不同鈦表面形貌誘導大鼠骨髓間充質干細胞增殖與成骨分化的影響*

周 敏 武東輝 吳亞霖 龐靜雯 莊秀妹

不同鈦表面形貌誘導大鼠骨髓間充質干細胞增殖與成骨分化的影響*

周 敏 武東輝 吳亞霖 龐靜雯 莊秀妹

目的：比較不同鈦表面形貌對大鼠骨髓間充質干細胞(rat bonemarrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)增殖與成骨分化的影響。方法：構建不同形貌鈦表面，包括噴砂堿熱高溫組的納米針狀表面、噴砂堿熱低溫組的納米網狀表面、噴砂酸蝕的微米凹坑表面和對照組的光滑純鈦表面。各組鈦片表面接種rBMSCs，在培養1、3、5、7天后采用CCK 8檢測各組rBMSCs增殖情況，7、14天檢測總蛋白濃度與堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性，同時采用實時熒光定量PCR分析7天時成骨相關基因ALP、I型膠原(collagen-I,COL1)與成骨特異性轉錄因子(runt related transcription factor 2,RUNX 2)的m RNA表達量差異。采用SPSS13.0軟件包對數據進行統計學分析。結果：相比光滑純鈦組與噴砂酸蝕組，具有微納米表面形貌的噴砂堿熱高溫組與噴砂堿熱低溫組rBMSCs細胞增殖能力顯著增強，總蛋白濃度升高，ALP活性增加，ALP、COL1與RUNX 2的mRNA表達水平明顯上調。結論：鈦表面微納米形貌可促進rBMSCs增殖與成骨分化。

大鼠骨髓間充質干細胞；鈦表面形貌；成骨分化；微納米形貌

牙種植體因其修復效果好、不需要損傷健康基牙等優點已成為越來越多牙列缺損甚至牙列缺失患者的首選治療方式[1]。然而，種植體骨結合時間長、因骨結合不良所引起種植體失敗等問題仍是種植體臨床應用中面臨的巨大挑戰[2]。

鈦表面改性是目前促進種植體骨結合的研究熱點。近年來，鈦表面微米化處理已被廣泛應用于商業種植體表面改性[3]。但是，越來越多的研究表明，納米級表面形貌在種植體周圍初期骨形成中起主要作用[4-6]。因此，制備微納米級鈦表面形貌、并探討其與微米級形貌對骨形成的影響差異具有重要意義。本研究旨在通過噴砂、酸蝕、堿熱等處理方式獲得微米級、微納米級鈦表面形貌，比較其對大鼠骨髓間充質干細胞(ratbonemarrow mesenchymalstem cells,rBMSCs)增殖與成骨分化的影響，為鈦表面微納米形貌促進種植體早期骨結合提供實驗基礎。

1.材料與方法

1.1 不同鈦表面形貌材料的制備與檢測 將純鈦片經線性切割成直徑10mm、厚度1mm的圓形樣品，根據鈦表面處理方法[7]分為：光滑純鈦組、噴砂酸蝕組、噴砂堿熱高溫組與噴砂堿熱低溫組。分別采用200目、400目、600目碳化硅砂紙逐級打磨拋光各組樣品，依次置于無水乙醇、丙酮、去離子水中超聲清洗各10m in，去離子水沖洗，室溫下干燥備用。使用Peenmatic 620S噴砂機，調節氣壓為0.4MPa，采用直徑為250μm的二氧化硅(silicon dioxide,SiO2)顆粒對除光滑純鈦組之外的樣品進行垂直噴砂，噴砂距離為1cm。再用體積比為1∶1的HF和HNO3的混合溶液拋光5m in，去離子水沖洗，干燥備用。將噴砂酸蝕組的樣品置于95℃、體積比為2∶4∶3的H2O、HCl和H2SO4的混合溶液中酸蝕10m in，去離子水沖洗，干燥，消毒備用。將噴砂堿熱高溫的樣品置于5mol/LNaOH溶液中，放入180℃的高壓鍋中反應4h。室溫下冷卻，去離子水沖洗，干燥，消毒備用。將噴砂堿熱低溫組的樣品置于5mol/L NaOH溶液中，放入80℃的密閉容器中。反應8h后室溫下冷卻，去離子水沖洗，干燥，消毒備用。采用S-4800冷場發射掃描電鏡(H itachi,Japan)分析樣品表面形貌。

1.2 rBMSCs的培養與傳代 將3周齡健康SD大鼠處死后于無菌環境下剝離出股骨，用培養液沖洗骨髓后離心重懸細胞，采用全骨髓細胞貼壁法對rBMSCs原代培養，10天后細胞呈成纖維細胞樣，細胞長至密度為90%左右時傳代，純化的細胞呈均一性，旋渦狀或輻射狀整齊有序排列，取前5代rBMSCs用于實驗。

