DNA的滾環擴增合成研究

劉淑貞 張志慶 王 芳 周 亭 王秀鳳 張國棟 劉婷婷 張洪芝

(中國石油大學(華東)理學院，山東 青島 266580)

DNA的滾環擴增合成研究

劉淑貞 張志慶＊王 芳 周 亭 王秀鳳 張國棟 劉婷婷 張洪芝

(中國石油大學(華東)理學院，山東 青島 266580)

滾環擴增(RCA)反應作為一種簡單高效的等溫酶促反應，現已發展為核酸擴增領域的新技術，其產物在組裝體搭建和多功能材料的制備方面有著廣泛的應用。本文采用瓊脂糖凝膠、紫外和透射電鏡(TEM)等手段，探究了時間、三磷酸脫氧核糖核苷(dNTPs)、酶以及引物的濃度等因素對脫氧核糖核酸(DNA)滾環擴增產物的影響。結果表明：在反應開始的前30 min，RCA產物的長度受時間的影響比較明顯；隨著dNTPs濃度的提高，RCA產物的鏈長增長，濃度也不斷提高；酶和引物的濃度對滾環擴增產物的長度沒有明顯影響，但對RCA產物濃度的影響較大，過量的酶致使RCA產物的含量顯著下降。

滾環擴增技術；核酸；dNTPs；聚合酶；引物

1 引 言

近年來，分子生物學和生物化學發展迅速，新的核酸擴增技術不斷涌現，滾環擴增(Rolling Circle Amplification，RCA)反應作為一種簡單高效的等溫酶促反應發展迅速，現已成為核酸擴增技術的新寵1。在RCA反應中，聚合酶連續不斷地將核苷酸添加到環狀模板的引物上，形成一條含有幾十、幾百甚至上千個相互串聯重復單元的單鏈 DNA。不同于聚合酶鏈式(Polymerase Chain Reaction，PCR)反應需要昂貴精密的設備和熱穩定性的聚合酶2，RCA反應可以在恒溫條件下的溶液中，固相支持物上，甚至一個復雜的生物環境中進行反應3。

滾環擴增反應作為一種強大的核酸擴增工具，其產物在許多方面都有著廣泛的應用。如Mao等4利用長度不同的RCA產物與金納米顆粒進行組裝，得到不同長度的金納米線；Willner等5將RCA產物作為酶有序裝配雜交復合材料的骨架，表現出強大的結構衍生性功能；在DNA折紙術6中，利用長度合適的RCA產物作為骨架鏈，添加互補短鏈作為腳手架鏈，制備具有不同形貌的組裝體7,8。基于RCA產物搭建的組裝體含有眾多的重復單元，這種獨特的組裝體可攜帶大量的用于檢測和治療的物質，例如熒光素、生物素、抗體、納米粒等；同時也可以通過環狀模板的設計，將RCA產物設計成含有適配子、DNA酶、墊片、內切位點等功能化序列，制備多功能材料用于生物識別、藥物遞送、生物傳感等9?20。現在，滾環擴增技術又在DNA納米粒子(DeNAno)：新型多價親和試劑21方面嶄露頭角，這更加拓寬了滾環擴增技術的應用。

控制RCA產物的長度和濃度對于后續的組裝和應用至關重要，但是鮮見較系統的研究各種合成條件對RCA產物影響的報道。因此，本文系統考察了時間、dNTPs的濃度、酶的濃度以及引物的濃度等因素對RCA產物長度和濃度的影響，并利用瓊脂糖凝膠電泳、紫外和TEM等手段對RCA產物進行表征。

表1 核苷酸序列Table 1 Sequences of oligonucleotides used in RCA reactions.

