廣西早期梅毒患者梅毒螺旋體基因分型研究

朱邦勇 李偉 段家俊 張杰 韋江平 周志光 黃耿 唐中書 陳羽建 曹娟 甘泉 黃寅杰

530007南寧，廣西壯族自治區皮膚病防治研究所中心實驗室

廣西早期梅毒患者梅毒螺旋體基因分型研究

朱邦勇 李偉 段家俊 張杰 韋江平 周志光 黃耿 唐中書 陳羽建 曹娟 甘泉 黃寅杰

530007南寧，廣西壯族自治區皮膚病防治研究所中心實驗室

目的了解廣西部分市梅毒螺旋體（Tp）的基因分型狀況。方法從2012年1月至2016年7月在廣西性病門診收集疑似早期梅毒患者300例，采集皮損處組織液，用鍍銀染色法檢測梅毒螺旋體，同時采用PCR擴增Tp polA基因，進行早期梅毒的診斷。對早期梅毒確診病例進行Tp的arp基因60個堿基對重復序列的數目、tprⅡ基因MseⅠ酶切后限制性片段長度多態性的型別和tp0548基因序列的型別進行鑒別，依據結果進行綜合分析以判斷梅毒基因型。結果共確診早期梅毒患者215例，其中梅毒PCR檢測出210例陽性，檢出率97.7%，鍍銀染色法檢測出105例陽性，檢出率48.8%，PCR法陽性率顯著高于鍍銀染色法（χ2=103.01，P＜0.05）。在PCR陽性標本中，共190例可進行三基因完全分型，總計分出17個基因型別，14d/f有86例（45.3%），具有絕對的流行優勢，其他亞型依次為15d/f（13.7%、26/190）、16d/f（11.6%、22/190）、17d/f（7.4%、14/190）、13d/f（6.8%、13/190）、10d/f（4.2%、8/190）、18d/f（1.6%、3/190）、16a/f（1.6%、3/190）、5d/f（1.1%、2/190）、7d/f（1.1%、2/190）、12d/f（1.1%、2/190）、16d/e（1.1%、2/190）、14a/f（1.1%、2/190）、9h/c（1.1%、2/190）、15l/f（0.5%、1/190）、25a/e（0.5%、1/190）、15i/f（0.5%、1/190）。結論廣西早期梅毒患者的梅毒螺旋體基因型別具有多樣性，其中以14d/f型為優勢型。

梅毒；蒼白密螺旋體；基因分型技術；聚合酶鏈反應；銀染色法

梅毒分型系統是開展梅毒分子流行病學研究的重要手段。Pillay等［1］首次提出了操作簡便、具有實用性的基因分型系統，從而使得對梅毒分子流行病學的研究進入嶄新的發展時期。本研究采用三基因定位法（酸性重復蛋白基因arp、梅毒螺旋體重復基因家族tpr和tp0548）進行梅毒螺旋體基因分型，該方法分析出的基因型別有助于研究和分析梅毒傳播的性網絡關系和范圍，為分析梅毒的流行特征、傳染源來源、爆發菌株、確定高危核心人群、制定防治策略及其效果評價提供依據。現將結果報告如下。

一、材料與方法

1.主要試劑與儀器：DNA提取試劑盒為美國Qiagen公司產品，DNA聚合酶和dNTPs為美國Promega公司產品。MseⅠ內切酶和100 bp DNA標準參照物為美國NEB公司產品。擴增引物由Invitrogen（上海）貿易有限公司合成。PCR擴增儀（CFX96）和凝膠成像系統（Gel DocTM XR+）均為美國Bio-rad公司產品。

2.對象與標本采集：收集2012年1月至2016年7月廣西南寧、玉林、柳州和防城港市性病門診共300例疑似早期梅毒患者。所有患者有硬下疳或生殖器潰瘍、梅毒疹、扁平濕疣或黏膜斑等臨床表現。其中男248例，女52例，年齡17～81（37.5±15.28）歲。采集標本時先用無菌氯化鈉生理溶液清洗皮損表面，再用鈍刀擠壓并輕刮皮損表面，避免有血液流出，將滲出液分兩部分處理，一份直接進行鍍銀染色鏡檢，另一份洗入含有細胞裂解液的標本管中，編號后放入-80℃超低溫冰箱中保存。

