獼猴桃果酒皂土下膠計量評估實驗比較

郭 杰 ，孫中理 ，蔡海燕 ，余 杭 ，張 穎 ，張 翼

(1.四川省食品發酵工業研究設計院，四川成都611130； 2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川成都611130； 3.國家固態釀造工程技術研究中心，四川瀘州646000)

獼猴桃果酒皂土下膠計量評估實驗比較

郭 杰1，2，3，孫中理1，2，3，蔡海燕1，2，3，余 杭1，2，3，張 穎1，2，3，張 翼1，2，3

(1.四川省食品發酵工業研究設計院，四川成都611130； 2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川成都611130； 3.國家固態釀造工程技術研究中心，四川瀘州646000)

果酒產品常在貨架期內因物理、化學或微生物不穩定而產生渾濁、失光或沉淀現象。這種現象極大影響了產品的感官品質及銷售情況。生產中常用皂土下膠的方式避免其中因蛋白質不穩定而產生的渾濁沉淀問題。為預防皂土下膠過度或不足，常采用以下實驗方法評估皂土下膠計量：三氯乙酸（trichloroacetic acid）試劑法、加熱法及酒精沉淀法。本實驗以梯度皂土計量的下膠方式對獼猴桃果酒進行處理后，對此3種方法進行實驗比較。結果表明，三氯乙酸法所測定的下膠劑量較加熱法高；加熱法測定的下膠劑量接近自然條件下的沉淀劑量，其中6 h加熱處理較30 min加熱處理更適用于氣溫較高地區；酒精沉淀法在本實驗中無法測定下膠劑量。

獼猴桃果酒； 蛋白質穩定； 下膠； 皂土

果酒產品常在貨架期內因物理、化學或微生物不穩定而產生渾濁、失光或沉淀現象。這種現象極大影響了產品的感官品質及銷售情況。在生產過程中，為了避免部分因蛋白質或多酚類物質不穩定而引起的渾濁沉淀現象，常采用澄清劑去除酒液中的不穩定蛋白或已經產生的懸浮渾濁物[1]，皂土便是果酒中的常用澄清劑之一。

皂土（Bentonite），又稱膨潤土或蒙脫土（Mont-morillonite），其通用化學式為 Al2O34SiO2·nH2O-內嵌離子。皂土主要的存在形態呈極小的片狀結晶，且在水解過程中易形成膠體。水解后，四面體結構的SiO44-會在八面體結構的AlO66-上面與3個氧通過硅鍵鏈接（如圖1），多個此結構通過氫鍵鏈接形成薄片結構。四面體和八面體結構的電荷數不同，使其表面帶有負電荷，這也使得皂土薄片結構之間形成間隙，而內嵌的Na+或Ca2+的陽離子則存在于此間隙之間（見圖2）。由于果酒中的酸性環境使蛋白質或多酚類分子帶正電荷，所以在酒液環境內蛋白質分子會通過置換皂土間隙內的陽離子，形成沉淀，從而脫離酒液環境[2]。

圖1 SiO44-與AlO66-結構及其鏈接

圖2 蒙脫土結構示意圖[1]

下膠過度可能導致下膠劑在酒液中有殘留，或者去除了香氣物質；而下膠不足則會導致部分未沉淀的不穩定蛋白或多酚類物質在裝瓶之后，再次形成沉淀。對果酒進行下膠處理之前，為了預防因皂土下膠過度或者不足，常采取一系列的確定下膠劑量的相關試驗手段。生產中常用的試驗手段有：三氯乙酸（trichloroacetic acid）試劑測試法、加熱測試法及酒精沉淀測試法。這些實驗是通過分析下膠處理后的澄清酒液中的蛋白質穩定性來評估下膠劑量的。簡單來說，在通過一定劑量的皂土下膠處理后，如測定其蛋白質的穩定性較高且滿足相應的條件，則說明該劑量可以達到預期的效果，反之則說明劑量不足。3種實驗方法沉淀蛋白質的機理分別為：三氯乙酸試劑測試能使蛋白質構象發生改變,使得蛋白質結構中的疏水集團暴露，從而聚集沉淀[3]；加熱測試則是通過溫度升高使得蛋白質的2級、3級、4級結構改變，從而聚集沉淀[4]；而酒精沉淀測試則是由于酒精可破壞蛋白質的水化層，從而使蛋白質的溶解度下降而析出沉淀。

