中國芍藥組7種植物根的生長輪及其在赤芍類藥材鑒別中的應用

儲姍姍+查良平+段海燕+徐濤+彭華勝

[摘要] 藥材的生長年限與其質量息息相關，近年來興起的“草本植物生長輪”被用于判別多年生雙子葉草本植物的生長年限。該研究結合常規石蠟切片和徒手切片方法，對芍藥Paeonia lactiflora、草芍藥P. obovata、川赤芍P. veitchii、美麗芍藥P. mairei、窄葉芍藥P. anomala、新疆芍藥P. sinjiangensis和塊根芍藥P. anomala var. intermedia 7種植物的根和就地引種栽培芍藥的主根進行解剖學研究。結果顯示，芍藥組7種植物的根在顯微結構上存在一定差異，可用于不同種之間的鑒別；芍藥組7種植物根的次生木質部中，口徑較大的導管和周圍的小導管或木纖維聚集呈團塊狀分布，切向斷續排列成與形成層平行的環，均形成清晰的生長輪；吉林四平就地引種栽培的一至四年生的芍藥主根中均有生長輪，且與其生長年限一致。該研究報道了芍藥組7種植物的生長輪現象，由于野生芍藥組植物根中生長輪特點與栽培的芍藥類似，因此可為其生長年限提供判別依據，也可為赤芍類藥材的質量評價研究奠定基礎。

[關鍵詞] 芍藥； 生長輪； 赤芍； 年限鑒別

[Abstract] The growth years of medicinal materials are closely related to their quality， and "Herb-chronology" has been used to determine the growth years of perennial dicotyledonous plants in recent years. On the basis of conventional paraffin section and freehand section， the anatomical study on roots of seven Sect. Paeonia species and main roots of cultivated Paeonia lactiflora was conducted in this paper. The results showed that， there existed some differences in microstructure of the seven species such as P. lactiflora， P. obovata， P. veitchii， P. mairei， P. anomala， P. sinjiangensis and P. anomala var. intermedia， and this could be used to distinguish different species. In the roots of seven Sect. Paeonia species， distinct growth rings were formed because that the different diameters or density of xylem vessels in the secondary xylem formed clusters and arranged interrupted rings in tangential direction. There were growth rings in the main roots of P. lactiflora cultivated 1-4 years in Siping， Jilin， which were all consistent with their growth years. Due to the similar growth characteristics between wild Sect. Paeonia species and cultivated P. lactiflora， the growth rings can provide a basis for the age identification and lay the foundation for the quality evaluation of Paeoniae Radix Rubra.

[Key words] Paeonia lactiflora； growth rings； Paeoniae Radix Rubra； age identification

傳統中醫藥認為中藥的質量與其采收時間息息相關，如孫思邈在《備急千金要方》中強調：“早則藥勢未成，晚則盛勢已歇”^[1]。中藥的采收時間包括采收期和采收年限，其中采收期往往遵循一定采收時節，而采收年限則易受到市場等人為因素影響^[2]。因此，判別多年生藥材的生長年限可為中藥的質量評價提供科學依據。中藥材中80%來源于植物，主要以植物的根、根狀莖、莖、花、果實、種子等各器官作為臨床藥用。其中多年生木本植物莖類藥材的生長年限可根據木本植物形成層規律性活動產生的年輪來判別^[3]，而部分皮類藥材的生長年限可根據樹皮橫切面所見纖維束環帶為指標，顯示出“樹皮年輪”來鑒別^[4]。對于絕大多數來源于多年生草本植物的根及根狀莖類藥材，其生長年限的鑒別仍缺少科學的判斷依據。近年來，雙子葉草本植物根中的生長輪現象得到國內外學者越來越多的關注，被稱為“Herb-chronology”^[5-9]。已有研究表明在中藥黃芪^[10-11]、丹參^[12]、人參^[13]、黃芩^[14]、川續斷^[15]等植物的根中有生長輪的存在。