2 實驗部分

2.1 試 劑

實驗所用核苷酸序列(序列見表 1)及dNTPs(dATP，dTTP，dGTP，dCTP)均購自大連

Takara 生物技術公司(序列見表 1)，保存在?20 °C；phi29 DNA 聚合酶，購買于 Thermo Fisher Scientific，保存于?20 °C；瓊脂糖、TAE緩沖溶液、6 × 上樣緩沖液和DNA標準條帶(DNA Ladder，0.2?10 kb, 21 bands)均購買于碧云天生物技術。本文中用水皆為高純水。

2.2 合成及表征方法2.2.1 滾環擴增合成

取一定量的環狀DNA1模板于離心管中，加入一定量的引物DNA2和dNTPs，用混勻儀混勻15 s；再加入一定量的phi29 DNA聚合酶及緩沖溶液和一定量的水，混勻，在30 °C下反應一段時間，65 °C下終止反應。

2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳表征

配置1 × TAE緩沖溶液，至于水平電泳槽中，用于跑膠。取 2 μL DNA ladder加入 2 μL 6 × 上樣緩沖液和6 μL H2O混勻，再各取8 μL RCA產物和2 μL 6 × 上樣緩沖液混勻，在0.6%瓊脂糖凝膠上進行上樣，300 V恒壓下進行電泳，在凝膠成像儀下進行觀察和拍攝。本文瓊脂糖凝膠電泳所用ladder皆與圖1a中一致。

2.2.3 吸收光譜表征

首先對微量紫外分光光度計(Nanodrop，杭州奧勝 Nano-100)進行空白校準，然后取2 μL RCA產物置于Nanodrop上進行測試，保存數據和圖片，進行數據分析。

圖1 時間對RCA產物的影響Fig.1 Effect of reaction time on RCA product.(a, b) the agarose gel (0.6%) electrophoresis of RCA product at different time. bp indicates the number of bases.

2.2.4 透射電鏡表征

取10 μL RCA產物置于銅網上沉積一段時間，1%醋酸雙氧鈾染色，使用日本電子 JEM-2100高分辨透射電鏡進行表征和分析。

3 結果與討論

3.1 時間的影響

首先考察不同反應時間對 RCA產物的影響，從圖1a和1b上可明顯的發現，反應開始的前半個小時，RCA產物的長度受時間的影響比較顯著，之后隨時間的延長RCA產物的長度不再有明顯改變。早期的RCA研究者，Eric T Kool等發現時間對RCA產物的長度有著一定的影響22，而我們的實驗結果與之非常類似。膠譜圖1a上RCA產物的亮度隨著反應時間的延長而逐漸變亮，說明最開始反應階段不僅產物的長度比較短，而且濃度也比較低。反應過程中，隨著時間的延長產物的長度不斷增長，濃度也逐漸增加，直至反應達到平衡22。在反應的過程中，長時間反應的體系中有白色絮狀沉淀物析出，因為在反應初期，RCA產物首先形成一種無定形結構，隨著反應的進行，RCA產物在基質表面形成一些類晶結構，RCA產物繼續在這些類晶結構的表面上進行組裝形成花瓣結構，逐漸形成花狀球形結構。RCA產物可以通過鏈內和鏈間的雜交(DNA納米花的組裝不依賴于傳統的Watson-Crick堿基配對)進行交聯形成緊密的結構，在局部累積形成DNA納米花23。用TEM對30 min的反應產物進行掃描，觀察到有很多粘連的球狀物，尺寸在300 nm左右(如圖2a和2b)。

3.2 dNTPs的影響

在RCA體系中加入不同濃度的dNTPs，發現dNTPs的濃度對RCA產物的長度有著非常顯著的影響。從膠譜圖3a上可以明顯觀察到，隨著dNTPs濃度的增加，RCA產物的長度不斷增長；當dNTPs的濃度增加到一定值時(環狀DNA1模板：dNTPs摩爾濃度比為1 : 250)，RCA產物的長度則不再明顯增長，再增加dNTPs的濃度對RCA產物長度的影響已經不大，這可能是由phi29 DNA聚合酶的聚合擴增能力決定的24。

