ontology（GO）進行功能富集分類，應用KEGG進行信號通路分析。通過Fisher Exact Test計算基因功能的顯著性水平。

2.7 數據分析

所測數據均以均值±標準差（x±s）表示，釆用SPSS16.0統計軟件進行分析。服從正態分布且方差齊者采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較用LSD或T檢驗；不服從正態分布者，釆用Kruskal-Wallis秩和檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 行為學結果

各組大鼠于造模前糖水消耗百分率組間無明顯差異，基線良好。42天后糖水消耗百分率模型組低于正常組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；開心解郁方中藥組糖水消耗百分率高于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；鹽酸氟西汀西藥組糖水消耗百分率高于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.01）。說明造模后模型大鼠的糖水消耗百分率明顯降低，開心解郁方及鹽酸氟西汀可明顯增加模型大鼠的糖水消耗百分率。

圖1 糖水偏嗜實驗結果

圖2 miR-665 RT-qPCR檢測結果

3.2 各組大鼠海馬miR-665相對表達量結果

RT-qPCR檢測各組大鼠海馬miR-665相對表達量結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠海馬miR-665表達水平顯著增高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組大鼠海馬miR-665表達水平顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05），西藥組大鼠海馬miR-665表達水平顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）。

3.3 miR-665靶基因的功能富集分析結果

采用TargetScan和microRNAorg兩個數據庫分別預測miR-665的靶基因，結果取二者交集共得到327個靶基因。將預測得到的靶基因進行GO分析和KEGG信號通路分析。結果顯示miR-665靶基因的生物學功能主要富集于有機物質反應、內源性刺激反應、激素刺激反應、細胞因子介導信號通路、無機物的反應、神經沖動傳遞、細胞增殖調控和程序性細胞死亡的調節；信號通路主要富集于N-糖鏈的合成、急性髓系白血病、堿基切除修復、白細胞跨內皮遷移、趨化因子信號轉導通路和癌癥通路。見表1，2。

4 討論

抑郁癥屬于中醫的“郁證”、“癲證”、“臟躁”、“百合病”等范疇。理氣開郁為郁病基本治則。開心解郁方是在長期的臨床實踐中總結用于治療抑郁癥的有效方劑，由古方開心散與四逆散合方加減而成，方中人參大補元氣，開郁化滯，柴胡疏肝解郁，二藥合用培元開郁，共為君藥；巴戟天補腎助陽，茯苓健脾安神，二藥助人參培元固本；枳實行氣通滯，赤芍養血活血，二藥助柴胡開郁行滯，共為臣藥；遠志化痰解毒，甘草調和諸藥，共為佐使藥。全方合用，共湊益氣開郁之功效。前期研究發現開心解郁方治療抑郁癥臨床療效顯著，增加額葉及頂葉腦血流值，改善腦組織形態結構，調節單胺類神經遞質水平，促進BDNF及其受體表達，有效保護海馬神經元及神經血管單元穩態[2-4]。

表1 miR-665靶基因的GO富集分析結果

表2 miR-665靶基因信號通路富集分析結果

miRNA是一種內源性高度保守的非編碼單鏈RNA，由大約22個核糖核苷酸組成，主要通過與其靶基因結合調控其表達和下游蛋白翻譯過程，在細胞增殖與凋亡以及疾病發生發展過程中發揮著重要的作用[9]。通過對抑郁癥自殺人群的腦組織miRNA表達譜分析結果發現，抑郁癥患者前額皮質中存在miRNA表達顯著性異常[10]。Belzeaux等[11]通過檢測16名重度抑郁癥患者外周單核細胞中miRNA的表達變化，結果發現14個miRNA（miR-148a，miR-381，miR-1243，hasmiR-107，miR-200c，miR-494，miR-579，miR-133a，miR-517b，miR-589，miR-636，miR-652，miR-941，miR-425-3p）表達出現顯著異常，且這些異常變化的miRNA隨抗抑郁藥物治療后臨床癥狀的改善而發生相應的變化。可見miRNA參與了抑郁癥的病理以及抗抑郁藥物的作用機制過程。文獻報道miRNA主要參與了抑郁癥海馬神經元的生成、突觸可塑性以及BDNF的表達等方面病理生理機制的調控。如miR-124a可通過調控Notch信號通路決定神經干細胞的分化參與調節海馬神經元生成[12]。miR-134和BDNF間存在一個復雜的調控網絡，過表達miR-134可通過抑制cAMP應答元件結合蛋白（CREB）損傷突觸的可塑性，抑制BDNF的表達[13]。最新的研究發現，miR-665參與了中樞神經系統功能的調控，Sun等[14,15]發現miR-665可通過靶向抑制Bcl-2樣蛋白1（BCL2L1）的表達參與調控海馬星形膠質細胞的凋亡、再生。Lu等[16]通過體內外實驗研究探討miR-665在七氟醚麻醉誘導的認知功能障礙中的作用，發現miR-665表達水平對于學習記憶功能具有明顯的影響，其機制可能與調控海馬神經元的凋亡相關，胰島素樣生長因子2（Insulinlike Growth Factor 2，IGF 2）可能為其下游靶標。