3.早期梅毒的檢測與診斷：

（1）鍍銀染色法：將組織液涂抹在載玻片上制成薄片，于空氣中自然干燥，然后用羅吉固定液固定2～3 min，再用無水乙醇洗滌玻片上的油污后，加鞣酸媒染劑于涂片上，微加熱產生蒸汽，染30 s，水洗，加Fontana銀染液于涂片上，微加熱產生蒸汽，染30 s，水洗后待干，最后用油鏡觀察特征性的被染成棕褐色的梅毒螺旋體。

（2）Tp特異的polA基因PCR擴增［2］：將Tp Nichols標準株（中國疾病預防控制中心性病控制中心提供）和-80℃超低溫條件下凍存的臨床株DNA提取液置于室溫環境中凍融，16 500×g離心10 min，進行Tp polA PCR擴增。5 μl DNA模板加入50 μl反應體系，包括0.2 mmol/L dNTPs 1 μl、2.5 mmol/L MgCl25 μl、1 × PBS 10 μl、0.6 μmol/L 上游引物（5′-TGCGCGTGTGCGAATGGTGTGGTC-3′）1.5 μl，0.6 μmol/L下游引物（5′-CACAGTGCTCAAAAACGCCTGCACG-3′）1.5 μl、DNA聚合酶2.5 U（0.5 μl）以及雙蒸水25.5 μl。反應條件為95℃預變性15 min，95℃ 40 s，65℃ 1 min，72℃ 1 min，共40個循環，72℃延伸5 min。20 μl的PCR擴增產物和100 bp的DNA Marker注入1.5%瓊脂糖凝膠，100 V電泳60 min，并在凝膠成像儀中觀察結果，目的擴增產物377 bp。

（3）早期梅毒的判斷標準：一期梅毒：有硬下疳或生殖器潰瘍等臨床表現結合病原學檢查（鍍銀染色法或PCR）陽性或梅毒血清學試驗陽性［梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA）陽性或甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）］。二期梅毒：有梅毒疹或扁平濕疣或黏膜斑等臨床表現并結合病原學檢查（鍍銀染色法或PCR）陽性或梅毒血清學試驗（TRUST和TPPA）陽性。

4.分型方法：采用三基因分型法，即將arp基因含有的60個堿基對重復序列的數目、tprⅡ基因MseⅠ酶切后限制性片段長度多態性（RFLP）的型別和tp0548基因序列的型別組成一個完整的基因型別［arp］［tprⅡ］/［tp0548］，對梅毒螺旋體進行基因分型。三種基因分型的PCR方法參考文獻［3］，其中arp基因60 bp相似重復序列數目分析，采用Quantity One軟件分析確定堿基對數，并與Nichols株（1 155 bp，14個重復序列）進行比對，每相差60 bp的堿基被定義為增加或減少1個重復序列；tprⅡ基因MseⅠ酶切后RFLP分析，將電泳條帶與文獻記載的16種條帶（a～p）比對，確定型別；tp0548基因序列分析，測序結果用DNAstar5.0軟件與a～i型標準序列比對，從而確定型別。

5.統計學分析：采用SPSS13.0軟件進行分析，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

二、結果

1.鍍銀染色法與PCR法檢測結果比較：300例疑似早期梅毒病例，根據早期梅毒的判斷標準，通過臨床表現和實驗室4種方法的檢測結果及隨訪檢測進行綜合分析，最終確診為早期梅毒215例，另外85例為非梅毒感染病例。在215例確診的早期梅毒病例中，PCR檢測出210例陽性，檢出率為97.7%，鍍銀染色法檢測出105例陽性，檢出率為48.8%。其中鍍銀染色陽性標本其PCR結果均為陽性，兩種方法經χ2檢驗發現PCR法陽性率顯著高于鍍銀染色法，χ2=103.01，P＜ 0.05，見表1。在210例PCR陽性病例中，114例為一期梅毒，鍍銀染色法檢出89例陽性（78%），96例為二期梅毒，鍍銀染色法檢出16例陽性（17%），5例兩種方法檢測為陰性的病例均為二期梅毒。300例中，血清學抗體TPPA和TRUST均陽性196例，其中一期梅毒96例，二期梅毒100例；另外在一期梅毒中TPPA陽性，TRUST陰性12例。

