HPLC-MS/MS法測定設施甜櫻桃果實中的赤霉素含量

張倩，杜海云，賈厚振，王明林，辛力

(1. 山東省果樹研究所，山東 泰安 271000；2. 山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271000；3.泰安市食品藥品檢驗檢測中心，山東 泰安 271000)

HPLC-MS/MS法測定設施甜櫻桃果實中的赤霉素含量

張倩1，2，杜海云3，賈厚振1，王明林2，辛力1

(1. 山東省果樹研究所，山東 泰安 271000；2. 山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271000；3.泰安市食品藥品檢驗檢測中心，山東 泰安 271000)

為了測定設施甜櫻桃果實中的赤霉素含量，建立了甜櫻桃果實中赤霉酸的高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)定性定量檢測方法。樣品經乙腈提取，液-液分配法進行凈化，在SIM模式下對目標物質進行定性和定量檢測，同時對設施甜櫻桃激素坐果果實中赤霉酸含量進行測定。結果表明，赤霉酸的定量限為4.03 μg·kg-1，在5.0～100.0 μg·L-1范圍內呈現良好的線性關系，相關系數R為0.9996。方法的加標回收率為87.64%～91.75%，相對標準偏差為8.9%～13.5%，5份設施甜櫻桃樣品中赤霉酸含量在21.3～71.1 μg·kg-1。本試驗建立的方法操作簡單，靈敏度和重復性好，可用于甜櫻桃果實中赤霉酸含量檢測。

設施甜櫻桃；赤霉素；高效液相色譜-串聯質譜

赤霉素(Gibberellins)是指具有赤霉烷骨架，能剌激細胞分裂和伸長的一類化合物的總稱，屬于雙萜類的植物內源激素，由四個異戊二烯單位組成，有四個環，環上各基團的變化組合形成了各種不同活性的赤霉素[1]，現已分離鑒定的有100余種。赤霉素是一種高效能的廣譜性植物生長促進物質，在落葉果樹上應用廣泛，具有誘導無子果實的形成、提高坐果率、防止落花落果、促進果實早熟和打破休眠的調控作用；還能改變一些植物雌雄比率，并使某些二年生植物在當年開花[2]。

甜櫻桃設施栽培實際生產過程中，由于設施內生長環境的改變，果實成熟期提前，營養生長期拉長，加上管理不及時，低溫傷害、授粉受精不良、落花落果、隔年結果等現象時而發生，不能保證其安全生產，嚴重影響到果農的經濟收入。因此，在有些地區，果農通過使用以赤霉素為主的復合坐果劑替代授粉，輔助果實發育。赤霉素是一種低毒的植物激素類農藥，盡管毒性不大，但是長期、大量、不合理使用也會對人類身體健康產生不利影響，目前我國尚未出臺農產品中赤霉素殘留檢測的國家標準。因此，開展農產品如水果、蔬菜中赤霉素殘留量檢測方法的研究具有重要意義[3]。

目前赤霉素的檢測方法有毛細管氣相色譜法[4]、高效液相色譜法[5]、氣質聯用法[6]、毛細管電泳-質譜聯用法[7]和酶聯免疫法[8]等，有些前處理步驟較為繁瑣，有些方法靈敏度低。本研究建立了甜櫻桃果實赤霉素含量的HPLC-MS/MS定性定量檢測方法，并測定了5份設施甜櫻桃樣品中的含量，為開展赤霉素的安全性研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1試驗材料

供試樣品采自山東某設施甜櫻桃主產區5處大棚，品種均為‘紅燈’，樹齡5～7年，管理水平中等。每棚隨機選取生長勢基本一致、結果量較多、無病蟲害的植株采樣，選取大小均一、成熟度一致的果實樣品于-20℃冷凍保存待測。

1.2儀器與試劑

電子天平，粉碎機，高速臺式冷凍離心機，旋轉蒸發儀，漩渦振蕩儀，HPLC-MS/MS(TSQ Quantum Access MAX，Thermo)。

乙腈，甲醇，乙酸乙酯，氯化鈉，98%濃硫酸，去離子化純凈水，硫酸水溶液(pH=2.5)，磷酸緩沖溶液(pH=7)。

1.3液相色譜-串聯質譜條件

色譜柱：C18柱，150 mm×4.6 mm，5 μm；流動相：0.15%乙腈-甲酸水溶液(35∶65，V/V)，流速：0.4 mL·min-1；進樣量：30 μL。

電噴霧ESI離子源，離子源溫度：350℃；反應監測模式SRM；脫溶劑溫度：300℃；毛細管電壓2.5 kV；輔助氣壓力2 kV；霧化氣、氣簾氣、輔助氣均為高純氮氣，碰撞氣為氬氣，使用前調節各氣體流量以使質譜靈敏度達到檢測要求。

1.4樣品前處理

稱取5.0 g勻漿甜櫻桃果肉樣品至50 mL離心管中，加入25 mL乙腈和2.0 g氯化鈉，渦旋震蕩1 min后4 000 r/min離心10 min,下層用乙腈重復提取兩次，合并提取液45℃旋轉蒸干。用10 mL硫酸-水(pH 2.5)溶液溶解后加20 mL乙酸乙酯，渦旋混合1 min，4 000 r/min離心10 min。乙酸乙酯層轉移到燒瓶中，重復提取兩次，合并提取液。加10 mL磷酸緩沖溶液(pH 7)于提取液中，渦旋震蕩1 min，4 000 r/min離心10 min，磷酸緩沖液層轉移到離心管中，重復提取兩次，合并磷酸緩沖溶液，用硫酸-水(1∶1)調整提取物pH 2.5，然后加20 mL乙酸乙酯，渦旋1 min，4 000 r/min離心10 min，將乙酸乙酯層轉移到燒瓶中，重復提取兩次，合并提取物，45℃旋轉蒸發近干。加甲醇-水(1∶1)10 mL，渦旋混合60 s ，經0.45 μm濾膜過濾到玻璃LC小瓶中，濾液進行HPLC-MS/MS分析。