因為這些蛋白質穩定性的測試實驗機理不同，所以通過不同實驗方法所推測的蛋白質穩定性存在一定差異。本實驗采用梯度皂土劑量對獼猴桃酒進行下膠處理，然后通過4種方法測定其下膠劑量和預測蛋白質的穩定性，分析其結果的差異性。

1 材料與方法

1.1 材料

酒樣：產自四川省什邡市紅什2號獼猴桃所釀制的獼猴桃果酒。

儀器：小型Z6紙板過濾裝置；50 mm，0.45 μm水系針頭過濾器；水浴鍋、離心機；SGZ-200A型濁度計。

1.2 試驗方法

精確量取9份獼猴桃果酒酒液，每份700 mL，用完全水解的濃度為5%的皂土進行下膠處理。下膠皂土劑量分別為：0.1 g/L、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4g/L，留1份700 mL未處理的酒液作為對照樣。將每種酒液裝瓶密封，放置在室溫暗室沉淀7 d。所有酒液經過小型Z6紙板過濾機過濾、排氣處理之后，將每種酒液依次進行以下蛋白質穩定性測試。

1.2.1 三氯乙酸試劑測試法

測定澄清酒液的初始濁度。精確抽取20 mL的澄清酒液移至大試管中，加入2 mL的55%三氯乙酸溶液，混合均勻后在沸水中加熱2 min，冷卻至室溫后測量其濁度。

1.2.2 加熱測試法

表1 三氯乙酸試劑測試結果表

取100 mL酒液至密封小瓶內。將小瓶置于80℃的恒溫水浴加熱鍋內，加熱30 min后，搖晃均勻后取出20 mL酒液，冷卻至室溫測量其濁度。剩余酒液繼續加熱5.5 h，取出冷卻至室溫，測量其濁度。

1.2.3 酒精沉淀處理法

取出20 mL澄清酒液測量其初始濁度，之后移至大試管加入20 mL的99.5%vol酒精，混合均勻，測量其濁度。

2 結果與分析

2.1 三氯乙酸試劑測試(見表1)

根據Berg和Akyoshi[5]的研究，Coleman Nephlos值約等于5.6倍差值濁度，根據其實驗結果說明，Coleman Nephlos值與酒中蛋白質穩定程度的關系見表2。

表2 Coleman Nephlos與白葡萄酒中蛋白質穩定程度的關系[5]

三氯乙酸試劑測試結果表明（見表1），在下膠劑量小于等于0.8 g/L時，差值濁度隨著下膠劑量的增加有著顯著地降低，而在0.8～1.0 g/L時，差值濁度下降不明顯，但是在0.8 g/L的Coleman Nephlos值達到穩定程度，所以在下膠劑量為0.8 g/L時，該獼猴桃果酒達到蛋白質穩定。

2.2 加熱測試（表3、表4）

表3 80℃下加熱30 min的處理結果

由表3、表4看出，30 min加熱處理下的酒液，在0.4 g/L的下膠劑量達到蛋白質穩定，6 h加熱處理下的酒液，在1.0 g/L的下膠劑量才達到穩定。在30 min加熱測試中，0.1～0.4 g/L的下膠劑量區域內，各下膠計量之間差值濁度變化明顯，其他樣本區域變化不明顯；在6 h加熱測試中，0.1～0.8 g/L的下膠劑量區域內，各下膠計量之間差值濁度變化明顯。這也說明經30 min加熱處理后的酒液仍然存在蛋白質不穩定的潛在問題。

2.3 酒精沉淀實驗

在酒精沉淀測試結果中發現（如表5），對于所有的下膠劑量差值濁度值都較大，且變化不明顯，無法判定蛋白質穩定時的下膠劑量。

2.4 4種評估方法差值濁度與不同下膠計量對比(見圖3)

