黑木耳菌種母種的生產(chǎn)技術(shù)

●食用菌栽培●

黑木耳菌種母種的生產(chǎn)技術(shù)

1 母種培養(yǎng)基配方

母種培養(yǎng)基用試管作培養(yǎng)容器，裝入培養(yǎng)液并經(jīng)過高壓滅菌后擺成斜面，所以又稱試管斜面培養(yǎng)基，常用于母種擴大培養(yǎng)及菌種保存。

1.1 生產(chǎn)母種配方

1.1.1 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂18～20克，水1000毫升。

1.1.2 馬鈴薯葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯200克，蛋白胨10克，葡萄糖20克，瓊脂20克，水1000毫升。

1.1.3 洋蔥醬油瓊脂培養(yǎng)基：洋蔥煎汁100毫升，醬油50毫升，瓊脂20克，水1000毫升。

1.1.4 木汁麩皮瓊脂培養(yǎng)基：闊葉樹木片500克，硫酸銨1克，麩皮或米糠100克，蔗糖20克，瓊脂20克，水1000毫升。

1.1.5 木屑煮汁培養(yǎng)基：闊葉硬雜木屑40克，馬鈴薯200克，蔗糖20克，瓊脂18～20克，水1000毫升。

1.2 保藏菌種配方

1.2.1 玉米粉瓊脂培養(yǎng)基：玉米粉30克，瓊脂20克，水1000毫升。

1.2.2 玉米粉酵母膏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：玉米粉50克，酵母膏10克，葡萄糖10克，瓊脂15～18克，蒸餾水1000毫升。

1.2.3 完全培養(yǎng)基：葡萄糖20克，蛋白胨2克，硫酸鎂0.5克，磷酸氫二鉀1克，磷酸二氫鉀0.5克，瓊脂15克，蒸餾水1000毫升。

2 培養(yǎng)基制作

2.1 稱量和配制

先按配方準確稱取易溶物質(zhì)，置于燒杯或搪瓷杯等容器內(nèi)（不用銅、鐵器皿，以免銅、鐵銹混入培養(yǎng)基），加入總量1/4～1/3的清水攪成糊狀。難溶物質(zhì)按配方稱取后加適量清水，加熱并不斷攪拌使其溶解；微量元素和生長素因需要量少難以準確稱取，可稱取一定量先溶解調(diào)成高濃度母液，再按比例換算后從中取出需要的用量。

去皮挖芽眼切塊的馬鈴薯、闊葉樹木片、闊葉硬雜木屑及洋蔥等物質(zhì)，按配方稱后放入容器內(nèi)，加清水1000毫升，文火煮沸20～30分鐘，然后用4～6層濕紗布過濾取汁。玉米粉稱后加1000毫升清水攪拌均勻，并加熱至70℃保持60分鐘，再用濕紗布過濾取汁，最后補足水量至1000毫升。在配制合成培養(yǎng)基過程中，溶解后再加主要元素，然后加微量元素，最后加維生素和生長素的加料順序進行配制。每種營養(yǎng)成分溶解后再加入第二種營養(yǎng)成分。如果各種成分均不產(chǎn)生沉淀，也可一起加入。如果需要培養(yǎng)基清亮透明，可將溶化好的培養(yǎng)基用濕紗布趁熱過濾。

2.2 測定和調(diào)整酸堿度

培養(yǎng)基溶液的酸堿度用pH來表示，pH是溶液中氫離子濃度的負對數(shù)。由于純水的氫離子濃度為10-7克分子，它的pH為7，所以以pH等于7的溶液為中性。pH大于7為堿性，pH小于7為酸性。每種食用菌只能在一定pH范圍內(nèi)生長。細菌和放線菌喜歡中性偏堿（pH在7～7.6）的環(huán)境。酵母菌、霉菌和擔子菌喜歡微酸性（pH值5～6.5）環(huán)境條件。黑木耳菌絲生長適宜的pH在6～6.8之間，在制備培養(yǎng)基時需測定并調(diào)整培養(yǎng)基pH至所需范圍。

測定pH常用pH試紙或酸度計測定并加以矯正。市場上銷售的pH試紙有廣泛試紙和精密試紙兩種。食用菌制種常用pH試紙為5.5～6.8的精密試紙。測定方法是取培養(yǎng)基液滴加到試紙上，或用鑷子夾住小段試紙伸入培養(yǎng)基，使其發(fā)生化學反應，試紙顏色立即發(fā)生變化，然后取出小段試紙與標準比色板比較，找到與比色板上色帶一致者，其數(shù)值即為該培養(yǎng)基的pH值。如果培養(yǎng)基pH不在培養(yǎng)食用菌的生長要求，要進行調(diào)整。培養(yǎng)基過酸可用稀堿，即10%氫氧化鈉液調(diào)整。如果培養(yǎng)基過堿，則用稀鹽酸或乳酸液調(diào)整。調(diào)整時要細心，幾滴幾滴地加堿或酸，不可調(diào)得過堿或過酸，以免某些成分遭到破壞。