芍藥屬Paeonia芍藥組Sect. Paeonia的植物均為多年生草本，在中國有8種，6變種^[16]。芍藥組多種植物的根均可藥用，其中白芍、赤芍為2味常用中藥^[17]。白芍為栽培芍藥Paeonia lactiflora Pall.的根去皮水煮而成，課題組前期研究發現安徽亳州、浙江磐安、四川中江和山東菏澤四大產地6個栽培品種的芍藥根中有清晰可見的生長輪，并可應用于年限鑒別^[18]。赤芍為野生的芍藥P. lactiflora和川赤芍P. veitchii Lynch的根直接干燥而成，因來自野生資源，其生長年限難以判別。此外，草芍藥P. obovata Maxim.、窄葉芍藥P. anomala L.、美麗芍藥P. mairei Levl.等芍藥組多種植物也常作為赤芍的地方習用品^[19]。赤芍類藥材均來源于多年生草本的根，其質量優劣與其生長年限密切相關，因此若能準確判斷野生芍藥組植物的生長年限，將為赤芍類藥材的質量評價提供依據。野生的芍藥組植物在中國分布廣泛，芍藥組不同種植物根中是否也存在生長輪？能否為其生長年限的判別提供依據？本文對不同地區芍藥組7種植物根的顯微結構進行觀察，并對吉林省四平市引種栽培的芍藥主根進行顯微研究，觀察其根中生長輪的存在情況，以期為野生芍藥的生長年限的判別提供依據。endprint

1 材料

野生的芍藥組7種植物均來自不同地區（表1），材料由安徽中醫藥大學彭華勝教授提供并鑒定。

考慮到在野生的芍藥組植物中，即使根中有生長輪，但因其野生，生長輪是否對應生長年限依然難以判別。芍藥P. lactiflora在吉林省四平市已有小規模就地引種栽培，栽培年限明確，且與野生芍藥種質、生長環境一致，因此采集該地一至四年生的芍藥樣品各5～6株進行實驗研究。

2 方法

2.1 石蠟切片制備 芍藥為肉質直根，根的直徑較粗。為觀察到根的斷面整體顯微特征，選取完整的斷面或二分之一以上的斷面做切片。材料經FAA固定液固定，系列乙醇脫水、透蠟、包埋后常規石蠟切片，切片厚度為10～20 μm，番紅-固綠染色，中性樹膠封片，在Leica DM6000B全自動熒光顯微鏡下觀察和拍照。

2.2 徒手切片制備 取新鮮材料或復水的干藥材，用雙面刀片切成薄片，間苯三酚鹽酸溶液染色，在Olympus SZX10體視顯微鏡和Canon EOS 70D數碼單反相機下觀察和拍照。

3 結果

3.1 芍藥組7種植物根的橫切面特征 芍藥組7種植物根的橫切面構造均符合雙子葉植物根的次生構造，由周皮、次生韌皮部、形成層和次生木質部組成。周皮由木栓層、木栓形成層和栓內層組成，木栓層由扁平的木栓細胞組成。次生韌皮部由篩管、伴胞和韌皮薄壁細胞組成。形成層區由3～5層扁平長方形細胞排列成環。次生木質部由導管、木射線和木薄壁細胞組成，導管多呈徑向排列，大導管群和小導管群或木纖維間斷排列。

芍藥組7種植物的根的顯微特征存在一定差異。芍藥P. lactiflora根中次生木質部大小導管口徑差異較大，周圍有大量木纖維存在，成團塊狀分布。薄壁細胞中含有草酸鈣簇晶，并有大量淀粉粒。草芍藥P. obovata的根中，木質部導管束較少，導管口徑較均勻，木纖維較少，木射線細胞較為寬廣，薄壁細胞中草酸鈣簇晶的數量較芍藥多。川赤芍P. veitchii的根中導管群分布比較稀疏，大小導管口徑相差較大，木射線細胞中含有大量的草酸鈣簇晶，韌皮薄壁細胞中草酸鈣簇晶散在。美麗芍藥P. mairei根中大導管和小導管相間排列，導管在木質部中心較為集中。薄壁細胞中含有大量的草酸鈣簇晶，沿著射線部分從木質部中心一直分布到韌皮部外側，多而密集，顯著區別于其他幾種野生芍藥根。對分布于新疆地區的窄葉芍藥P. anomala、新疆芍藥P. sinjiangensis K. Y. Pan和塊根芍藥P. anomala var. intermedia （C. A. Mey.） O. et B. Fedtsch.的根進行觀察，發現其根中木栓層內側均分布有一定數量的石細胞，這是其他幾種植物所不具有的。不同的是，新疆芍藥P. sinjiangensis的根中導管較多，排列比較密集，而窄葉芍藥P. anomala和塊根芍藥P. anomala var. intermedia根中導管束稀疏排列，但兩者靠近木栓層部位的石細胞數目均較新疆芍藥P. sinjiangensis多。