本研究在前期臨床研究和動物實驗的基礎上，進一步觀察在中藥開心解郁方干預慢性應激抑郁癥模型大鼠的過程中海馬miR-665表達水平的變化。對miR-665可能參與抑郁癥發生發展的機制及開心解郁方的作用靶點進行初步研究。研究表明慢性應激抑郁模型大鼠海馬miR-665表達水平顯著增高，開心解郁方及鹽酸氟西汀可顯著降低其表達水平，提示miR-665可能參與了抑郁癥病理機制過程調控，通過改善其表達異常可能為開心解郁方的抗抑郁機制之一，其具體作用機制有待于進一步研究。

另外對miR-665的靶基因進行生物信息學分析，首先采用TargetScan、microRNAorg兩個數據庫對其靶基因進行預測，進一步采用GO分析和KEGG通路分析探討其可能參與的生物學功能。結果提示：miR-665靶基因主要與有機物質反應、內源性刺激反應、激素刺激反應等生物學過程相關，主要參與了N-糖鏈的合成、急性髓系白血病及堿基切除修復等信號通路。通過對其靶基因的功能預測分析將為我們后期繼續研究開心解郁方干預miR-665的具體作用機制提供一定的方向和理論基礎。

1 朱宏,孫靜.應激與抑郁癥關系的研究進展.精神醫學雜志,2013,26(5)：388-390.

2 Ying Z,Huang S,Wang Y,et al.Mechanism underlying the protective effect of Kaixin Jieyu Fang on vascular depression following cerebral white matter damage.Neural Regeneration Research,2014,9(1)：61-68.

3 Pan J,Lei X,Wang J,et al.Effects of Kaixinjieyu,a Chinese herbal medicine preparation,on neurovascular unit dysfunction in rats with vascular depression.Bmc Complementaryamp;Alternative Medicine,2014,15(1)：1-14.

4 黃世敬,張先慧,王彥云,等.Effects of Kaixin Jieyu Decoction(開心解郁湯)on Behavior,Monoamine Neurotransmitter Levels,and Serotonin ReceptorSubtype Expression in the Brain of A Rat Depression Mode.中國結合醫學雜志(英文版),2014,20(4)：280-285.

5 Schirle N T,Sheu-Gruttadauria J,Macrae I J.Gene regulation.Structural basis for microRNA targeting.Science,2014,346(6209)：608.

6 Wakabayashi T,Hidaka R,Fujimaki S,et al.MicroRNAs and Epigenetics in Adult Neurogenesis.Adv Genet,2014,86：27-44.。

7 Kim H H,Kim P,Phay M,et al.Identification of precursor microRNAs within distal axons of sensory neuron.J Neurochem,2015,134(2)：193-199.

8 Lu X,Lv S,Mi Y,et al.Neuroprotective effect of miR-665 against sevoflurane anesthesia-induced cognitive dysfunction in rats through PI3K/Akt signaling pathway by targeting insulin-like growth factor 2.Am J Transl Res,2017,9(3)：1344.

9 Stappert L,Roese-Koerner B,Brüstle O.The role of microRNAs in human neuralstem cells,neuronal differentiation and subtype specification.Cell Tissue Res.,2015,359(1)：47-64.