1.3 CCK 8檢測 將4組鈦片放入24孔板，每組3個復孔。鈦片表面接種rBMSCs，接種密度為2×104/m L，每孔接種1m l細胞懸液，使用CCK-8法(Dojindo,Japan)分別在培養1、3、5和7天后檢測細胞活性，在450nm波長下測量吸光度值，觀察細胞增殖情況。

1.4 ALP活性檢測 將4組鈦片放入24孔板，每組3個復孔。鈦片表面接種rBMSCs，接種密度為2×104/m L，每孔接種1m l細胞懸液，分別在培養7、14d后檢測ALP活性，觀察細胞分化情況。檢測時先將細胞移人24孔板中，PBS清洗后，按ALP試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)說明加細胞裂解液200μl，4℃冰箱過夜。取出培養板，振蕩10m in后，使細胞破碎，制成懸液，每孔取30μl到96孔板，分別加入50μl緩沖液及基質液，37℃恒溫水浴15m in，加150μl顯色劑，于酶標儀520nm波長下測定ALP吸光度值。

1.5 總蛋白濃度測定 取上述細胞懸液25μl到96孔板，使用BCA-100蛋白質定量測試試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)，于酶標儀562nm波長下測定蛋白吸光度值。根據蛋白吸光度值，在牛血清白蛋白(bovine serum album in，BSA)標準曲線上讀取相應的總蛋白質量濃度(μg/m l)。

1.6 實時定量PCR檢測 采用Trizol法提取細胞中總RNA，測量RNA含量。取1μg RNA合成cDNA，按Takara公司QuantSYBRGreen PCR kit試劑盒操作說明進行擴增。引物序列如下，ALP(forw ard)：5′-CGGAAGTGAGGCAGGTAG-3′，ALP(reverse)：5′-AGAGCCCACAATGGACAG-3′；COL1(forw ar)：5′-CTGCCCAGAAGAATATGT ATCACC-3′，COL1(reverse)：5′-GAAGCAAA GTTTCCTCCAAGACC-3′；RUNX 2(forw ard)：5′-GCTTCTCCAACCCACGAATG-3′，RUNX2(reverse)：5′-GAACTGATAGGACGCTGACGA-3′；GAPDH(forw ard)：5′-GGCAAGTTCAACGGCA CAGT-3′，GAPDH(reverse)：5′-GCCAGTAGAC TCCACGACAT-3′。反應條件為：95℃(10s)，60℃(30s)和72℃(30s)，進行45個循環。求得各樣品基因相對表達量，并將對照組基因相對表達量設定為1。

1.7 統計學處理 數據以表示。各實驗至少重復3次，采用SPSS13.0軟件包分析結果。對兩組實驗數據比較進行校正t檢驗，對多組實驗數據采用單因素方差分析，若P＜0.05則差異被視為有統計學意義。

2.結果

2.1 掃描電子顯微鏡下各組鈦表面形貌特征掃描電子顯微鏡結果顯示：光滑純鈦組表面相對光滑，伴均勻不規則劃痕；噴砂酸蝕組表面表現為噴砂后的典型凹坑形態與酸蝕產生的微孔結構。噴砂堿熱高溫組與噴砂堿熱低溫組表面均在噴砂后凹坑形貌基礎上出現三維納米級結構，其中，噴砂堿熱高溫組表現為“草叢”樣納米針狀結構，相鄰距離為100-300nm，噴砂堿熱低溫組呈現三維網狀納米多孔結構，孔隙之間相互連通，直徑為50-200nm，二者均為典型微納米表面形貌(圖1)。

圖1 不同處理組純鈦表面的形貌特點(光滑純鈦組、噴砂酸蝕組×3000倍，噴砂堿熱高溫組、噴砂堿熱低溫組×30000倍)

2.2 鈦表面微納米形貌促進rBMSCs增殖CCK 8結果顯示，隨著培養時間的延長，接種在各組鈦片表面的rBMSCs細胞數均出現明顯增長，說明各組表面形貌鈦片對rBMSCs沒有細胞毒性。然而，各組rBMSCs細胞增殖能力具有明顯差異：噴砂堿熱高溫組、噴砂堿熱低溫組以及噴砂酸蝕組rBMSCs在接種3天、5天與7天后的細胞活性均較光滑純鈦組明顯增加(P＜0.05)；同時，噴砂堿熱高溫組與噴砂堿熱低溫組的細胞活性也高于噴砂酸蝕組(P＜0.05)；此外，接種5天、7天后，噴砂堿熱高溫組細胞活性比噴砂堿熱低溫組更高(P＜0.05)，提示鈦表面微米形貌與微納米形貌均能促進rBMSCs增殖，鈦表面微納米形貌對rBMSCs增殖的促進作用更明顯(圖2)。

