抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊提取物總皂苷抑制心肌細胞凋亡的實驗研究※

鄭苗苗 王 芳 黃 玉 宋雨婷 姚榮妹

(華北理工大學中醫學院2013級中西醫臨床專業本科生，河北 唐山 063210)

實驗研究

抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊提取物總皂苷抑制心肌細胞凋亡的實驗研究※

鄭苗苗 王 芳 黃 玉 宋雨婷 姚榮妹△

(華北理工大學中醫學院2013級中西醫臨床專業本科生，河北 唐山 063210)

目的觀察抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊提取物總皂苷抑制急性心肌損傷小鼠心肌細胞凋亡的作用及機制。方法選用BALB/c小鼠60只，雌雄各半，隨機分為6組，即正常對照組，模型組，復方丹參滴丸組，抗柯高、中、低劑量組，每組10只，正常對照組、模型組給予蒸餾水灌胃，給藥組灌胃給藥，均每日1次，連續7 d。從實驗的第6 d開始，除正常對照組外，其它組小鼠腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素3 mg/(kg·d)，連續2 d，建立急性心肌損傷模型，檢測各組小鼠心肌損傷標志物肌鈣蛋白T(cTnT)、肌鈣蛋白I(cTnI)含量以及細胞凋亡基因Bcl-2和Bax的蛋白表達。結果模型組小鼠cTnI和cTnT均降低，與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)；各給藥組cTnI和cTnT均高于模型組，復方丹參滴丸組、抗柯高、中劑量組與模型組比較差異尤為顯著(P<0.01)?？箍赂摺⒅?、低劑量組心肌細胞凋亡率明顯低于模型組，復方丹參滴丸組和抗柯高、中劑量組Bcl-2的表達與模型組比較顯著升高(P<0.01)；各給藥組Bax的表達與模型組比較明顯降低(P<0.01)。結論抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊提取物總皂苷有抑制急性心肌損傷小鼠心肌細胞凋亡的作用，通過上調心肌組織中Bcl-2的表達、下調Bax的表達，減輕心肌損傷標志物的釋放來抑制心肌細胞的凋亡。

小鼠；皂甙；藥理學；細胞凋亡；藥物作用

急性心肌損傷是由各種原發疾病引起的心肌細胞的壞死凋亡。細胞凋亡則是由基因編碼的細胞程序性死亡。異丙腎上腺素誘導急性心肌損傷可能與氧化應激、鈣超載、炎癥及脂質過氧化等有關[1]，從而發生細胞凋亡、壞死，最終導致心肌損傷。臨床上治療心肌損傷主要是運用清除氧自由基，改善微循環等藥物改善和保護心肌細胞。我們在臨床應用中發現抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊(藥物組成：西洋參、黃芪、牡丹皮、麥冬、五味子、萊菔子、王不留行)不僅對病毒性心肌炎患者有很好的治療效果，而且對心肌缺血造成的冠心病患者亦有不錯的治療效果。抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊具有益氣安神、補血養心的作用[2-3]，考慮其抗心肌缺血的作用與改善微循環和保護心肌細胞有關，因此本實驗提取該復方有效成分群(總皂苷)，觀察其是否具有抑制急性心肌損傷小鼠心肌細胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 6～7周齡Balb/c小鼠60只，雌雄各半，清潔級，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2009-0004。

1.1.2 藥物及制備 抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊由西洋參、黃芪、牡丹皮、麥冬、五味子、王不留行、萊菔子組成。中藥飲片均購于華北理工大學附屬醫院門診，經鑒定，各味飲片實物與名稱相符，質量符合《中華人民共和國藥典》標準。

抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊總皂苷制備方法：稱取10劑復方藥材(過20目篩)共1 200 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，分別加入6、8倍量80%乙醇，加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液(即含藥的乙醇)，趁熱過濾，濾液用旋轉蒸發器濃縮藥液，同時回收乙醇，濃縮液先用石油醚萃取，用梨形漏斗，用力混勻，靜置3 h分層，取上清液，3次；再用水飽和正丁醇萃取3次，取下層藥液，合并提取液，用旋轉蒸發器回收正丁醇，剩余藥液用濃縮鍋干燥，在65 ℃鼓風干燥箱中干燥至恒質量，即得總皂苷58.4 g(每g藥粉含生藥20.5 g)。提取物已請華北理工大學基礎醫學院藥學系呂立勛副教授做含量檢測，總皂苷含量為80%，符合本課題試驗要求。