10 Bocchio-Chiavetto L,Maffioletti E,Bettinsoli P,et al.Blood microRNA changes in depressed patients during antidepressanttreatment.Neuropsychopharmacology,2013,23(7)：602-611.

11 Belzeaux R,Bergon A,Jeanjean V,et al.Responder and nonresponder patients exhibit different peripheral transcriptional signatures during major depressive episode.Transl Psychiatry,2012,2：e185.

12 Xian Shuang L,Michael C,Rui Lan Z,et al.MicroRNA Profiling in Subventricular Zone after Stroke：MiR-124a Regulates Proliferation of Neural Progenitor Cells through Notch Signaling Pathway.PLoS One,2011,6(8)：e23461.

13 Gao J,Wang W Y,Mao Y Wet al.A novel pathway regulates memory and plasticity via SIRT1 and miR-134.Nature,2010,466(7310)：1105-1109.

14 Sun W C,Liang Z D,Pei L.Propofol-induced rno-miR-665 targets BCL2L1,and influences apoptosis in rodent developing hippocampal astrocytes.Neurotoxicology,2015,51：87-95.

15 Sun W C,Pei L.rno-miR-665 targets BCL2L1(Bcl-xl)and increases vulnerability to propofol in developing astrocytes.J Neurochem.,2016,138(2)：233-242.

16 Lu X,Lv S,Mi Y,et al.Neuroprotective effect of miR-665 against sevoflurane anesthesia-induced cognitive dysfunction in rats through PI3K/Akt signaling pathway by targeting insulin-like growth factor 2.Am J Transl Res,2017,9(3)：1344.

Expression of miR-665 and BioinformaticAnalysis on Its Target Genes of Kai-Xin Jie-Yu Decoction Based on Depression Model Rats

Wang Liansheng,Huang Shijing,Pan Juhua,Wang Yanyun,Zhang Yin,Chen Yuxia
(Guang’anmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100053,China)

This study was aimed to detect the expression of miR-665 in the hippocampal of depression rat model treated withKai-Xin Jie-Yu(KXJY)decoction and bioinformatic analysis of target genes of miR-665,in order to investigate the role of miR-665 in the pathogenesis of depression and the antidepressant mechanism of KXJY decoction.The rat model of chronic stress depression was established and then treated with KXJY decoction for 42 days.The total RNA from hippocampus tissues was extracted.And the relative expression of miR-665 in hippocampus of rats in each group was detected by RT-qPCR.TargetScan and microRNAorg databases were used to predict target genes for miR-665.DAVID database was used to classify GO function and to analyze KEGG signaling pathway of target genes.The results showed that compared with the normal group,the expression level of miR-665 in hippocampus of the model group was significantly higher with significant difference(P＜0.01).Compared with the model group,the expression level of miR-665 in hippocampus of Chinese medicine group and western medicine group decreased significantly with significant difference(P＜0.01).The biological functions of miR-665 target genes were mainly concentrated in the response to organic substance.The signal pathway was mainly concentrated in N-Glycan biosynthesis.It was concluded that miR-665 may be involved in the pathological process of depression,by correcting the abnormal expression of miR-665,which may be one of the antidepressant mechanisms of KXJY decoction.Through the analysis and prediction of the target genes,it provided a certain direction and theoretical basis for further study on the specific mechanism of KXJY decoction intervention on miR-665.

Depression,miR-665,biological information analysis,Kai-Xin Jie-Yudecoction

10.11842/wst.2017.08.014

R965

A

2017-06-13

修回日期：2017-07-12

＊ 國家自然科學基金（81573790）：基于lncRNA-miRNA網絡對神經血管單元穩態調控探討益氣開郁中藥抗抑郁機制，負責人：黃世敬；北京市科技計劃（No.Z161100001816013）：開心解郁丸治療血管性抑郁的醫療機構制劑研究，負責人：黃世敬

＊＊ 黃世敬，博士生導師，研究員，主任醫師。主要從事中醫腦病、抑郁癥及中藥研發。

（責任編輯：陳 寧，責任譯審：王 晶）