CNN1在結直腸癌中的表達及意義

謝春英,董宇賀,徐雪松,何成彥,孫景春，黃麗紅

(吉林大學中日聯誼醫院 檢驗科，吉林 長春130033)

CNN1在結直腸癌中的表達及意義

謝春英,董宇賀,徐雪松*,何成彥,孫景春，黃麗紅

(吉林大學中日聯誼醫院 檢驗科，吉林 長春130033)

目的探討鈣調蛋白Ⅰ(CNN1)在結直腸癌及癌旁組織中的表達及意義。方法采用液質聯用技術檢測結直腸癌中的差異蛋白，并用免疫印跡試驗驗證差異蛋白的表達。結果以配對癌旁正常組織為依據，本實驗共篩選出結直腸癌差異蛋白44個，下調蛋白23個，CNN1即為下調表達的蛋白之一。結論CNN1的低表達與多種癌癥相關，包括結直腸癌，因此CNN1可能作為一種癌癥抑制因子發揮作用。

結直腸癌；CNN1；液質聯用技術；免疫印跡

(ChinJLabDiagn,2017,21:1679)

結腸直腸癌是癌癥死亡的第四大常見原因，占所有癌癥死亡的8%[1]。在我國，結直腸癌的死亡率僅次于肺癌、胃癌、肝癌、食管癌居第五位[2]，其發病率仍逐漸上升，尤其在發展中國家的年輕人當中上升最快[3]，嚴重威脅著人類的健康。在過去的幾十年中，結直腸癌的發病機制一直是研究的熱點，但是很多的術后患者、腫瘤轉移患者的預后并不理想，因此早期診斷依然是治療結直腸癌的關鍵。研究發現鈣調蛋白Ⅰ(CNN1)在多種惡性腫瘤中低表達，是一種潛在的具有腫瘤診斷價值的廣譜標記物。本研究檢測了吉林大學中日聯誼醫院44例結直腸癌組織及癌旁正常組織中CNN1的表達情況，探討CNN1與結直腸癌的關系，以期能為結直腸癌的早期診斷、治療等提供新的有價值的理論依據。

1 材料和方法

1.1標本來源

本實驗所用的結直腸癌組織標本均經病理學檢查證實為腺癌，癌旁正常組織均取自癌組織上緣10 cm外，患者手術前均未接受任何方式的治療。依據上述標準，收集從吉林大學中日聯誼醫院接受手術治療的結直腸癌組織標本44例，手術即時沖洗取材，液氮速凍保存。

1.2方法

1.2.1主要試劑及儀器 TMED、苯甲基磺酰氟(PMSF) 、十二烷基磺酸鈉(SDS)、超純水購于Sigma公司。二硫代蘇糖醇(DTT)、DNA酶、RNA酶、測序級胰蛋白酶等購自Promeg公司。碘代乙酰胺(IAM) 、蛋白質定量試劑盒購于Bio-Rad公司。安捷倫1200series液相色譜儀，賽默飛世爾的 LTQXL質譜儀。

1.2.2樣本總蛋白的提取 ①取結直腸癌組織及癌旁正常組織各50 mg，研磨裂解至勻漿。②RCF：12 000 g，4℃離心1 h，取上清備用。③測定蛋白質含量：考馬斯亮藍染色，于595 nm處測蛋白濃度。④檢測結束，-80℃分裝保存。

1.2.3水解多肽混合物的制備 ①凍存總蛋白平衡至室溫，NH4HCO3溶解稀釋。②DTT調定至20 mmol/L的終濃度，56℃避光1 h。③室溫時加入IAM，混勻調定至50 mmol/L的終濃度，避光30 min。④按蛋白∶胰酶=50∶1的比例加入胰酶，37℃水浴箱過夜。⑤-80℃保存酶切產物。

1.2.4液質聯用分析及數據檢索 ①緩沖液A溶解樣品，取50 μg上樣，賽默飛世爾的LTQXL質譜儀檢測反相色譜洗脫的多肽。②質譜二級掃描應用數據依賴方式：以Thermo Fisher的Bioworks 3.3.1SP1軟件進行質譜數據的分析，Sequest算法檢索Uniprot_sprot數據庫，比較分析鑒定差異蛋白質。

1.2.5Western blot 通過SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉等操作來驗證目標蛋白CNN1在結直腸癌和癌旁組織的表達情況。免疫印跡所用CNN1單抗購于Santa Cruz公司，其內參為β-actin。

