不同提取劑下矮地茶高效液相色譜指紋圖譜研究

王良貴

（麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院，浙江麗水323000）

不同提取劑下矮地茶高效液相色譜指紋圖譜研究

王良貴

（麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院，浙江麗水323000）

建立不同提取劑的矮地茶高效液相色譜指紋圖譜。比較乙醇、水、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯為提取溶劑對槲皮素、山奈酚、巖白菜素等3種有效成分提取的影響，應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）構(gòu)建不同地方來源矮地茶HPLC指紋圖譜。結(jié)果表明，乙醇對槲皮素、山奈酚、巖白菜素等3種有效成分的提取效率最高，特征色譜峰明顯，在特定色譜條件下的不同產(chǎn)地矮地茶HPLC指紋圖譜相似度絕大部分大于0.8，色譜特征峰保留時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.6%，可用于矮地茶HPLC指紋圖譜的建立，為矮地茶藥材資源的質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

矮地茶；不同提取劑；反相高效液相色譜；指紋圖譜

矮地茶為紫金牛科植物紫金牛Ardisia japonica（Hornst.）B1.的全株，產(chǎn)于長江流域以南各省區(qū)林下、谷地、溪旁陰濕處，性味為辛、微苦、平，歸肺，肝經(jīng)。治濕熱黃疸、肝炎、急性腎炎、膀胱炎、肺結(jié)核盜汗、咯血、脫力勞傷、筋骨酸痛、月經(jīng)不調(diào)、副鼻竇炎等[1-2]。現(xiàn)有文獻(xiàn)表明，矮地茶中主要有效組分有香豆素類化合物（巖白菜素、異巖白菜素和三甲氧基異巖白菜素）、黃酮類化合物（槲皮素和山奈酚）、酮類化合物及多酚類化合物、三萜類和揮發(fā)油類[3]。《中國藥典》2015版規(guī)定按干燥品計算矮地茶含巖白菜素不得少于0.50%，對槲皮素和山奈酚含量未作控制要求，但其藥理作用表明，槲皮素和山奈酚也是其主要藥理成分。因此，從巖白菜素、槲皮素和山奈酚等3方面來控制矮地茶藥材質(zhì)量更合理。

中藥指紋圖譜是基于對中藥物質(zhì)群整體作用的認(rèn)識，借助于波譜和色譜等技術(shù)獲得中藥化學(xué)成分的光譜或色譜圖，是鑒別中藥真實性、評價質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性的可行模式，能用于考察中藥材產(chǎn)地、鑒別中藥產(chǎn)品的原料藥材真?zhèn)我约爸兴幧a(chǎn)過程的質(zhì)量控制[4]。目前，還未見結(jié)合指紋圖譜以巖白菜素、槲皮素和山奈酚等3方面來控制矮地茶藥材質(zhì)量的報道。

本試驗選取廣西、河北、浙江三個地區(qū)的矮地茶為樣本，采用乙醇、水、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯五種溶劑為提取劑，以巖白菜素、槲皮素、山奈酚為評價指標(biāo)，建立矮地茶藥材的RP-HPLC指紋圖譜，為該藥材地道鑒別與質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

UV-2401PC紫外-可見分光光度計（島津公司），Agilent 1100型高效液相色譜儀，超聲清洗儀（KQ-300DV，昆山市超聲儀器有限公司）；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（批號100081-200907），巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)品（批號111532-201203）（購于中國食品藥品檢定研究院），山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），甲醇、乙腈（色譜純，美國天地有限公司），其他試劑為分析純，水為超純水。矮地茶樣品分別購于河北保定、廣西河池、浙江麗水三地的藥農(nóng)，經(jīng)中藥師鑒定。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量:20 μL;柱溫：室溫；其他見表1。

表1 色譜條件

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別準(zhǔn)確稱取槲皮素、山奈酚和巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)品適量，以甲醇為溶劑制得濃度23.00，11.50，2.300，1.150，0.5750，0.2875mg·L-1槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以及 12.00，4.800，2.400，1.200，0.6000g·L-1山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液；以甲醇- 水（2：1，V/V）為溶劑制得濃度 10.42，4.170，2.083，1.042，0.5210g·L-1巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

取適量河北保定、廣西河池、浙江麗水三地產(chǎn)矮地茶全株，100℃恒溫干燥，研磨后過80目篩。取約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入20 mL提取劑，于37℃恒溫水浴中超聲提取45 min，G4砂芯漏斗過濾，取濾液，濾渣重復(fù)超聲提取，在合并濾液中加入10 mL15%鹽酸溶液，85℃下回流至無沉淀產(chǎn)生，旋蒸近干，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，以甲醇洗滌、定容、混勻，過0.45 μm有機(jī)濾膜制得供試液，供RP-HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