3.2 芍藥組7種植物根中生長輪 芍藥組7種植物的16個樣品根中均發現有清晰的生長輪（圖1）。對不同產地的芍藥P. lactiflora的根進行切片觀察，其中對內蒙古赤峰、內蒙古科爾沁和吉林磐石的芍藥P. lactiflora的根進行石蠟切片，發現其在結構上有著一致性：芍藥根的次生木質部中口徑較大的導管和周圍的小導管或木纖維聚集呈團塊狀分布，切向斷續排列成與形成層平行的環，形成清晰的生長輪（圖1A，B，C）。對吉林長春和吉林通化的芍藥P. lactiflora的根進行徒手切片，間苯三酚染色后觀察，也可觀察到木質部導管呈團塊狀分布，切向斷續排列成環，形成明顯的生長輪（圖1D，E）。在草芍藥P. obovata根中，木質部導管之間大小差異不明顯，根據導管的聚集密度不同，斷續排列成較明顯的生長輪（圖1F，G，H）。川赤芍P. veitchii的根中導管群分布比較稀疏，但口徑較大的導管分布較為集中，依次排列成斷續的環，形成生長輪（圖1I）。美麗芍藥P. mairei根大小導管有規律地依次排列，且大導管群之間間隔較大，切向形成較為稀疏的生長輪（圖1J）。

窄葉芍藥P. anomala根中的導管束排列極其稀疏，多由數十個導管聚集在一起，兩導管群之間間隔較大，斷續連成與形成層平行的環，生長輪較為清晰（圖1M）。塊根芍藥P. anomala var. intermedia根中導管口徑較小，導管束排列也比較稀疏，與窄葉芍藥P. anomala相似，木質部中間的導管束多由數個至數十個導管聚集而成，但靠近形成層部分的導管小而密集（圖1L）。而新疆芍藥P. sinjiangensis根中木質部的導管較前兩者密集，大小導管依次排列，聚集成團塊狀，切向形成可見的生長輪（圖1K）。

3.3 就地引種栽培的芍藥根中的生長輪 吉林四平市梨樹縣十家堡鄉何家村引種野生芍藥進行栽培，繁殖方式為種子繁殖，根系中均有明顯的主根。這些就地引種的芍藥P. lactiflora來源于附近的野生種質，栽培的海拔、環境、土壤、氣候均與附近的野生種一致。

對吉林四平市梨樹縣十家堡鄉何家村一至四年栽培芍藥的主根進行石蠟切片觀察，發現在次生木質部中大導管群聚集在一起成生長輪，且生長輪對應年限。即一年生芍藥主根的生長輪數目為1（圖2A），二年生芍藥主根的生長輪數目為2（圖2B），三年生芍藥主根的生長輪數目為3（圖2C），四年生芍藥主根的生長輪數目為4（圖2D）。如圖標記，吉林四平栽培芍藥主根的生長輪數目與年限對應，即生長輪是其年輪。