復方丹參滴丸(天士力制藥集團有限公司，國藥準字Z10950111，批號：131018，規格：27 mg/丸)。

鹽酸異丙腎上腺素注射液(上海禾豐制藥有限公司，國藥準字H31021344，批號：131103，規格：2 mL∶1 mg)。

1.1.3 主要試劑 無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司，規格：500 mL/瓶)；石油醚(天津市富宇精細化工有限公司，規格：500 mL/瓶)；正丁醇(天津市博迪化工股份有限公司，規格：500 mL/瓶)；心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、肌鈣蛋白I(cTnI)測定試劑盒均購自上海百沃科貿有限公司，生產批號分別為BV-E12121503、BV-E12121501；免疫組化(SP)試劑盒、兔抗大鼠Bax(IgG)、兔抗大鼠Bcl-2(IgG)、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、多聚賴氨酸均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.1.4 主要儀器 電子調溫電熱套(天津泰斯特儀器有限公司，98-1-B)；旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器有限公司，RE-5205)；低溫離心機(上海安亭科學儀器廠，TDL-5-A)；電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司，GZX-9070 MBE)；梨形分液漏斗(上海達豐玻璃儀器廠，規格：2 000 mL，1 000 mL，500 mL)；心電圖機(上海醫用電子儀器廠，ECG-6511)；數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司，HH-6)；Bio-Rad3550型自動酶聯免疫測定儀(美國Bio-Rad公司)；石蠟切片機、染色機、脫水機(德國Leica公司)；BX53光學顯微鏡和Image-Pro Plus圖像分析系統(日本Olympus公司)；MP200A型電子天平(上海第二天平儀器廠)等。

1.2 方法

1.2.1 分組給藥 Balb/c小鼠適應性喂養7 d，生理記錄儀檢測小鼠Ⅱ導聯心電圖，ST段接近等電位線，T波無低平者入選[2]。選出60只，雌雄各半，按體質量隨機分為6組，每組10只，分別為正常對照組、模型組、復方丹參滴丸組[給藥量80 mg/(kg·d)]，按成人體質量60 kg臨床應用劑量810 mg/d計算)，抗柯高劑量組(給藥量為40 g生藥/kg·d)、中劑量組(給藥量為20 g生藥/kg·d)、低劑量組(給藥量為10 g生藥/kg·d)，正常對照組和模型組給予蒸餾水，給藥方式均為灌胃給藥，各組均每日1次，連續7 d。

1.2.2 造模 從實驗的第6 d開始，除正常對照組外，其它各組小鼠腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素3 mg/(kg·d)，連續2 d，建立急性心肌損傷模型。正常對照組腹腔注射等容積的0.9%氯化鈉注射液[4]。

1.2.3 取材 無菌操作下摘取小鼠眼球取血，4 ℃靜置后離心(800 r/min，10 min)，分離血清，放入-20 ℃冰箱儲存。隨后迅速將小鼠頸椎脫臼處死，剖開胸腔，剪取心臟，用10%多聚福爾馬林常溫下固定，石蠟包埋，常溫固定，常規切片(厚5 μm)。

1.2.4 檢測指標

1.2.4.1 肌鈣蛋白cTnI和cTnT的含量測定 cTnI(膠乳增強免疫比濁法)、cTnT(膠乳增強免疫比濁法)嚴格按試劑盒說明書操作。

1.2.4.2 免疫組織化學檢測細胞凋亡基因Bax和Bcl-2蛋白表達 切除心尖用10%福爾馬林常溫下固定，石蠟包埋，常溫固定，常規切片(厚5 μm)。采用SP二步法進行免疫組織化學染色，具體步驟按試劑盒說明書操作。陰性對照用磷酸緩沖液(PBS)替代一抗。細胞漿、細胞膜、間質中出現棕黃色顆粒，且其著色強度高于背景非特異性染色者判定為陽性。在每張切片陽性表達區隨機選擇5個高倍視野(×400)，用Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統對所選視野內的陽性信號進行圖像分析，測定各組陽性信號的積分吸光度(IA)，進行半定量分析。

2 結 果

2.1 各組心肌損傷標志物cTnT、cTnI含量比較 見表1。

組 別n給藥劑量cTnⅠcTnT正常對照組10-0．89±0．153．89±0．38模型組10-0．57±0．11?0．95±0．26?復方丹參滴丸組100．08g/(kg·d)0．76±0．26?△2．33±0．39?△抗柯高劑量組1010g/(kg·d)0．71±0．18?△2．22±0．23?△抗柯中劑量組105g/(kg·d)0．74±0．19?△2．40±0．49?△抗柯低劑量組102．5g/(kg·d)0．69±0．25?△#1．66±0．42?△#

