密銀花對照藥材標定標準的研究

楊健+蔣超+金艷+趙玉洋+袁媛+黃璐琦

[摘要] 建立道地藥材密銀花對照藥材標定技術規范，作為密銀花對照藥材內在質量控制和評價的理論依據及技術標準，為道地藥材現代研究及其特征辨識提供支撐。收集10批密銀花，根據2015年版《中國藥典》一部方法進行檢驗，10批樣品均符合規定；建立LC-MS指紋圖譜檢測方法，確定了23 個共有峰，并根據對照品和參考文獻指認了8個共有峰，對10批密銀花藥材相似度進行了考察，其相似度在0.95以上。使用7對金銀花種質鑒定核心引物進行SSR指紋圖譜構建，10批密銀花指紋圖譜均與河南尖山大毛花種質SSR參照圖譜差異位點數為1或0個，符合密銀花種質分子特征。通過結合DNA指紋圖譜和LC-MS化學指紋圖譜，建立了首個中藥道地藥材的標定標準，該標定標準的制定為加快中藥標準藥材尤其是道地藥材的評價體系的建設提供了理論依據及技術標準。

[關鍵詞] 金銀花； 密銀花； 道地藥材； 指紋圖譜

[Abstract] The calibration technical specification for reference drug of Lonicera japonica cultivated in Xinmi （Mi Yin Hua） established in this study can be used as the theoretical basis and technical standard for internal quality control and evaluation of reference drug of Mi Yin Hua and for modern research and characteristics identification of Dao-di herbs. Based on the quality standard of L. japonica in Chinese Pharmacopoeia （version 2015）， 10 batches samples of Mi Yin Hua also conformed to the stipulation. The LC-MS fingerprint common mode of Mi Yin Hua was obtained， and a total of 23 characteristic peaks were selected as the common fingerprint peaks， and eight common chromatographic peaks in the fingerprint was identified based on standard substances and references. The similarities of 10 batches samples were greater than 0.95. Seven core primers were used to construct SSR fingerprint and the ten batches samples were only 0 or 1 site disaccord with the standard diagram of Jianshan Damaohua germplasm from Xinmi. This paper constructed the first calibration standard of Dao-di herbals by combination of macroscopical identification， SSR fingerprint and LC-MS fingerprint， and the calibration standard provide theoretical basis and technical standard for evaluation system of Dao-di herbals.

[Key words] Lonicera japonica； Mi Yin Hua； Dao-di herbs； fingerprint

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、涼散風熱的功效^[1]。金銀花是常用大品種中藥材，主產于河南、山東、河北等省，其中河南“密銀花”是被廣泛認可的道地藥材。早在南宋，《曲洧舊聞》中就明確記載金銀花產于“鄭許田野間”^[2]，鄭許即南宋時期的鄭州和許州，其與現今河南省鄭州市、許昌市位置大致相當。而《救荒本草》記載金銀花生于“輝縣山野中”^[3]，明代輝縣與今之河南省輝縣市位置也大致相當。《植物名實圖考》記載金銀花“皆中州產也”，這里的中州即指今河南省。由此可見，宋、明、清三代均有文獻明確記載河南產金銀花，且《植物名實圖考》中提到“茶肆以新販到金銀花為貴，皆中州產也”^[4]，可依此判斷當時已經認為河南的金銀花是質優效佳之品。密銀花的明確記載已從南宋延續至今，古代本草中比較明確的產地有河南省的鄭州市、許昌市和輝縣市，位于東經115°北緯35°左右的區域。

道地藥材是中醫藥偉大寶庫中重要的組成部分，在國家藥品標準物質要求的基礎上，建立對照道地藥材是實現道地藥材特征辨識的必要前提。對道地藥材的評價應是在符合《中國藥典》要求的基礎上，對優質藥材進行鑒定與評價，但現有的化學對照品、對照藥材等標準物質已不能滿足道地藥材評價的需求，因此需要建立更高要求的標準物質。本研究采集來自金銀花傳統道地產區——河南省新密市的10批密銀花，分析研究各批次樣品的特征特性，建立密銀花的DNA指紋圖譜和LC-MS化學指紋圖譜，制定了密銀花對照藥材標定技術標準，作為密銀花對照藥材內在質量控制和評價的理論依據及技術標準，為道地藥材現代研究及其特征辨識提供支撐。endprint