圖2 rBMSCs在不同鈦表面形貌的增殖情況(a：與同時間段光滑純鈦組比較；b：與同時間段噴砂酸蝕組比較；c：與同時間段噴砂堿熱高溫組比較；P＜0.05)

總蛋白濃度檢測結果證實，培養7天、14天時噴砂堿熱高溫組、噴砂堿熱低溫組與噴砂酸蝕組rBMSCs總蛋白濃度明顯高于光滑純鈦組(P＜0.05)；7天時噴砂堿熱低溫組總蛋白濃度比噴砂堿熱高溫組與噴砂酸蝕組都要高(P＜0.05)；14天時噴砂堿熱高溫組與噴砂堿熱低溫組總蛋白濃度明顯高于噴砂酸蝕組，噴砂堿熱低溫組亦高于噴砂堿熱高溫組(P＜0.05)，進一步說明鈦表面微納米形貌能明顯促進rBMSCs細胞數量的增多(圖3)。

圖3 接種在不同鈦表面形貌rBMSCs的總蛋白濃度(a：與同時間段光滑純鈦組比較；b：與同時間段噴砂酸蝕組比較；c：與同時間段噴砂堿熱高溫組比較；P＜0.05)

2.3 鈦表面微納米形貌促進rBMSCs成骨分化比較各組鈦表面形貌對rBMSCs成骨分化的影響，ALP活性檢測結果顯示：第7天、14天時噴砂酸蝕組、噴砂堿熱高溫組與噴砂堿熱低溫組rBMSCs的ALP活性均高于光滑純鈦組，而噴砂堿熱高溫組和噴砂堿熱低溫組的ALP活性相較噴砂酸蝕組也明顯升高，同時第7天時噴砂堿熱低溫組的ALP活性高于噴砂堿熱高溫組，結果具有統計學差異(P＜0.05)。這說明相較光滑純鈦表面，微米級以及微納米級鈦表面形貌均可促進成骨分化；其中，微納米形貌較微米形貌具有更強的促成骨能力(圖4)。

圖4 接種在不同鈦表面形貌rBMSCs的ALP活性(a：與同時間段光滑純鈦組比較；b：與同時間段噴砂酸蝕組比較；c：與同時間段噴砂堿熱高溫組比較；P＜0.05)

進一步采用qRT-PCR分析7天時各組表面形貌鈦片上rBMSCs成骨相關基因ALP、COL1與RUNX 2的m RNA水平差異，結果顯示：噴砂酸蝕組、噴砂堿熱高溫組與噴砂堿熱低溫組rBMSCs的ALP、COL1與RUNX2水平均明顯高于純鈦光滑組；同時，噴砂堿熱高溫組與噴砂堿熱低溫組的ALP、COL1與RUNX2表達水平相較噴砂酸蝕組也顯著升高，而噴砂堿熱低溫組ALP、RUNX 2水平高于噴砂堿熱高溫組，結果具有統計學差異(P＜0.05)，進一步說明鈦表面微納米形貌具有更強的促rBMSCs成骨分化能力(圖5)。

圖5 第7d接種在不同鈦表面形貌rBMSCs ALP、COL1與RUNX2的mRNA水平(a：與同時間段光滑純鈦組比較；b：與同時間段噴砂酸蝕組比較；c：與同時間段噴砂堿熱高溫組比較；P＜0.05)

3.討論

鈦及其合金具有良好的機械性能和生物相容性，已被作為牙種植體材料廣泛應用。鈦種植體表面改性可改變材料的理化性質和生物活性，通過調控成骨細胞粘附、增殖與分化能力等方式進一步影響種植體界面新骨形成。目前，鈦表面加工技術主要包括物理法、化學法和電化學法三大類。其中，物理法包括噴砂、物理氣相沉積、等離子噴涂和激光熔覆等，化學法包括酸堿法、化學氣相沉積、溶膠-凝膠沉積與離散晶體沉積等，電化學法包括粒子束輔助沉積、陽極氧化和微弧氧化等，這些技術被廣泛應用于鈦種植體的研發與臨床應用[8]。

鈦表面微米化處理可有效促進種植體周圍骨新生，已在臨床廣泛應用[3]。噴砂、噴砂酸蝕是最常用的微米孔/凹形貌制備技術，本研究通過噴砂酸蝕技術成功獲取典型微米凹坑形貌，證實該微米級形貌相較于光滑純鈦表面能明顯促進rBMSCs細胞增殖與成骨分化。然而，長時間化學處理可能影響鈦金屬機械特性，例如酸蝕可引起鈦表面微裂隙，降低種植體抗疲勞能力。