如圖3c所示，RCA產物的濃度隨dNTPs濃度的提高而不斷提高，而且隨著dNTPs濃度的提高，體系紫外吸收峰的位置逐漸左移靠近 260 nm(圖3b)。OD260與OD280吸光度的比值越接近1.8(OD為光密度)，代表DNA的純度越高，超過或低于 1.8都代表有別的污染物；而 OD260與OD230吸光度的比值一般在 1.8?2.2之間，表明DNA純度較好25?27。圖 3d所示，Nanodrop分析給出的 OD260/280的比值逐漸接近 1.8，OD 260/230的吸光度比值逐漸接近 2.0，說明隨著dNTPs濃度的增加，體系中RCA產物的含量逐漸提高，至環狀DNA1模板與dNTPs的摩爾濃度比為1 : 500時，體系中RCA產物的含量達到最高。在dNTPs濃度較低時，RCA反應啟動的數量受限，隨著dNTPs濃度的提高，RCA反應啟動的數量增加，體系中RCA產物的含量不斷增加，直至體系中環、引物和酶被充分利用。

3.3 酶的影響

聚合酶在整個RCA反應中有著非常重要的作用，只有在聚合酶的作用下，才能啟動整個反應。而在 RCA反應體系中，使用聚合酶的種類不同，對反應產物的影響也不盡相同28。隨著滾環擴增技術的發展，新型的聚合酶不斷地被發現使用。本文選用的phi29 DNA聚合酶，具有強大的鏈取代能力和高效的持續擴增能力，可以克服拓撲約束并有效地形成單鏈DNA29。

圖2 RCA產物的TEM圖Fig.2 TEM images of the RCA product.(a, b) TEM images of the RCA product at 30 min.

圖3 dNTPs摩爾濃度對RCA產物的影響Fig.3 Effect of dNTPs molar concentration on RCA product.(a) The agarose gel (0.6%) electrophoresis of RCA product at different concentrations of dNTPs; (b) The UV-Vis spectra of RCA product at different concentrations of dNTPs; (c) The concentration of RCA product at different concentrations of dNTPs; (d) Comparison of analytical data for OD260/280 and OD260/230 at different concentrations of dNTPs. OD ratio represents the absorbance ratio.

圖4 phi29 DNA聚合酶對RCA產物的影響Fig.4 Effect of phi29 DNA polymerase on RCA product.(a) The agarose gel (0.6%) electrophoresis of RCA product at different concentrations of phi29 DNA polymerase;(b) The UV-Vis spectra of RCA product at different concentrations of phi29 DNA polymerase;(c) Comparison of analytical data for OD260/280 and 260/230 at different concentrations of phi29 DNA polymerase.U indicates enzyme activity concentration.

實驗中加入不同濃度的phi29 DNA聚合酶進行反應，考察酶的活性濃度對RCA產物長度和濃度的影響。結果發現phi29 DNA聚合酶對RCA產物的長度并沒明顯的影響(圖4a)，但對RCA產物的濃度影響顯著(圖4b)，隨著酶濃度的提高，RCA產物的濃度先增大后減小。同時，Nanodrop分析給出的OD260/280和OD260/230吸光度比值顯示(圖 4c)，隨著酶濃度的提高，體系中 OD260/280的比值先接近1.8隨后降低，OD260/230的比值先接近2.0隨后降低，說明隨著酶濃度的增加，過量的酶影響了RCA產物的相對含量。酶濃度的增加(體系中蛋白含量逐漸增加)，在環、引物和dNTPs的起始量相同的條件下，酶的加入量越多，在反應最終結束時，RCA產物的相對含量越低。而這對后續RCA產物的提純不利，因此在RCA反應順利進行的前提下可以降低酶的濃度，這樣既可保證體系的產率，又降低了經濟成本。

3.4 引物的影響

為了考察引物對RCA產物的影響，設計相同反應時間下引物濃度不同的實驗。膠譜圖5a所示，RCA產物的長度不隨引物濃度的改變而改變，產物的濃度隨引物濃度的提高而增加。由于引物的濃度決定了酶的附著位點，也決定了RCA反應引發的數量，繼而決定了RCA產物的濃度。圖5b所示，當環狀DNA1模板與引物摩爾濃度比為1 : 1時，RCA產物的濃度達到最高，再增加引物濃度RCA產物的濃度反而有所下降。Nanodrop分析給出的OD260/280和OD260/230吸光度的比值隨引物的增加而逐漸增大(圖 5c)，至環狀 DNA1模板與引物摩爾濃度比為1 : 1時，OD260/280的比值達到1.8左右，再增加引物反而影響了RCA產物的含量。因為隨著引物的增加，酶的附著位點增多，引發的RCA反應增多，體系中RCA產物的相對含量增加；同時，附著位點的增加導致dNTPs的消耗量增加，游離的dNTPs等其它物質的濃度降低，RCA產物的相對含量也不斷提高，但引物過多時，反而由于多余的引物不能引發滾環擴增反應而游離在體系中，致使體系中RCA產物的相對含量降低。