由圖3可知，通過酒精沉淀測定法處理的酒液所表現的差值濁度遠遠大于其他方法。其原因可能主要是因為所形成的懸浮顆粒，不僅僅有酒液中所析出沉淀的總蛋白質及多酚類物質，還有獼猴桃果酒中所含的多糖類物質[6]。因大部分多糖類物質與蛋白質相似，會隨著酒精含量升高而使其溶解度降低，而達到過飽和形成沉淀。所以，即使經過1.4 g/L的皂土下膠處理，使酒液中脫去大部分蛋白質，但是無法脫去多糖類物質，這也就導致了多糖類物質會在酒精沉淀測試中表現出較大的NTU差值。此外，部分多糖類物質對酒中的有機酸鹽穩定有促進作用[7]，所以可以推測，在隨著酒精度的增加，多糖物質的沉淀，酒液中有機酸鹽的溶解度降低，可能也會產生有機酸鹽結晶，使其濁度增加。

表4 80℃下加熱6 h的處理結果

表5 酒精沉淀測試結果

圖3 4種評估方法差值濁度與不同下膠計量對比圖

根據實驗結果，用50%vol的酒精濃度所測量的每個樣本之間差異性不大，無法用此推測應使用的下膠劑量。所以，在實驗設計中或許應將添加無水酒精的劑量減少。正因為所添加酒精劑量缺少相應文獻參考，再加上此法可使酒中的多糖物質沉淀，所以，此方法可能更推薦作為其他蛋白質穩定性測定方法的輔助，而不是作為主要的測量方法。

加熱測定蛋白質穩定性的方法是目前在世界范圍內最常用的方法，因為果酒在裝瓶以后，形成沉淀或者澄清度降低的主要原因為環境溫度的變化[8]。加熱測試正是對自然條件下的極端化試驗，比之其他實驗更接近自然瓶裝儲存條件。比之30 min加熱的測量方式，Bladwin[9]更加推薦使用6 h加熱的測量方法，尤其是在夏季溫度較高的地區。這是由于在氣溫較高的地區，瓶裝成品酒的儲存環境更容易產生蛋白質沉淀，所以也就需要更加嚴格的實驗手段，來測量其下膠劑量。本實驗也證實了6 h加熱測量的下膠劑量高于30 min所測量的下膠劑量。通過比較兩個加熱試驗的數據結果，發現幾乎所有的差值濁度數據在6 h的加熱處理中均大于30 min的，所以推測6 h的測量方法可能會有一定的過度測量。Nordestgaard等[10]也有同樣的相關推測，6 h的加熱處理不僅僅沉淀了葡萄酒中的蛋白性物質，其他物質也會在6 h的加熱下而產生沉淀，降低葡萄酒的澄清程度。

三氯乙酸試劑測量方法為使蛋白質化學變性法。根據Esteruelas等[6]的實驗，三氯乙酸的添加所沉淀的蛋白物質的量至少要比自然沉淀的量多出3倍，多糖類物質是自然沉淀的2倍。這個現象在本實驗中也有所體現，在同等計量的條件下，三氯乙酸試劑有可能造成過度測量下膠劑量值。

3 結語

根據實驗結果發現，以化學誘導蛋白質變性而沉析出為作用機理的三氯乙酸法有可能會造成過度測量下膠計量值。加熱測試法則比之其他實驗更接近造成自然瓶裝儲存條件中的不穩定蛋白沉淀析出的原理模式，其中6 h的加熱測試比之30 min的加熱測試更加適合于高氣溫地區使用，但也有潛在的過度測量問題。而本實驗所用的酒精測量法無法給出準確下膠計量值，只可作為輔助測量方法，不能獨立測量。

因實驗期限限制，本實驗無法給出在通常瓶儲條件下，各方法所測量的下膠計量所能保證的蛋白質穩定時間期限，且未找到相關文獻，所以有待于后續實驗加以確認。

[1]李艷敏,趙樹欣.不同酒類澄清劑的澄清機理與應用[J].中國釀造,2008(1)：1-4.

[2]POCOCK K F,SALAZAR F N,WATERS E J.The effect of bentonite fining at different stages of white winemaking on protein stability[J].Aust j grape wine res,2011,17：280-284.

[3]郭立安,閻哲,張曉楠,等.三氯乙酸對蛋白質結構穩定性的影響[J].第四軍醫大學學報,2001(22)：2113.

[4]TANFORD C.Protein denaturation[J].Advances in protein chemistry,1968,23：142.

[5]BERG H W,AKYOSHI M.Determination of protein stability in wine[J].Am j enol vitic,1961,12(3)：107-110.