1 材料

ACQUITY UPLCTM I-Class超高效液相色譜系統（美國Waters公司，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower 3色譜工作站），Xevo G2-XS QTOF四極桿-飛行時間質譜儀（美國Waters公司，ESI電噴霧離子源），SB-800 DTD型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司），New Classic MS-S電子天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]，Eppendorf 5810R離心機（德國Eppendorf公司）。

ABI 9700 PCR儀（ABI公司），DYY-12電泳系統（北京市六一儀器廠），GBOXHR紫外凝膠成像分析儀（英國Syngene公司），MM400混合型球磨儀（德國Retsch公司），Eppendorf微量移液器（德國Eppendorf公司），HH-2數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），CSIOI-1D電熱鼓風干燥箱（中國重慶實驗設備廠），AMFI-5-P實驗室級專用純化水機（頤洋企業發展有限公司），Bio-rad電泳儀（美國Bio-Rad公司），MDF-192低溫冰箱（日本 SANYO公司）。

色譜甲醇和色譜乙腈（美國Fisher Scientific公司）；甲酸（LC-MS分析用，美國Fisher Scientific公司），15 mL離心管（NEST），0.22 μm PTFE濾膜（天津津騰實驗設備有限公司）。

對照品綠原酸（批號110753-201505）、木犀草苷（批號111720-201609）及對照藥材金銀花（批號121060-201608）均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品新綠原酸（批號B213963-201507）、四乙酰開聯番木鱉苷（批號B25441-201503）、馬錢苷（批號B20822-201503）、獐牙菜苷（B21643-201507）、斷氧化馬錢子苷（B30116-201503）、異槲皮苷（B21529-201509）、異綠原酸 A（B21539-201503）均購自上海源葉生物科技有限公司。

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、聚乙烯比咯烷酮-40 （PVP-40）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨（APS）均購自Amersco公司、硝酸銀購自中國醫藥集團。

瓊脂糖（Promega公司），溴化乙錠（Fluka公司），DNA Taq聚合酶（Takara公司），500 bp DNA Markar（Takara公司），引物（生工（北京）有限公司合成），溴酚藍（上海生物工程公司），TEMED，β-巰基乙醇，三氯甲烷（天津市永大化學試劑有限公司），甲醛（天津市永大化學試劑有限公司），無水乙醇（天津市永大化學試劑有限公司），異丙醇（天津市永大化學試劑有限公司），異戊醇（天津市永大化學試劑有限公司）均為國產分析純等。

本實驗所用密銀花藥材（10批）于2014年5月采自河南省鄭州市新密市尖山鄉，生長環境為山地，陽坡，土壤為砂壤土，自然降水（圖1）。GPS信息為，緯度34° 36′ 30.3″，經度113° 17′ 12.2″，高度 551 m，符合古代本草明確記載密銀花產地；由河南中醫藥大學陳隨清教授鑒別，符合傳統密銀花性狀特征。

2 方法與結果

2.1 《中國藥典》2015年版一部金銀花項下的項目的檢驗

性狀鑒定、顯微和薄層色譜鑒別、水分、總灰分及酸不溶性灰分、重金屬及有害元素、綠原酸和木犀草苷的含量測定按《中國藥典》2015年版一部金銀花項下的規定檢驗^[5]，10批次樣品均符合規定。

2.2 道地藥材性狀特征

花蕾呈棒狀，無開朵，表綠白色，密被短柔 毛，質稍硬，用手均勻撒下，花與花可搭成十字架；氣清香，味淡，微苦，具有明顯的傳統密銀花性狀特征^[6-7]。

2.3 DNA指紋圖譜研究

2.3.1 總DNA提取

用硅膠干燥材料，用改良CTAB 法提取總DNA^[8]。測量總DNA的吸光度A并經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，放置于-20 ℃冰箱中保存備用。