2 結果與分析

2.1赤霉素GA3的定性和定量檢測

以保留時間和離子對進行赤霉素GA3定性檢測。樣品保留時間為3.67 min。由表1可知，樣品中選擇的3個離子豐度和標準品離子豐度比基本一致，則判斷該樣品中含有GA3。

表1 離子豐度比判定標準 (%)

圖1 GA3標準品總離子流色譜圖

圖2 GA3的3個碎片離子豐度信息

表2 GA3的HPLC-MS/MS測定參數

注：“*”定量離子。

圖1和圖2分別為GA3標準品的總離子流色譜圖和碎片離子豐度信息，可看出在所采用的色譜條件下，分析物可以得到很好的分離，未發現雜質峰的干擾。表2為GA3的LC-MS/MS測定參數。綜合圖2和表2結果，選擇m/z=239為定量離子，采用外標法定量，在5.0 ～100.0 μg·L-1范圍內，工作曲線線性方程為Y=2441.95X，線性相關系數R=0.9996，方法檢出限為1.21 μg·kg-1，定量限為4.03 μg·kg-1；選擇3個濃度做添加回收率試驗，回收率為87.64%～91.75%，相對標準偏差為8.9%～13.5%。

2.2甜櫻桃樣品的GA3含量

由表3可看出，5份設施甜櫻桃樣品中均檢出GA3，含量在21.3～71.1 μg·kg-1范圍內。

表3 5份設施甜櫻桃樣品中的GA3測定結果(n=3)

3 討論

目前歐盟、日本和加拿大等組織和國家已制定了赤霉素的最大殘留限量(Maximum Residue Limit，MRL)，歐盟規定赤霉素在58種水果上的MRL為5.0 mg·kg-1，日本規定赤霉素(GA3)在42種水果中的MRL為0.2 mg·kg-1[9，10]，我國目前尚未出臺赤霉素限量標準，對照歐盟和日本限量標準，本試驗5份甜櫻桃樣品中的赤霉素含量未超標。

近年來，水果中植物生長激素的殘留問題已引起社會的廣泛關注。據報道，廣東地區330份市售水果和蔬菜中植物生長調節劑的檢出率為55.5%，赤霉素檢出數為24個，含量在0.996 ～54.6 μg·kg-1[11]；吉林省75份市售水果赤霉素檢出率為10.67%，含量為2.77～506 μg·kg-1[12]。目前我國標準化規模種植果園所占比例較少，仍以小農散戶為主，部分果農對于植物生長調節劑認識不足，盲目增加植物生長調節劑的使用濃度和使用次數等情況還難以完全杜絕，果品存在一定的食用安全風險。因此，建議國家加強安全標準研究，完善植物生長調節劑檢測標準體系，規范果品的標準化生產。

4 結論

本試驗主要圍繞甜櫻桃果實中赤霉素GA3的檢測方法展開，目標是滿足實際樣品分析需要的前提下，建立簡便、快速、高效的植物樣品中GA3檢測方法。在此基礎上，建立了GA3的液液分配提取、凈化前處理方法和HPLC-MS/MS分析方法，并將其應用于實際甜櫻桃樣品的分析中。添加回收試驗結果表明該方法重現性好、靈敏度高，具有較高的應用價值，5份設施甜櫻桃樣品中GA3含量為21.3～71.1 μg·kg-1。

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DeterminationofGibberellinContentinSweetCherryFruitunderProtectedCultivationbyHPLC-MS/MS

Zhang Qian1,2, Du Haiyun3, Jia Houzhen1, Wang Minglin2, Xin Li1

(1.ShandongInstituteofPomology,Taian271000,China; 2.DepartmentofFoodScienceandEngineering,ShandongAgriculturalUniversity,Taian271000,China;3.TaianCenterforFoodandDrugControl,Taian271000,China)

A qualitative and quantitative determination method for gibberellin content in sweet cherry fruit was developed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The sample was extracted by acetonitrile, and purified by liquid-liquid distribution method, then the sample solution was qualitatively and quantitatively detected by HPLC-MS/MS with SIM mode. The results showed that the quantification limit for gibberellin was 4.03 μg·kg-1, the gibberellin standard showed a good linearity in the range of 5.0～100.0 μg·L-1with the correlation coefficient of 0.9996.The average recovery of gibberellin was 87.64%～91.75%, and the relative standard deviations was 8.9%～13.5%. The gibberellin contents in 5 samples were 21.3～71.1 μg·kg-1. This method was simple to operate with high sensitivity and good reproducibility. It could be used to determinate the gibberellin content in sweet cherry fruit.

Sweet cherry under protected cultivation; Gibberellin; High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)

S662.5

A

1001-4942(2017)10-0117-04

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.10.025

2017-08-29

山東省現代農業產業技術體系水果創新團隊建設項目(SDAIT-06-13);山東省農業重大應用技術創新項目——櫻桃采后商品化處理設備研制與試驗示范;泰安市科技計劃重大專項(201340629)

張倩,山東淄博人,在讀博士，從事果品貯藏加工方面的研究。E-mail:cherryzhang2006@126.com

辛力，研究員，主要從事果品貯藏保鮮與加工利用研究。E-mail：sdxinl：@foxmail.com