4 結 論

滾環擴增反應是一種非常強大的等溫核酸擴增技術，不管在生物學應用方面還是自組裝方面都有著非常廣泛的應用，合理地控制RCA產物的長度，可有助于我們估算出RCA產物重復單元的數量，通過化學計量的手段較為精確的計算出需要添加的互補鏈的數量，以提高組裝的效率。本文通過以上幾個考察因素的實驗，發現在反應的前半個小時，時間對RCA產物的長度影響顯著，半小時之后隨著時間的增加變化不再明顯。dNTPs的濃度對RCA產物的長度影響較大，增加dNTPs的濃度，RCA產物的長度會不斷增長，至環狀模板:dNTPs的摩爾濃度比為1 : 250時，RCA產物的長度則不再發生改變。酶和引物濃度對RCA產物的長度沒有明顯的影響，而時間、dNTPs濃度、引物濃度和酶濃度對RCA產物的濃度和含量都有一定的影響，特別是dNTPs的濃度越高RCA產物的濃度和含量越高。因此，可以通過控制反應的時間和dNTPs的濃度獲得所需長度的RCA產物，通過合理調控酶和引物的濃度控制產物的濃度和含量，進行組裝體的搭建和功能性的材料的制備，這既有利于后續反應的進行又降低了費用。

圖5 引物對RCA產物的影響Fig.5 Effect of the primer concentration on RCA product.(a) An agarose gel (0.6%) electrophoresis of RCA product at different concentrations of primer; (b) The UV-Vis spectra of RCA product at different concentrations of primer; (c) Comparison of analytical data for 260/280 and 260/230 at different concentrations of primer.

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Study on the Synthesis of DNA via Rolling Circle Amplification

LIU Shu-Zhen ZHANG Zhi-Qing＊WANG Fang ZHOU Ting WANG Xiu-Feng ZHANG Gou-Dong LIU Ting-Ting ZHANG Hong-Zhi
(School of Science, China University of Petroleum (East China), Qingdao 266580, Shandong Province, P. R. China)

Rolling circle amplification (RCA) is a simple and efficient isothermal enzymatic reaction,which has developed as a novel technology in the field of nucleic acid amplification. Its product has a wide range of applications in the assembly and preparation of multi-functional materials. Here, we report the effects of reaction time and the concentrations of deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs),polymerase, and primer on the product of RCA. The RCA product was characterized by methods including agarose gel electrophoresis, ultraviolet spectroscopy, and transmission electron microscopy (TEM). The results showed that the length of the RCA product was significantly affected by the reaction time,especially when the reaction time was less than 30 min. With an increase of dNTPs concentrations, the concentration and chain length of the RCA product increased. However, while the concentrations of enzyme and primer had little effect on the length of the RCA product, they had a large effect on its concentration. It is worth noting that the content of the RCA product decreased significantly in the presence of excess enzyme concentration.

Rolling circle amplification; Nucleic acid; dNTPs; Polymerase; Primer

March 29, 2017; Revised: May 2, 2017; Published online: May 10, 2017.

O648

10.3866/PKU.WHXB201750105 www.whxb.pku.edu.cn

＊Corresponding author. Email: zhangzq@upc.edu.cn; Tel: +86-532-86984568.

The project was supported by the Scientific Research Foundation for Returned Overseas Chinese Scholars (2014010615), National Natural Science Foundation of China (21603276, 21303267), Natural Science Foundation of Shandong Province, China (ZR2016BL14), and Fundamental Research Funds for the Central Universities, China.

教育部留學回國人員科研啟動基金(2014010615), 國家自然科學青年基金(21603276, 21303267), 山東省自然科學基金(ZR2016BL14), 中央高校基本科研業務費資助項目

? Editorial office of Acta Physico-Chimica Sinica