2.3.2 DNA身份證

利用 7 對金銀花種質鑒定核心引物（A，B，C，D，E，F，G），進行PCR擴增^[9]（表1）。

PCR反應體系（25 μL）為：19.8 μL ddH2O，2.5 μL 10×PCR buffer，1 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，10 μmol·L-1上下游引物各0.25 μL，2.5 U rTaq DNA聚合酶[寶生物工程（大連）有限公司]0.2 μL，1 μL 50～100 mg·L-1DNA模板。反應在ABI公司的9700型PCR擴增儀上進行，反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，46～51 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸7 min。反應結束后，擴增產物進行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染檢測多態性條帶（圖2）。

通過與標準指紋圖譜對比，獲得DNA身份證：A11010000B00000100110C0001010D010011E10111011110F000000110G00010101。采用引物對16擴增得到的電泳圖譜中的特異性條帶為（450±5），250，230，（160±5） bp；采用引物對17擴增得到的電泳圖譜中的特異性條帶為220，150，140，（130±5） bp；采用引物對18擴增得到的電泳圖譜中的特異性條帶為230，200，160 bp；采用引物對23擴增得到的電泳圖譜中的特異性條帶為（600±10），280，270，170，（160±5） bp；采用引物對24擴增得到的電泳圖譜中的特異性條帶為（550±5），350，300，（280±5），250，240，220，190 bp；采用引物對29擴增得到的電泳圖譜中的特異性條帶為200，（170±5），（150±5） bp；采用引物對30擴增得到的電泳圖譜中的特異性條帶為280，260，（235±5），（220±5） bp；所測樣品SSR指紋圖譜與河南尖山大毛花種質SSR參照圖譜差異位點數為1或0個，符合密銀花種質分子特征。endprint

2.4 LC-MS特征圖譜的研究

2.4.1 對照品溶液制備

分別取綠原酸、新綠原酸、裂馬錢苷、馬錢苷、獐牙菜苷、斷氧化馬錢子苷、異槲皮苷和異綠原酸 A適量，精密稱定，加甲醇分別制成約100 mg·L-1的對照品溶液。

2.4.2 供試品溶液制備

稱取密銀花樣品粉末（過4號篩）0.5 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，加入70%乙醇溶液50 mL，超聲處理（功率 140 W，頻率 42 kHz）30 min；放冷，再稱重，70%乙醇補足失重，搖勻，以1萬 r·min-1離心15 min，取上清液0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.4.3 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC T3色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，Waters，USA），流動相0.1%甲酸-水溶液（A） - 0.1%甲酸-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，5%～10% B； 3～13 min，10%～40% B； 13～18 min，40%～80% B），流速0.50 mL·min-1，柱溫40 ℃，進樣量1 μL。

2.4.4 質譜條件

電噴霧離子源（ESI）；負離子模式采集數據；質量掃描范圍m/z 100～1 500；干燥氣體：氮氣，流量6 L·min-1；干燥氣溫度220 ℃；毛細管電壓（capillary voltage） 4.0/5.5 kv （+/-）；錐孔電壓（sampling cone） 35/50 eV （+/-）；萃取錐孔（extraction cone） 3 eV；離子源溫度（source temperature） 100 ℃；脫溶劑氣溫度（desolvation temperation） 350 ℃；反向錐孔氣流（cone gas flow） 50 L·h-1；脫溶劑氣（desolvation gas flow） 650 L·h-1；低質量區分辨率（LM resolution） 4.7 eV；高質量區分辨率（HM resolution） 15 eV；碰撞氣體氬氣，碰撞能量10 eV；碰撞池入口（collision cell entrance） 2 eV；碰撞池出口（collision cell exit） -10 eV；碰撞氣流速（collision gas flow） 0.5 mL·min-1；碰撞能量：低能量6 V，高能量20～60 V。