[6]ESTERUELAS M,POINSAUT P,SIECZKOWSKI N,et al.comparison of methods for estimating protein stability in white wines[J].Am j enol vitic,2009,60(3)：302-311.

[7]李華.多糖對葡萄酒香氣及酒石穩定的作用[J].釀酒,2000(5)：64-66.

[8]TOLAND T M,FUGELANG K C,MULLER C J.Methods for estimating protein in stability in white wines:a comparison[J].Am j enol vitic,1996,47(1)：111-112.

[9]BALDWIN G.Practical aspects of protein stabilisation[J].The Australian grapegrower&winemaker,1992(10)：11-12.

[10]NORDESTGAARD S J,COLBY C B,CHUAN Y P,et al.Bentonite lab fining trials with white wine[C]//Chemeca 2006:knowledge and innovation:conference proceedings,2006：395-400.

中國酒業協會白酒文化國際推廣委員會9月13日在北京成立

本刊訊：據《中國酒業新聞》報道，2017年9月13日，“中國酒業協會白酒文化國際推廣委員會”成立大會在北京正式召開。會議由中國酒業協會副理事長兼秘書長宋書玉主持，中國酒業協會理事長王延才、商務部流通產業促進中心主任路政閩、商務部流通產業促進中心統計與信息化處副處長王水平、貴州茅臺酒股份有限公司銷售公司董事長王崇林、五糧液股份有限公司副總經理朱忠玉、洋河股份(蘇酒集團)副總經理張學謙、山西杏花村國貿投資有限責任公司董事長潘杰等20多位嘉賓與企業領導出席會議。

會議宣布成立中國酒業協會白酒文化國際推廣委員會。與會專家與領導還結合企業的實際情況，對中國白酒“走出去”的進展情況及經驗進行了溝通與交流，并就白酒“國際化”所面臨的問題，以及如何“走出去”提出了工作建議。

據悉，為滿足我國酒行業的發展需要，進一步加強協會組織建設，細化服務領域，提升協會服務職能，經中國酒業協會第五屆理事會第五次(擴大)會議討論通過，決定成立中國酒業協會白酒文化國際推廣委員會，組織關聯企業，推動中國白酒國際化，向世界傳播中國白酒的文化底蘊和消費方式，深入分析國際酒類消費市場，建立白酒國際技術標準體系，探索中國白酒國際化的表達方式，促進白酒在國際市場、國際領域健康持續發展。（江源薦，黃筱鸝編輯）

來源：中國酒業新聞 2017-09-14

Comparison of the Methods for Determination of the Use Level of Bentonite in Kiwi Fruit Wine

GUO Jie1,2,3,SUN Zhongli1,2,3,CAI Haiyan1,2,3,YU Hang1,2,3,ZHANG Ying1,2,3and ZHANG Yi1,2,3
(1.Sichuan Food Fermentation Industry Research and Design Institute,Chengdu,Sichuan 611130;2.Sichuan Liquor Making Bio-technology&Application Key Laboratory,Chengdu,Sichuan 611130;3.National Engineering Technology Research Center of Solid-state Brewing,Luzhou,Sichuan 646000,China)

Hazes,gloss loss and precipitate often occur in fruit wine during shelf period due to physical and chemical reasons or microbial instability.Such phenomena will badly influence the sensory quality of fruit wine and its sales.In practice,bentonite is commonly used to eliminate the haze/precipitate induced by unstable proteins.In order to avoid excessive/insufficient use of bentonite,the methods including trechloroacetic acid test(TCA),heat test,and alcohol precipitation test were adopted respectively to evaluate the clarifying effects of bentonite.Through the comparison of the three methods,we found out that the use level of bentonite measured by TCA was higher than that measured by heat test;6 h heat test was recommended in high-temperature area instead of 30 min heat test;alcohol precipitation test could not determine the use level of bentonite in the experiment.

kiwi fruit wine;protein stability;clarification;bentonite

TS262.7；TS261.4

A

1001-9286（2017）10-0047-05

10.13746/j.njkj.2017242

四川省科技廳應用基礎研究項目（2017JY0214）。

2017-09-11

郭杰（1973-），男，工程師，長期從事食品發酵工程相關工作。

孫中理（1987-），男，酒類研究學碩士，工程師，長期從事果酒、葡萄酒工藝研究工作。

優先數字出版時間：2017-09-21；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170921.1505.001.html。