2.三基因定位法對臨床菌株的基因型別分析：梅毒PCR檢測陽性標本210例，所有陽性標本均進行三基因分型，其中arp基因分型有效菌株195例（92.9%），共分出12個型別（5、7、9、10、12、13、14、15、16、17、18、25），tprⅡ基因分型有效菌株190例（90.5%），共分出5個型別（a、d、h、i、l），tp0548基因分型有效菌株198例（94.3%），共分出3個型別（c、e、f）。綜合三基因分型結果有效190個菌株進行綜合分析，總計分出17個基因型別，其中14d/f有86例（45.3%），具有絕對的流行優勢，其他亞型依次為15d/f（13.7%、26/190）、16d/f（11.6%、22/190）、17d/f（7.4%、14/190）、13d/f（6.8%、13/190）、10d/f（4.2%、8/190）、18d/f（1.6%、3/190）、16a/f（1.6%、3/190）、5d/f（1.1%、2/190）、7d/f（1.1%、2/190）、12d/f（1.1%、2/190）、16d/e（1.1%、2/190）、14a/f（1.1%、2/190）、9h/c（1.1%、2/190）、15l/f（0.5%、1/190）、25a/e（0.5%、1/190）、15i/f（0.5%、1/190）。見圖1。

三、討論

梅毒病原學檢測是梅毒實驗室診斷的重要手段，其中暗視野顯微鏡和鍍銀染色法可直接檢測早期梅毒螺旋體，是早期梅毒患者實驗室診斷的常用方法，但由于暗視野顯微鏡價格昂貴，且需要嚴格的技術和檢測時間、較高的環境要求和豐富的經驗而限制其普及應用。鍍銀染色法操作簡便，設備要求簡單，更易被常規實驗室接受而得到普及。同時我們采用PCR技術進行Tp的polA基因檢測，對疑似早期梅毒的組織液標本梅毒陽性檢出率為97.7%，明顯高于鍍銀染色法陽性檢出率（48.8%），這與兩者方法操作、人為因素及標本里病原體的含量有直接關系。雖然兩方法檢出率有一定差異，但不同條件的實驗室可采用不同的方法進行早期梅毒的病原學診斷。由于早期梅毒存在抗體窗口期，特別是一期梅毒。本研究發現，一期梅毒血清學抗體均陰性7例，特異性抗體陽性而非特異性抗體陰性12例，因此病原學診斷可作為梅毒血清學診斷的補充，特別是血清學陰性而臨床高度懷疑梅毒的患者，從而提高梅毒的診斷效率，做到早診斷早治療，減少梅毒的傳播。

表1 PCR法與鍍銀染色法對梅毒螺旋體的檢測結果分析

圖1 廣西地區早期梅毒患者190例梅毒螺旋體臨床株［arp］［tprⅡ］/［tp0548］三基因分型結果

梅毒螺旋體基因分型系統是梅毒分子流行病學重要的研究手段，有助于闡述基因型別與菌株的毒力、侵襲性之間的關系。我們的研究采用三基因聯合的Tp基因分型系統，該系統是基于arp基因、tpr基因和tp0458基因具有高敏感性、高特異性和強區分度的特點，其完整分型敏感性達到90%以上，遠高于以往皮損組織液標本雙基因完整分型的敏感性（僅80%）［4-6］。本研究綜合三基因分型結果進行分析，190份標本共分出17個基因型別，說明廣西梅毒基因型具有豐富多樣性，其原因可能是梅毒的流行時間較長，患者未經治療或治療不徹底，梅毒螺旋體在體內發生變異以及人群的流動性等。另外從型別分析看，14d/f占45.3%，具有絕對的流行優勢，這與上海的一項研究結果相似［7］，可能與14d/f基因型的傳染性和毒力相對其他型別更強有關，其他的流行型別依次是15d/f（13.7%）、16d/f（11.6%）、17d/f（7.4%）、13d/f（6.8%）和10d/f（4.2%）等。另外本研究僅對皮損組織液進行檢測，且只收集廣西4市的病例，有一定的局限性。今后應擴展標本類型及擴大更多城市的病例進行基因分型研究，以期反映廣西梅毒螺旋體的分子流行病學特征。

［1］Pillay A,Liu H,Chen CY,et al.Molecular subtyping ofTreponema pallidumsubspecies pallidum［J］.Sex Transm Dis,1998,25（8）:408-414.DOI:10.1097/00007435-199809000-00004.