2.3 加入瓊脂并分裝

將稱好的瓊脂剪成小塊，加入配好的液體培養(yǎng)基中，邊加熱邊攪拌，防止培養(yǎng)基沉到鍋底燒焦或溢出，燒糊的培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)遭到破壞，而且易產(chǎn)生對黑木耳菌絲生長有害的物質(zhì)，不宜再用。加熱過程損失的水分應補足。待瓊脂完全溶化后，用濕紗布（紗布經(jīng)熱水浸后擰干）迅速過濾，以提高培養(yǎng)基的透明度，過濾后趁熱分裝。

分裝前準備好容器，制作母種常用試管規(guī)格為18毫米×180毫米、20毫米×200毫米或25毫米×200毫米等。所用試管先清洗、干燥。新購買的試管因管內(nèi)殘留燒堿，最好先用稀硫酸液在不銹鋼鍋中煮沸，再沖洗干凈，倒置晾干后備用。切忽現(xiàn)洗現(xiàn)用，以免因試管附有水膜，導致培養(yǎng)基在試管內(nèi)滑動。

分裝試管時盡量避免培養(yǎng)基粘附試管口，如果不慎培養(yǎng)基粘試管口用紗布擦凈，以免培養(yǎng)基粘住棉塞影響接種，增加雜菌污染機率。試管裝量根據(jù)需要而定，制作斜面培養(yǎng)基裝量為試管高度1/5～1/4；制作深層培養(yǎng)基裝量為試管高度的1/2～2/3。裝入三角瓶培養(yǎng)基的量不超過瓶容量的1/3。分裝時用漏斗置漏斗架上進行。

2.4 塞棉塞

棉塞能過濾空氣，防止雜菌侵入，減緩培養(yǎng)基水分蒸發(fā)。試管培養(yǎng)基分裝好后及時加蓋棉塞。棉塞用普通棉花制作，不使用脫脂棉，因脫脂棉極易吸水變潮，污染雜菌。棉塞大小、松緊與試管口或三角瓶口徑一致，塞入試管的棉塞要緊貼管壁、不留縫隙。過緊防礙空氣流通，不便操作；過松達不到過濾雜菌的目的，且棉塞易掉入試管內(nèi)或脫離試管口。松緊度以提起棉塞后試管跟著提起而不脫落，拔出棉塞可聽到輕微聲音為度。標準棉塞塞頭略大，不易變形，塞入試管部分占棉塞總長的2/3，露在試管外部為1/3（且不少于1厘米）。

3 高壓滅菌

3.1 試管培養(yǎng)基裝鍋

塞好棉塞的試管培養(yǎng)基7～10支為1捆用膠套捆好。為避免滅菌時冷凝水淋濕棉塞，在棉塞外包扎一層牛皮紙或兩層舊報紙，或?qū)⒃嚬苎b在鐵絲筐內(nèi)，再在棉塞外包扎牛皮紙。裝鍋時試管均要豎放，切鐵傾斜或臥置，并且按照對角線方法蓋緊鍋蓋。

3.2 高壓滅菌

蓋好高壓蒸汽滅菌鍋后接通電源，待壓力升至0.05兆帕時打開排氣閥，放盡冷空氣，再加熱至0.11～0.14兆帕維持25～30分鐘后，停止加熱，使鍋內(nèi)壓力自然下降。達到0.05兆帕時打開放氣閥，鍋內(nèi)壓力降至零后再打開鍋蓋，利用余熱糞干棉塞。滅菌時間過長易破壞培養(yǎng)基中的有效成分，增加酸度，致使培養(yǎng)基減固不好。

3.3 擺斜面冷卻

當高壓蒸汽滅菌鍋壓力降至零后，先將高壓鍋蓋打開一條縫，使熱氣逸出，3～5分鐘后打開鍋蓋，利用鍋體的余熱將棉塞烘干，防止棉塞受潮。溫度降至55～60℃時擺斜面，以防止冷凝水在試管內(nèi)積聚過多。擺試管斜面時，試管下面熱1厘米厚木板，斜面長度為試管長度的1/2～2/3，待冷卻后即成斜面培養(yǎng)基。在冷天制作斜面或平板培養(yǎng)基時，在斜面或平板培養(yǎng)基擺好后，馬上在試管培養(yǎng)基上覆蓋一層潔凈的棉墊，以免斜面管壁和平板培養(yǎng)皿壁產(chǎn)生大量的冷凝水珠，影響接種和培養(yǎng)。