4 討論

4.1 芍藥組植物根中的生長輪與生長環境的關系 與木本植物莖中的年輪相似，草本植物根的生長輪的形成受到氣候周期性變化的影響，主要存在于生長在四季分明、氣候季節性變化較大的溫帶地區的多年生草本植物根中^[20-21]。中國芍藥屬芍藥組植物有8種6變種，廣泛分布于我國東北、華北、西北等地區，氣候類型分別跨越了寒溫帶、中溫帶、暖溫帶、北亞熱帶、中亞熱帶和高原氣候區^[16，22]。芍藥組大部分種在溫帶地區均有分布，如芍藥P. lactiflora、草芍藥P. obovata、新疆芍藥P. sinjiangensis、窄葉芍藥P. anomala、塊根芍藥P. anomala var. intermedia等。而少數則分布到北亞熱帶和中亞熱帶部分海拔較高的地區，如草芍藥P. obovata、美麗芍藥P. mairei和川赤芍P. veitchii。其中，草芍藥P. obovata在安徽黃山、浙江天目山及湖南張家界等地有分布，均生長于海拔1 000 m以上的山坡草地及林緣；美麗芍藥P. mairei分布于四川中南部、云南東北部、貴州西部（畢節）等地海拔1 500 m的山坡林下；川赤芍P. veitchii則生長于四川海拔2 500 m以上的山坡林下草叢，在其他地區生長在海拔1 800～2 800 m的山坡疏林里^[16]。通常情況下，氣溫隨海拔的升高而降低，海拔每上升100 m，一般1月份氣溫下降0.4～0.5 ℃，7月份則下降0.6 ℃^[23]。因此，盡管芍藥組部分植物的分布區在氣候帶劃分上屬于亞熱帶，但由于在中亞熱帶及北亞熱帶的分布地都是高海拔地區，受垂直分布的影響，其生境小氣候仍屬于溫帶。吳征鎰先生曾根據中國種子植物屬的分布特點，將中國種子植物分為15個分布區類型，其中芍藥屬植物就屬于典型的北溫帶分布區類型^[24]。此外，由于芍藥組植物根系伸入土壤較淺，其生長環境接近地面，地溫隨溫帶地區季節性氣候變化呈現規律性變化，因此芍藥組7種植物根中均可見清晰的生長輪。endprint

4.2 芍藥組植物根中的生長輪可為赤芍類藥材的年限鑒別提供依據 芍藥組的7種植物根中均有清晰的生長輪，但這些生長輪是否與生長年限相對應？課題組前期對安徽亳州、浙江磐安、四川中江和山東菏澤四大栽培產地的不同生長年限的芍藥根進行了解剖學研究，發現4個產地栽培的芍藥根中均有清晰的生長輪，且與生長年限相對應^[18]。在芍藥的4個栽培主產區中，安徽亳州和山東菏澤處于暖溫帶，浙江磐安和四川中江處于亞熱帶，海拔較高，所處地區均四季分明^[25]。在這些地區分布的的芍藥組其他植物如草芍藥P. obovata，生長在海拔1 000 m以上的山坡林下，環境氣候接近溫帶地區，其根中也存在明顯的生長輪。根據芍藥組植物的分布特點，這些產地生長的芍藥組植物根中生長輪的形成與所處地區四季氣候規律性變化有關。因此，對于分布在這些地區的野生芍藥組其他植物，根中的生長輪特點應與栽培的芍藥類似，并可為其生長年限提供判別依據。

赤芍藥材主要來源于野生的芍藥P. lactiflora和川赤芍P. veitchii的干燥根^[17]。近年來由于臨床需求的增大，赤芍資源緊缺，吉林、內蒙古、黑龍江、安徽等地出現了野生芍藥的就地引種試驗性栽培，即以野生芍藥的種子或根頭在大田或果林下人工種植^[26]。本研究對吉林四平就地引種栽培的芍藥進行了顯微觀察，發現其根中也有清晰的生長輪，并與生長年限相對應。這些就地引種的芍藥來源于附近的野生種質，栽培環境與附近的野生種一致，其根的解剖學結構相似，因此生長輪也可以用來判別當地野生芍藥的生長年限。由于中藥赤芍主要來源于野生資源，利用生長輪來判別赤芍類藥材的生長年限，可為赤芍類藥材的質量評價提供依據。此外，由于芍藥組7種植物根中的生長輪明顯，徒手切片用間苯三酚染色也可觀察到清晰生長輪，因此為赤芍類藥材的年限鑒別提供了方便有效的方法。

[參考文獻]

[1] 孫思邈.備急千金要方[M].焦振廉校.北京：中國醫藥科技出版社，2011：5.

[2] 徐國鈞，何宏賢，徐珞珊，等.中國藥材學·上[M].北京：中國醫藥科技出版社，1996：58.