對適宜濃度的槲皮素、山奈酚和巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液繪制吸收曲線，得到各自最大吸收波長如表1所示。按優(yōu)化的色譜條件1.2.1，采用外標(biāo)定量法以色譜峰面積（A）與標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度（c）相關(guān)作線性回歸，結(jié)果如表2，相應(yīng)色譜圖如圖1，各色譜峰對稱性均較好（＞1），理論塔板數(shù)大于2 500，符合藥典對高效液相色譜法檢測有效成分含量的規(guī)定要求。

表2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

圖1 3種標(biāo)準(zhǔn)品RP-HPLC色譜圖

2.2 提取劑的影響

乙醇、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯和水等溶劑是中藥有效成分常用提取劑，而且槲皮素對應(yīng)的槲皮苷、山奈酚和巖白菜素在這些溶劑中也有一定溶解度，因此本試驗考察了這些提取劑對提取效果的影響，結(jié)果見表3。由表3可見，五種提取劑中乙醇提取槲皮素、山奈酚、巖白菜素的能力最強(qiáng)，甲醇次之，水的提取能力較差。比較以乙醇提取3產(chǎn)地矮地茶中槲皮素、山奈酚、巖白菜素含量可知，每個地方產(chǎn)的矮地茶中有效成分含量有所差別，就巖白菜素含量看：廣西河池產(chǎn)矮地茶含量最高，河北保定產(chǎn)矮地茶含量低。按2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定矮地茶中巖白菜素含量不得低于0.5%的要求，河北保定與浙江麗水產(chǎn)矮地茶中巖白菜素含量低于此規(guī)定。按山奈酚含量：河北保定產(chǎn)矮地茶中含量最高，浙江麗水產(chǎn)的矮地茶中含量最低。3產(chǎn)地矮地茶中槲皮素含量相差不大。不同產(chǎn)地矮地茶中有效成分含量有所差別，究其原因不僅和當(dāng)?shù)氐乃痢⒌乩須夂颦h(huán)境有關(guān)，還和藥材生長期的長短有關(guān)[5]。

表3 不同提取劑的影響

2.3 不同產(chǎn)地矮地茶HPLC指紋圖譜

在中藥的HPLC指紋圖譜中，每一個特征色譜峰代表其內(nèi)部一種化學(xué)成分，中藥的藥效是其內(nèi)部各化學(xué)成分協(xié)同作用的結(jié)果，指紋特征與藥效必然存在某種關(guān)聯(lián)。因此為揭示不同產(chǎn)地矮地茶藥效是否有差異，本試驗分別將3個不同產(chǎn)地矮地茶以5種不同提取劑按方法1.2.3制備供試品溶液，按1.2.1項下色譜條件測定，采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2004 A版）進(jìn)行分析，獲得不同產(chǎn)地矮地茶5種不同提取劑的HPLC指紋圖譜疊加圖（圖2）。圖2（a）是以槲皮素作考察指標(biāo)的RP-HPLC指紋譜圖，圖2（b）是以山奈酚作考察指標(biāo)的RP-HPLC指紋譜圖，圖2（c）是以巖白菜素為考察指標(biāo)的RP-HPLC指紋譜圖，圖中S1～S5分別代表廣西河池產(chǎn)矮地茶在乙醇、水、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯為提取劑色譜圖，同樣地，S6～S10、S11～S15分別代表浙江麗水、河北保定產(chǎn)矮地茶在乙醇、水、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯為提取劑色譜圖，1號曲線是提取的共有特征譜圖。從以上色譜圖可見，以乙醇為提取劑的色譜峰容量相對較多，對目標(biāo)成分具有良好的溶解能力，特征峰明顯，對相似度評價影響小；由于流動相的不同，3組色譜圖之間有較大差異，所以分別測定槲皮素、山奈酚和巖白菜素含量時應(yīng)選取不同流動相達(dá)到良好的分離、凈化；按夾角余弦法計算指紋圖譜圖相似度表明，在圖2（a）中S2、S6、S11、S13、S15的相似度在0.8以上，在圖2（b）中除S2、S7、S12外的其他色譜峰相似度在0.8以上，在圖2（c）中色譜峰相似度在0.9以上，比較3組圖中色譜特征峰保留時間相對偏差均小于0.6%，特征峰的精密度較高。

圖2 RP-HPLC指紋圖譜

2.4 方法的評估與討論

2.4.1 精密度試驗

取同一產(chǎn)地矮地茶樣品6份，以乙醇為提取劑按方法1.2.3分別制備供試品溶液，在1.2.1的色譜條件下進(jìn)樣分析，考察槲皮素、山奈酚和巖白菜素等目標(biāo)物的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結(jié)果：3種目標(biāo)物的保留時間基本相同，以槲皮素為參照計算得山奈酚和巖白菜素的相對峰面積RSDs值在1.20%～2.75%之間，符合指紋圖譜技術(shù)要求中有關(guān)精密度試驗的規(guī)定（RSDs＜3%）[6]，表明分析方法精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，按1.2.1色譜條件分別于0，5，10，15，20，25 h進(jìn)行測定槲皮素、山奈酚和巖白菜素，結(jié)果顯示：3種目標(biāo)物保留時間基本相同，以槲皮素為參照計算得山奈酚和巖白菜素的相對峰面積RSDs值小于3%。因此，供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 流動相的選擇