4 無菌接種

4.1 接種室消毒

接種室在使用前一天密閉，按每立方米空間用10毫升甲醛溶液與7克高錳酸鉀混合熏蒸消毒，24小時后打開門窗，放出氣體甲醛后使用。接種前把母種培養(yǎng)基、母種及接種工具放入接種室。先用3%來蘇兒或5%石碳酸水溶液噴霧消毒，使空氣中的微生物沉降到地面并殺死雜菌，然后打開紫外線燈照射30分鐘。接種人員進入接種室要穿白大褂、拖鞋、戴帽子和口罩，接種前雙手用75%酒精棉球擦洗消毒，動用輕緩，盡量減少空氣流動。

4.2 接種室消毒滅菌效果檢驗

接種室接種前采用化學法進行消毒滅菌，滅菌效果受藥劑有效期及操作等因素影響較大。應定期進行消毒效果和空氣污染程度檢驗，以便更換消毒藥劑，改進消毒措施。

4.2.1 檢驗方法：①平板法：配制肉湯瓊脂培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，按無菌操作規(guī)程分別將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中制成平板，每種培養(yǎng)基各取6個，同時放入接種室內(nèi)。檢驗時按無菌操作法各打開3個皿蓋，暴露一定時間后再重新蓋好，另3個不打開皿蓋作對照。然后將兩組培養(yǎng)皿一起置于30℃溫度條件培養(yǎng)，48小時后檢查有無菌落出現(xiàn)。②斜面法：取肉湯瓊脂培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基斜面試管各6支，放入接種室內(nèi)，按無菌操作法各打開其中3支試管棉塞暴露一定時間后重新加蓋棉塞，另3支試管不打開棉塞作對照，然后將兩組試管一起置30℃溫度條件培養(yǎng)，48小時后檢查有無菌落出現(xiàn)。

4.2.2 檢驗結(jié)果：平板或斜面在30℃培養(yǎng)48小時后取出觀察，根據(jù)有無菌落、菌落個數(shù)和形態(tài)判斷空氣被污染程度和雜菌種類。合格標準：平板培養(yǎng)皿打開皿蓋5分鐘不超過3個菌落；試管斜面打開棉塞30分鐘不長雜菌菌落。如果生長菌落超過這個數(shù)字，就要采取措施提高滅菌效果。如果是用紫外線燈照射達不到滅菌要求，可調(diào)整紫外線燈照射時間或懸掛高度，或更換新燈管。從菌落形態(tài)看，如果是霉菌居多，可先用5%石碳酸水溶液對接種室進行全面噴霧，再用甲醛薰蒸；如果是細菌居多，采用乳酸和甲醛交替薰蒸效果好。

4.3 無菌接種

4.3.1 接種準備：接種前對接種室進行消毒，準備好接種工具，包括接種針和接種鉤。

4.3.2 接種方法：接種前用肥皂水洗手，擦干后再用70%～75%酒精棉球擦試雙手、母種試管及接種鉤。先在試管培養(yǎng)基上貼標簽，注明功種名稱和接種日期。然后點燃酒精燈，將母種和斜面基的兩支試管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指拉于兩支試管之間，斜面朝上，使試管處于水平狀態(tài)。先將棉塞用右手擰轉(zhuǎn)松動，以利接種時拔出。右手像握筆一樣拿接種鉤，并在火焰上方灼燒滅菌。凡在接種時進行試管部門都用酒精燈火燃灼燒滅菌，操作時要使試管口靠近酒精燈火焰旁。用右手小拇指、無名指、中指同時拔掉兩支試管棉塞，并用手指夾緊試管棉塞。用火焰灼燒試管口，灼燒時不斷轉(zhuǎn)動試管，殺死試管口上的雜菌。將灼燒滅菌的接種鉤伸入母種試管內(nèi)，先接觸沒長菌絲的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，避免燙死菌絲。輕輕挑取少許黑木耳菌絲，迅速將接種鉤抽出試管，注意不要使接種鉤碰到試管壁。在酒精燈火焰旁迅速將接種鉤伸入待接種的試管內(nèi)，將挑取的菌絲塊放在斜面培養(yǎng)基中央。抽出接種鉤放入母種試管內(nèi)，應特別注意不要劃破培養(yǎng)基、不使菌種沾在試管壁上。灼燒培養(yǎng)基試管口，并在火焰旁將棉塞塞好，塞棉塞時不要用試管支迎棉塞，以免試管在移動時進入雜菌，然后接種下一支試管。1支試管母種可轉(zhuǎn)接30～40支。

5 恒溫培養(yǎng)

接種后將試管放入24～26℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，接種后的菌種塊上開始萌發(fā)出新菌絲，13～15天菌絲長滿試管斜面培養(yǎng)基。

接種3～5天檢查雜菌污染情況，在試管斜面培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)綠色、黃色、黑色等，不是白色、生長整齊一致的斑點、塊狀雜菌，應立即剔除。并把長滿試管的母種再次進行檢查，將菌絲生長致密、潔白、健壯，無任何雜菌感染的試管母種放入2～4℃冷藏冰箱中保存即可。