2 結果

2.1液質聯用分析差異蛋白

蛋白質豐度使用譜圖數來評價，對于豐度有差異的蛋白質，譜圖數需要同時滿足以下兩個條件：①蛋白譜圖數的差值在兩個樣品中要大于或等于72；②兩樣品中蛋白譜圖數的比值要大于或等于1。按照以上標準得到結直腸癌與癌旁組織的差異蛋白44個，其中上調表達蛋白21個，下調蛋白23個。本文著重探討下調表達的CNN1，CNN1的質譜圖見圖1。

圖1 CNN1的質譜圖

2.2Westernblot

免疫印跡試驗驗證了CNN1在結直腸癌組織和配對的癌旁組織中的表達情況，如圖2，可見CNN1在癌組織的表達水平明顯低于配對的癌旁組織。

圖2 CNN1的免疫印跡圖

3 討論

CNN1(basic calponin or calponin h1)被稱為鈣調蛋白1，也被稱為心肌和平滑肌的分化標記[4]，是鈣調蛋白三個亞型之一，編碼該蛋白的基因在人類19號染色體(19p13.2-p13.1)上[5]。CNN1是分子量為34 kDa的線性分子，首次發現于牛的主動脈和雞的平滑肌中，后來被證明在大多數脊椎動物的平滑肌中都存在著CNN1。CNN1在生理狀態下與肌動蛋白、原肌球蛋白和鈣調蛋白結合，參與平滑肌收縮的調控和細胞增殖[6];在各種病理狀態下，比如異常的胃腸蠕動[7]、缺氧[8]等都會引起CNN1表達的異常。

腫瘤的生長、轉移和傳播都依賴于血管，由于不成熟的微血管是不規則的、彎曲的、滲漏的，與成熟血管相比腫瘤細胞可能更容易進入微血管，從而導致腫瘤轉移。CNN1在血管的成熟過程中扮演著重要的角色，CNN1能穩定肌動蛋白并抑制細胞運動[9]。腫瘤細胞中的CNN1能夠抑制腫瘤的增殖、克隆以及致瘤性，同時抑制腫瘤細胞的運動性和侵入性[10]。有研究證明敲除編碼CNN1的基因，會導致血管、腹膜等組織形態上的脆性，從而加速腫瘤的血管轉移和腹膜轉移[11]。大量的研究證明CNN1在多種腫瘤組織中都低表達，比如膀胱癌[12]、惡性黑色素瘤[13]、肝細胞癌[14]、卵巢癌[15]、乳腺癌[16]等，并且在腎細胞癌[17]中的低表達與腫瘤的大小、類型、浸潤程度等相關，而且有研究表明CNN1在癌前病變中也低表達[18]，這些臨床病理結果都提示我們CNN1作為一種可靠的腫瘤標志物的有效性和可探索性。本研究通過液質聯用技術檢測到了CNN1在結直腸癌中的低表達,并通過免疫印跡試驗進行了驗證，與上述腫瘤中CNN1的表達情況一致。究竟CNN1能不能成為結直腸癌早期診斷的標志物還有待于進一步的探索研究。

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TheExpressionandSignificanceofCNN1inColorectalcancer

XIEChun-ying,DONGYu-he,XUXue-song,etal.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

ObjectiveTo investigate the expression and significance of CNN1 in colorectal cancer and adjacent tissues.MethodsTwo-dimensional chromatography and mass spectrometry were used to detect the different proteins of colorectal cancer,in addition,the expression of diferential proteins were verified by Western blot.ResultsForty-four differentially expressed proteins were detected in colorectal cancer based on the corresponding non-tumor normal tissues,and 23 of them were down-regulated,in which,CNN1 was one of the down regulated proteins.ConclusionThe low expression of CNN1 has a relationship with a varity of cancers ,including colorectal cancer,so CNN1 may play a role as a cancer suppressor.

colorectal cancer;CNN1;Two-dimensional chromatography and mass spectrometry;western blot

R735.3+5 R735.3+7

A

2016-10-08)

國家自然科學基金(81572082)；吉林省科學技術廳項目(2011713,20150414015GH,20150101153JC);吉林省財政廳項目(SCZSY201517)

*通訊作者

1007-4287(2017)10-1679-03