[3] Fritz H S. Tree rings： basics and applications of dendrochronology[M]. Dordrecht： Kluwer Academic Publishers， 1988： 118.

[4] 趙中振，唐曉軍，胡梅.樹皮年輪的研究及其意義[J].北京林業大學學報，1990，12（4）：127.

[5] Hansjorg D， Isolde U. Ecological application of "Herbchronology"： comparative stand age structure analyses of the invasive plant Bunias orientalis L[J]. Ann Bot， 1998， 82： 471.

[6] Fritz H S， Peter P. Growth rings in herbs and shrubs： life span， age determination and stem anatomy[J]. For Snow Landsc Res， 2005， 79（3）： 195.

[7] Liu Y B， Zhang Q B. Growth rings of roots in perennial forbs in Duolun Grassland， Inner Mongolia， China[J]. J Integr Plant Biol， 2007， 49（2）： 144.

[8] Shi S L， Li Z S， Wang H， et al. Roots of forbs sense climate fluctuations in the semi-arid Loess Plateau： herb-chronology based analysis[J]. Sci Rep， 2016， 6： 28435.

[9] Justin R D， Michael W P. Application of herb-chronology： annual fertilization and climate reveal annual ring signatures within the roots of U.S. tallgrass prairie plants[J]. Botany， 2016， 94（4）： 1.

[10] Peng H S， Wang J， Zhang H T， et al. Rapid identification of growth years and profiling of bioactive ingredients in Astragalus membranaceus var. mongholicus （Huangqi） roots from Hunyuan， Shanxi[J]. Chin Med， 2017， 12： 14.

[11] Yu K Z， Liu J， Guo B L， et al. Microscopic research on a multi-source traditional Chinese medicine， Astragali Radix[J]. J Nat Med， 2014， 68（2）： 340.

[12] Wang Y J， Peng H S， Shen Y， et al. The profiling of bioactive ingredients of differently aged Salvia miltiorrhiza roots[J]. Microsc Res Techniq， 2013， 76（9）： 947.endprint

[13] Liang J B， Jiang C， Peng H S， et al. Analysis of the age of Panax ginseng based on telomere length and telomerase activity[J]. Sci Rep， 2015， 5： 7985.

[14] 楊冬野，蔡少青，王璇，等.不同生長年限野生與栽培黃芩的藥材鑒定研究[J].中國中藥雜志，2006，31（22）：1729.

[15] 楊俊，彭華勝，軒艷，等.野生川續斷和不同栽培年限川續斷的組織結構鑒別研究[J].中藥材，2012，35（12）：1932.

[16] 關克儉，肖培根，潘開玉，等.中國植物志.第27卷[M].北京：科學出版社，1979：37，51.

[17] 中國藥典.一部[S].2015：105，158.

[18] Zha L P， Cheng M E， Peng H S. Identification of ages and determination of paeoniflorin in roots of Paeonia lactiflora Pall. from four producing areas based on growth rings[J]. Microsc Res Techniq， 2012， 75（9）： 1191.

[19] 謝宗萬.中藥材品種論述.上冊[M].上海：上海科學技術出版社，1990：194.

[20] Hansjorg D， Fritz H S. Annual rings in native and introduced forbs of lower Michigan， U.S.A.[J]. Can J Bot， 2002， 80（6）： 642.

[21] Georg V A， Hansjorg D. Growth rings in the roots of temperate forbs are robust annual markers[J]. Plant Biol， 2006， 8（2）： 224.

[22] 鄭景云，尹云鶴，李炳元.中國氣候區劃新方案[J].地理學報，2010，65（1）：3.

[23] 劉南威.自然地理學[M].北京：科學出版社，2000：207.

[24] 吳征鎰.中國種子植物屬的分布區類型[J].云南植物研究，1991，13（S4）：1.

[25] 查良平，楊俊，彭華勝，等.四大產地白芍的種質調查[J].中藥材，2011，34（7）：1037.

[26] 俞敬波，馮學鋒，王文全，等.不同產地赤芍野生品與栽培品性狀顯微特征比較研究[J].中國中藥雜志，2010，35（19）：2533.

[責任編輯 呂冬梅]endprint