2.4.5 方法學考察

2.4.5.1 精密度試驗 精密吸取同一S1樣品供試品溶液，上述色譜和質譜條件下連續重復進樣 6 次，測得各共有峰的相對保留時間RSD<0.69%，各共有峰相對峰面積RSD<2.1%，表明進樣和儀器精密度良好，符合指紋圖譜的技術要求。

2.4.5.2 穩定性試驗 取同一S1樣品供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12 h按上述色譜和質譜條件進行檢測，各共有峰相對保留時間RSD<1.1%，各共有峰相對峰面積RSD<2.4%，表明樣品溶液在12 h內穩定性良好，符合指紋圖譜的技術要求。

2.4.5.3 重復性試驗 取S1樣品粉末 6 份，按2.4.2項方法分別制備供試品溶液，再按上述色譜和質譜條件進行檢測，各共有峰相對保留時間RSD<1.4%，共有峰相對峰面積RSD<2.9%，表明方法重復性良好，符合指紋圖譜的技術要求。

2.4.6 指紋圖譜的建立與共有峰的確定

按2.4.2項下方法制備10批次的密銀花供試品溶液，2.4.3項色譜條件及2.4.4項質譜條件下測得密銀花UPLC-MS指紋圖譜。比較10批供試品的色譜圖，確定了 23 個共有峰（圖2）。通過UPLC-MS/MS離子掃描獲得的指紋圖譜結構信息并結合對照品進行指認，確定其中8個指紋成分的化學結構，分別為1（新綠原酸）、3（綠原酸）、4（四乙酰開聯番木鱉苷）、5（馬錢苷）、7（獐牙菜苷）、9（斷氧化馬錢子苷）、10（異槲皮苷）和12（異綠原酸 A）。

以3號峰（綠原酸）作為參照峰，計算各指紋峰面積與同一圖譜中參照峰的峰面積比值，得到相對峰面積；將所得10批密銀花藥材的上述信息數據依次導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件（2004A 版），產生對照圖譜，經多點校正及色譜峰匹配得出不同密銀花藥材的相似度（表2）。10批密銀花藥材的相似度結果均大于0.95，說明10批密銀花藥材的代謝輪廓比較接近，區域內藥材質量差異較小，化學成分比較穩定。

3 討論

本研究在《中國藥典》2015年版一部金銀花標準的基礎上，增加了DNA指紋圖譜和LC-MS化學指紋圖譜，按擬定的標準檢測10批密銀花藥材，結果表明該標準適宜作為道地藥材密銀花對照藥材的標定標準。作為首個中藥道地藥材的標定標準，該標定標準的制定為加快中藥標準藥材尤其是道地藥材的評價體系的建設提供了理論依據及技術標準，為道地藥材現代研究及其特征辨識提供技術支撐。

雙分子標記是基于 DNA分子標記和代謝標識物相結合的分析方法，在分子水平同時研究中藥的種類、區別和質量差異的一種分子標記方法^[10]。雙分子標記技術利用DNA分子標記分析中藥物種的遺傳信息分析，代謝標識物的定性及定量進行中藥物質基礎的評價，從而達到中藥“真偽、優劣”二維分子評價的目的。本研究使用雙分子標記的方法同時從遺傳指紋和代謝標識指紋圖譜2個方面對道地藥材密銀花進行標定，從而確定其標定標準。

本研究通過采用UPLC-MS/MS技術建立了道地密銀花藥材的總離子流色譜指紋圖譜，選擇質譜（MS）作為樣品測定的檢測器，可以有效的克服紫外檢測器（UV）的局限性以及蒸發光散射檢測器（ELSD）的不穩定性，并且其具有更加準確的定性能力，能夠最大限度的反應藥材的化學指紋特性。

通過使用SSR指紋圖譜作為DNA分子身份證，使用7對核心引物標定10批密銀花藥材，其SSR指紋圖譜結果均與河南尖山野生金銀花種質SSR參照圖譜差異位點≤1個，表明通過SSR指紋圖譜技術能準確標定道地藥材密銀花的DNA特征，結合化學指紋圖譜形成的雙分子標記可準確標定中藥材，建立道地藥材標定標準。

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[責任編輯 呂冬梅]endprint