與正常對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01；與復方丹參滴丸組比較，#P<0.01

由表1可見，模型組及各給藥組小鼠心肌組織cTnI和cTnT均降低，與正常對照組比較差異均有統計學意義(P<0.01)；各給藥組cTnI和cTnT均高于模型組，復方丹參滴丸組、抗柯高、中、低劑量組與模型組比較差異均有統計學意義(P<0.01)；復方丹參滴丸組與抗柯低劑量組比較差異有統計學意義(P<0.01)，與抗柯高、中劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組對細胞凋亡基因Bcl-2和Bax蛋白表達的影響 見表2，圖1、2。

組 別n給藥劑量Bcl-2(IA)Bax(IA)正常對照組10-18．77±2．5410．67±2．31模型組10-27．76±3．75?44．17±5．39??復方丹參滴丸組100．08g/(kg·d)42．15±5．36??△△29．65±4．28??△△抗柯高劑量組1010g/(kg·d)42．77±4．13??△△28．77±4．69??△△抗柯中劑量組105g/(kg·d)46．77±6．93??△△28．02±6．39??△△抗柯低劑量組102．5g/(kg·d)34．27±6．89??#33．27±6．84??△△

與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與復方丹參滴丸比較，#P<0.05

正常對照組(×400) 模型組(×400) 復方丹參滴丸組(×400)

抗柯高劑量組(×400) 抗柯中劑量組(×400) 抗柯低劑量組(×400)

圖1 各組大鼠心肌細胞凋亡基因子Bax蛋白表達

正常對照組(×400) 模型組(×400) 復方丹參滴丸組(×400)

抗柯高劑量組(×400) 抗柯中劑量組(×400) 抗柯低劑量組(×400)

圖2 各組大鼠心肌細胞凋亡基因子Bcl-2蛋白表達

由圖1、2可見，各組大鼠細胞漿、細胞膜、間質中均可見棕黃色顆粒，均有Bcl-2和Bax蛋白表達。模型組可見大量成片的黃色顆粒沉積物，抗柯高、中劑量組及復方丹參滴丸組顆粒沉積相對較少，正常對照組只有少量表達。由表2可見，與正常組比較，模型組Bcl-2和Bax蛋白表達均明顯增高。與模型組比較，復方丹參滴丸組和抗柯高、中劑量組Bcl-2的表達顯著升高(P<0.01)，抗柯低劑量組Bcl-2的表達升高不明顯(P>0.05)；各給藥組Bax蛋白表達與模型組比較明顯降低(P<0.01)?？箍赂摺⒅小⒌蛣┝拷M與復方丹參滴丸組Bax蛋白表達比較差異均無統計學意義(P>0.05)；抗柯高、中劑量組與復方丹參滴丸組Bcl-2蛋白表達比較差異均無統計學意義(P>0.05)?？箍碌蛣┝拷M與復方丹參滴丸組比較，Bcl-2表達水平略低(P<0.05)。

3 討 論

中醫學雖無心肌損傷這個病名，可屬中醫學心悸、怔忡、胸痹等范疇，治療首選方法為益氣通絡、活血化瘀?？箍滤_奇B病毒性心肌炎膠囊以益氣安神、補血養心為主。方中西洋參、麥冬、五味子取中藥方劑生脈飲之義，益氣養陰，補益心氣；黃芪甘溫補氣益陽；牡丹皮、王不留行味苦以開瀉，兩藥同用，以活血祛瘀通脈；萊菔子行氣降氣與西洋參相反相成共收強心除滿之效[2-3]。