以乙腈-0.4%冰醋酸為測定槲皮素時的流動相，考察了30 min內(nèi)乙腈占不同體積比時供試液中槲皮素分離效果，乙腈占40%時槲皮素色譜峰保留時間短、分離度差，乙腈占25%的保留時間過長、分離度也差，因此選擇乙腈-0.4%冰醋酸（30:70，V/V）為測定槲皮素的流動相；同樣地優(yōu)化了測定山奈酚流動相，結(jié)果如表1。開始以不同體積比的乙腈-水測定巖白菜素流動相，但存在色譜峰不能完全分離，后改用甲醇-水為流動相，考察了甲醇-水不同體積比下的色譜峰分離效果，結(jié)果如圖3。由圖3可見隨著水的體積比增大，分離效果越好，但考慮到槲皮素等不溶于水的物質(zhì)的影響，最后選擇甲醇-水體積比35:65為測定巖白菜素流動相。

圖3 甲醇-水體積比對巖白菜素測定影響

3 結(jié)論

在本研究中，針對矮地茶中3種主要有效成分槲皮素、山奈酚、巖白菜素，綜合色譜峰峰形、峰面積、峰數(shù)目、各色譜峰分離度等情況，分別對5種提取劑（乙醇、水、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯）、流動相體系（乙腈-水、甲醇-水及加入不同濃度酸）等進(jìn)行了優(yōu)選，并從方法學(xué)上考察了建立的矮地茶HPLC指紋圖譜的分析方法，表明所建立的方法可用于矮地茶的HPLC指紋圖譜分析。

通過對3個不同產(chǎn)地矮地茶用5種提取劑所得HPLC圖譜的分析，發(fā)現(xiàn)乙醇是槲皮素、山奈酚、巖白菜素等良好的提取劑，在某一色譜分析條件下的不同產(chǎn)地矮地茶HPLC圖譜的整體峰形相差不大，按夾角余弦法計算所得指紋圖譜圖相似度絕大部分大于0.8，色譜特征峰保留時間相對偏差均小于0.6%，特征峰的精密度較高，基本符合國家藥典對指紋圖譜的要求，因此，可以用本方法監(jiān)控矮地茶藥材質(zhì)量。

［1］上海中草藥編寫組，上海常用中草藥編寫組.上海常用中草藥［M］.上海:上海科技出版社，1970.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2015:361.

［3］謝娟.矮地茶種質(zhì)資源與主要止咳-抗炎組分的研究［D］.成都:西南交通大學(xué)，2008.

［4］李強(qiáng)，杜思邈，張忠亮，等.中藥指紋圖譜技術(shù)進(jìn)展及未來發(fā)展方向展望［J］.中草藥，2013，44（22）：3095.

［5］徐昌艷，張麗艷，汪毅，等.苗藥矮地茶的 HPLC指紋圖譜研究［J］.中藥材，2014，37（9）：1570.

［6］國家食品藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于印發(fā)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》的通知［J］.中成藥，2000，22（10）：671.

A Study on HPLC Fingerprints of Ardisiae Japonicae Extracted with Different Solvents

WANGLianggui
（FacultyofEcology，Lishui University，Lishui 323000，Zhejiang）

Fingerprints of Ardisiae Japonicae developed from different extractants were established by the reverse phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC）.The effects of different extractants including ethanol，water，methanol，n-butanol and ethyl acetate on the extraction of the active ingredients，such as quercetin,kaempferol and bergenin were compared.The RP-HPLC chromatograms of Ardisiae Japonicae botained from different producing areas and different extractants were evaluated using the software Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （Version 2004A）.The results showed that the extraction efficiency of ethanol of the above active ingredients is the highest among the five extractants，and the obtained chromatograms show the characteristic peaks clearly.The similarities of RPHPLC fingerprints of Ardisiae Japonicae from different places under the specific chromatographic conditions are mostly greater than 0.8，and the relative standard deviations of the chromatographic peak retention timeare less than 0.6%.So the developed RP-HPLC can be used for the establishment of the fingerprints of Ardisiae Japonicae，which provides the scientific basis for the quality evaluation of Ardisiae Japonicae medicinal materials.

Ardisiae Japonicae；RP-HPLC；different extractants；fingerprint chromatogram

10.3969/j.issn.2095-3801.2017.05.009

R282.7

A

2095-3801（2017）05-0054-07

2017-03-27；

2017-06-01

王良貴，男，江西臨川人，講師，碩士。