［2］Liu H,Rodes B,Chen CY,et al.New tests for syphilis:rational design of a PCR method for detection ofTreponema pallidumin clinical specimens using unique regions of the DNA polymerase I gene［J］.J Clin Microbiol,2001,39（5）:1941-1946.DOI:10.1128/JCM.39.5.1941-1946.2001.

［3］彭銳銳,尹躍平,魏萬惠,等.三基因分型法檢測梅毒螺旋體基因型別［J］.中華皮膚科雜志,2011,44（11）:779-782.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2011.11.007.

［4］Cole MJ,Chisholm SA,Palmer HM,et al.Molecular epidemiology of syphilis in Scotland［J］.Sex Transm Infect,2009,85（6）:447-451.DOI:10.1136/sti.2009.036301.

［5］曾鐵兵,吳移謀,黃澍杰,等.衡陽和江門地區梅毒螺旋體基因分型的初步研究［J］.中華皮膚科雜志,2004,37（12）:692-694.DOI:10.3760/j.issn:0412-4030.2004.12.003.

［6］鄭和平,歐志英,胡玉山,等.梅毒螺旋體的巢式PCR檢測與基因分型［J］.中華皮膚科雜志,2005,38（9）:546-548.DOI:10.3760/j.issn:0412-4030.2005.09.005.

［7］Dai T,Li K,Lu H,et al.Molecular typing ofTreponema pallidum:a 5-year surveillance in Shanghai,China［J］.J Clin Microbiol,2012,50（11）:3674-3677.DOI:10.1128/JCM.01195-12.

Genotyping of Treponema pallidum in patients with early syphilis in Guangxi province

Zhu Bangyong,Li Wei,Duan Jiajun,Zhang Jie,Wei Jiangping,Zhou Zhiguang,Huang Geng,Tang Zhongshu,Chen Yujian,Cao Juan,Gan Quan,Huang Yinjie
Central Laboratory,Institute of Dermatology,Guangxi Autonomous Region,Nanning 530003,China

Li Wei,Email:13317611981@163.com

ObjectiveTo investigate genotyps ofTreponema pallidum（Tp）in several cities in Guangxi province.MethodsA total of 300 patients with suspected early syphilis were enrolled from STD clinics in Guangxi between January 2012 and July 2016,and tissue fluid samples were collected from skin lesions.Silver staining was performed to detect Tp,and PCR to amplify the Tp polA gene for the diagnosis of early syphilis.Positive samples were subjected to PCR amplification of a 60-bp tandem repeat region within the arp gene,restriction fragment length polymorphism（RFLP）analysis of the tprⅡgene after digestion with MseⅠenzyme and tp0548 genotyping.ResultsFinally,215 patients were diagnosed with early syphilis,including 210（97.7%）patients positive for PCR and 105（48.8%）patients positive for silver staining,and the positive rate significantly differed between the two methods（χ2=103.01,P＜ 0.05）.Among the PCR-positive samples,190 could be genotyped by analysis of three target genes,and 17 genotypes were identified.The genotype 14d/f was predominant（45.3%,86/190）,followed by 15d/f（13.7%,26/190）,16d/f（11.6%,22/190）,17d/f（7.4%,14/190）,13d/f（6.8%,13/190）,10d/f（4.2%,8/190）,18d/f（1.6%,3/190）,16a/f（1.6%,3/190）,5d/f（1.1%,2/190）,7d/f（1.1%,2/190）,12d/f（1.1%,2/190）,16d/e（1.1%,2/190）,14a/f（1.1%,2/190）,9h/c（1.1%,2/190）,15l/f（0.5%,1/190）,25a/e（0.5%,1/190）,15i/f（0.5%,1/190）.ConclusionTp genotypes are diversified in patients with early syphilis in Guangxi,and the genotype 14 d/f is predominant.

Syphilis;Treponema pallidum;Genotyping techniques;Polymerase chain reaction;Silver staining

李偉，Email：13317611981@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.05.014

廣西醫療衛生適宜技術研究與開發項目（S201539）

Fund program:Appropriate Technology for Health Care Research and Development Projects of Guangxi Province of China（S201539）

2016-08-04）

（本文編輯：顏艷）