心肌損傷和心肌細胞凋亡(是調控細胞穩態的機制之一)最終都可以導致心肌壞死，是不同階段心肌損傷的表達，心肌損傷是分子生物學過程，而心肌凋亡是基因程序性死亡的結果。本研究心肌損傷的檢測選用了心肌肌鈣蛋白(cTn)和細胞凋亡因子兩方面指標。肌鈣蛋白是由T、C、I 3個亞基構成，和原肌球蛋白一起通過調節鈣離子對橫紋肌動蛋白ATP酶的活性來調節肌動蛋白和肌球蛋白相互作用。肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白I是心肌損傷的血清標志物，對心肌損傷極其具有敏感性和特異性[5]，是目前最理想的診斷心肌損傷的標志物[6]。Bcl-2基因蛋白家族在細胞調亡通路中起著重要的調節作用[7]。Bcl-2家族可以分為兩大類，一類是抗凋亡的基因，主要有Bcl-2、Bcl-X1、Bcl-W、Mcl-1、CED9等，另一類是促細胞凋亡的基因，主要有Bax、Bak、Bcl-XS、Bad、Bik、Bid等。Bcl-2可與Bcl-X1、Bcl-W、Bax、Bad和Mcl-1形成同源的蛋白二聚體，而特定的蛋白二聚體可作為在細胞死亡信號通路上的分子調控點。Bcl-2可與促凋亡基因Bax形成二聚體，如果Bcl-2相對量高于Bax，則促進形成Bcl-2/Bax異二聚體，并使Bcl-2同二聚體的數量增多，抑制線粒體通透性改變，從而抑制細胞凋亡；如果Bax相對量高于Bcl-2，則形成Bax-Bax同源二聚體，Bax同二聚體數量增多，便會轉位到線粒體膜，改變線粒體膜的通透性，促使細胞色素C釋放、凋亡小體的形成、啟動Caspase酶系級聯反應，從而導致細胞凋亡[8-11]。由此可見，Bcl-2基因家族成員通過相互競爭形成同源或異源二聚體，可以調控線粒體的通透性，間接調節蛋白酶和核酸酶活性，從而雙相調節細胞凋亡[12-14]，Bcl-2和Bax蛋白的相對含量是決定細胞凋亡的分子調控點[15]。

本實驗中，正常對照組與模型組cTnI和cTnT的活性比較差異均有統計學意義(P<0.01)，說明急性心肌損傷動物模型建模成功?？箍赂?、中、低劑量組cTnI和cTnT含量均高于模型組(P<0.01)，說明該提取物對急性心肌細胞損傷有改善作用。免疫組化實驗結果顯示，抗柯高、中劑量組Bcl-2蛋白表達顯著升高，與模型組比較差異均有統計學意義(P<0.01)；抗柯高、中、低劑量組Bax蛋白表達與模型組比較均明顯降低(P<0.01)。Bcl-2表達增加可以拮抗Bax功能抑制細胞凋亡[15]，這說明該提取物能減少由于急性心肌缺血導致的心肌細胞損傷，保護細胞形態完整性，縮小心肌梗死范圍。

從整個實驗結果來看，抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊總皂苷有抑制急性心肌損傷小鼠心肌細胞凋亡的作用，可能通過上調心肌組織中Bcl-2的表達、下調Bax的表達，減輕心肌損傷標志物的釋放來抑制心肌細胞的凋亡。

[1] Garg M,Khanna D.Exploration of pharmacologicial interventions to prevent isoproterenol induced myocardial infarction in experimental models[J].Ther Adv Cardiovasc Dis,2014,8(4):155-169.

[2] 姚榮妹.抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊復方皂苷對病毒性心肌炎小鼠的治療作用[D].唐山:河北聯合大學,2011.

[3] 邢紀萍,包巨太,李志田,等.抗柯薩奇B中藥膠囊治療病毒性心肌炎的臨床療效評價[J].中國臨床藥理學與治療學,2003,8(6):701-703.

[4] 楊勇,容蓉,陳明強,等.異丙腎上腺素誘導小鼠急性心肌缺血模型的方法比較[J].中藥藥理與臨床,2010,26(5):153-155.

[5] 宋雙雙.Klotho蛋白改善應激誘導的心肌損傷的機制研究[D].重慶:第三軍醫大學,2014.

[6] Zhang M,He H,Wang ZM,et al.Diagnostic and prognostic value of minor elevated cardiac troponin levels for percutaneous coronary intervention-related myocardial injury:a prospective,single center and double-blind study[J].J Biomed Res,2014,28(2):98-107.

[7] Ronaldson KJ,Fitzgerald PB,McNeil JJ.Evolution of troponin,C-reactive protein ang eosinophil count with the onset of clozapine induced myocarditis[J].Au st N Z J Psychiatry,2015,49(5):486-487.

[8] 楊江燕.加味宮外孕Ⅱ號方對早孕大鼠滋養細胞及凋亡因子Bax、Bcl-2的影響及臨床研究[D].貴陽:貴陽中醫學院,2015.