然而，越來越多的研究表明，種植體對骨組織的早期作用主要來自納米級表面形貌[4,9]。納米形貌具有更優異的生物學性能，促進種植體-骨界面新骨形成。目前認為，蛋白的吸附、細胞表面整合素信號的傳遞與細胞機械特性的改變是納米形貌影響骨結合的主要因素[9,10]。然而，也有研究報道，納米形貌修飾鈦表面后成骨細胞的粘附、增殖與分化能力并未顯著提高，單純的納米形貌不能保證良好的骨結合，微米形貌對骨結合的影響同樣重要[11]。

兼具微米級與納米級表面優點的鈦表面微納米形貌在種植體早期骨形成中意義重大：一方面，微米形貌增加骨結合面積，穩定血凝塊與胞外基質蛋白支架，為成骨細胞提供穩定微環境；另一方面，納米形貌模擬體內天然的細胞微環境，進一步促進蛋白吸附、成骨細胞粘附與分化[6,12-14]。目前，堿熱處理是制備生物活性納米結構的常用技術，通過純鈦與NaOH溶液反應形成鈦酸鈉凝膠，再經熱處理后轉變為更穩定的無定形鈦酸鈉，促進類骨磷灰石生成，增強骨結合能力[15]。

本研究首先通過噴砂技術將TiO2顆粒沖擊鈦表面形成微米級凹坑，然后分別采用堿熱高溫法與堿熱低溫法進一步制備納米針狀結構表面與納米網狀結構表面，并證實這兩種方法制備的微納米形貌比單純微米形貌具有更優的促rBMSCs細胞增殖與成骨分化能力。該結論與我們課題組前期在前成骨細胞MC3T3-E1中的研究結果相一致[7]。

綜上所述，本研究可通過噴砂堿熱高溫法與噴砂堿熱低溫法成功制備兼具微米-納米結構的鈦表面形貌，微納米形貌顯著促進rBMSCs增殖與成骨分化，有望應用于種植體表面改性與種植體周圍骨形成的改善，但其具體作用分子機制仍有待進一步研究。

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Role of different scale structures of titanium surface on the proliferation and osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymalstem cells

ZHOU Min,WU Dong-hui,WU Ya-lin,PANG Jing-wen,ZHUANG Xiu-mei
(Guangzhou Haizhu District Hospital of Stomatology,Guangzhou 510220,China)

Objective:To investigate the effect of titanium surface scale structures on the cell viability and osteogenic differentiation in rat bonemarrow mesenchymal stem cells(rBMSCs).M ethods:A lkali heat treatment at high and low temperatures were utilized to nano-modify sandblasted titanium w ith m icrotopographical surfaces,compared w ith microtopographical surfaces of conventional sandblast-acid etching and smooth surface in titanium control.rBMSCswere seeding on these four titanium discs,and the cell viability was detected at1,3,5 and 7 days by CCK8 assay.Total protein values and alkaline phosphatase(ALP)activity were exam ined at 7 and 14 days.qRT-PCR was used to detectmRNA expression of ALP,collagen-I(COL1)and runt related transcription factor 2(RUNX2)at7 days.The datewas statistically analyzed w ith SPSS13.0 software package.Results:Compared w ith Ticontroland sandblast-acid etching surfaces,rBMSCs on them icro-nanotopographical surface discs in alkali heat treatment at high temperatures gourp and low temperatures group exhibited enhanced cell viability,increased total protein values,up-regulated ALP activity and overexpression of ALP,COL1 and RUNX2 levels.Conclusion:M icro-nanotopographical surface of titanium implant promotes cell viability and osteogenic differentiation of rBMSCs.

Rat bonemarrow mesenchymal stem cells;Scale structures of titanium surface;Osteogenic differentiation;M icro-nanotopographicalsurface

R783.4

A

1672-2973(2017)05-0261-05

國家自然科學基金青年基金項目(項目編號：81600899)

周 敏 廣州市海珠區口腔醫院 碩士生 主治醫師 廣東 510220

武東輝 廣州市海珠區口腔醫院 碩士生 副主任醫師 廣東 510220

吳亞霖 廣州市至壹口腔門診部 碩士生 醫師 廣東 510040

龐靜雯 廣州市海珠區口腔醫院 碩士生 主治醫師 廣東 510220

莊秀妹 通訊作者 中山大學附屬孫逸仙紀念醫院口腔科 碩士生 主治醫師 廣東 510120

2017-05-15)