[9] Gentilini A,Lottini B,Brogi M,et al.Evaluation ofintracellular signalling pathways in response to insulin-like growth factor 1 in apoptotic-resistant activated human hepatic stellate cells[J].Fibrogenesis Tissue Repair,2009,2(1):1-11.

[10] 陳彩蓉,王自能.人胎盤滋養細胞凋亡與其調控蛋白Bcl-2及Bax的研究[J].廣東醫學,2007,28(1):70-72.

[11] 史婷婷,白建平,梁月琴,等.芹菜素對大鼠缺血/再灌注心肌細胞凋亡及相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響[J].中國藥理學通報,2011,27(5):666-671.

[12] Kumar P,Coltas IK,Kumar B,et al.Bcl-2 protects endothelia cells against gammaradiation via a Raf-MEK-ERK-survivin signaling pathway that is independent of cytochrome c release[J].Cancer Research,2007,67(3):1193-1202.

[13] Liu ZY,Hu SP,Ji QR,et al.Sevoflurane pretreatment inhibits the myocardial apoptosis caused by hypoxia reoxygenation through AMPK pathway:An experimental study[J].Asian Pac J Trop Med,2017,10(2):148-151.

[14] 張麗娜.尼可地爾對異丙腎上腺素誘導大鼠急性心肌損傷模型中心肌保護作用及機制的研究[D].長春:吉林大學,2013.

[15] Genovese T,Esposito E,Mazzon E,et al.Absence of endogenous interleukin-10 enhances secondary inflammatory process after spinal cord compression injury in mice[J].J Neurochem，2009，108(6):1360-1372.

ExperimentalstudyontotalsaponinsextractedfromcoxsackieBviralmyocarditiscapsuleinhibitthemyocardialapoptosis

ZHENGMiaomiao*,WANGFang,HUANGYu,etal.

*2013-GradeUndergraduateStudentofChineseandWesternmedicineClinicalSpecialty,CollegeofTraditionalChineseMedicineofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Hebei,Tangshan063210

ObjectiveTo observe the effects and mechanism of the total saponins extracted from coxsackie B viral myocarditis capsule inhibit the myocardial apoptosis in mice with acute myocardial injury.Methods60 Balb/c mice with male and female half were randomly divided into 6 groups that is normal control group, model group,compound Danshen dripping pills group, high-dose total saponins group, medium-dose total saponins group and low-dose total saponins group, 10 mice in each group.The normal control group and model group were treated by distilled water,the drug groups were trented by medicine once aday,continuously for 7 d. From the 6th d of the experiment, except for the normal control group, the other five groups were injected intraperitoneally with isoprenaline hydrochloride by 3 mg/(kg·d) for 2 d to establish the model of acute myocardial injury. The contents of myocardial injury markers including troponin T (cTnT) and troponin I (cTnI), and the protein expression of cell apoptosis genes Bcl-2 and Bax were detected in each group.ResultsThe cTnI and cTnT reduced in model group, and there were statistical differences on cTnI and cTnT between the model group and normal control group (P<0.01). The cTnI and cTnT in each drug group were higher than that in model group, and the differences among compound Danshen dripping pills group,high-dose total saponins group, medium-dose total saponins group and model group were particularly significant (P<0.01). The apoptotic rate of myocardial cells in total saponins groups was significantly lower than that in model group, and the expressions of Bcl-2 in compound Danshen dripping pills group, high-dose total saponins group, medium-dose total saponins group were significantly higher than that in model group (P<0.01). The expression of Bax in each drug groups was significantly lower than that in model group (P<0.01).ConclusionTotal saponins extracted from coxsackie B viral myocarditis capsule has the effect of inhibiting the apoptosis of myocardial cells in mice with acute myocardial injury by up-regulating the expression of Bcl-2 and down-regulating the expression of Bax and decreasing the release of myocardial injury markers.

Mouse; Saponins; Pharmacology; Apoptosis; Drug effect

R-332;R284.1;R329.25

A

1002-2619(2017)09-1359-06

2017-06-26)

(本文編輯：董軍杰)

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.09.021

※ 項目來源：河北省中醫藥管理局2016年度中醫藥類科研計劃課題(編號：2016072)；華北理工大學2016年度大學生創新創業訓練計劃項目(編號：X2016068)

△ 通訊作者：華北理工大學中醫學院實驗中心，河北 唐山 063210

鄭苗苗(1994—)，女，本科在讀。研究方向：心肌病的中醫藥研究。